专利名称：一种抗生素的筛选方法
技术领域：
本发明涉及一种抗细菌药物的筛选方法。
背景技术：
随着抗生素的广泛使用，微生物的抗药性也逐渐增强。据报道，目前分离的金黄色葡萄球菌有90％以上能产生β-内酰胺酶，能抗青霉素类药物，随着甲氧西林(methicillin)的替代使用，对甲氧西林有抗性的金黄色葡萄球菌(MRSA)迅速产生，由于各类抗药性在菌株间的不断积累和转移。至目前，只有糖肽类抗生素仍保持着对MRSA的活性。但Hiramatsu已分离到一株对万古霉素(vancomycin，属糖肽类抗生素)有抗性的MRSA菌株，虽然抗性机理还不太清楚，但一旦这种抗性扩散，对MRSA菌株的感染可能就无药可用了。
与此同时，环境污染的加剧，社会和人文的变迁使人类的免疫力不断下降，新的致病菌和条件致病菌不断出现，先前不被认为是由细菌引起的疾病，如胃痉挛、心脏病等也被发现可由细菌引起。这种微生物日益增强的抗药性和新致病菌的不断出现已经成为一个严重的社会问题，要解决这一问题，最有效的办法就是加大力度，筛选开发新的抗生素。
但是新药的开发已越来越难。究其原因，主要是缺乏新型的筛选靶标和有效的筛选方法。传统上抗生素是根据抑菌能力来筛选的，随着对抗生素作用机理的认识，逐渐发展出以必需酶、受体、离子通道等为靶标进行筛选的方法。近年来，由于人类基因组和微生物基因组工作的进展，新的靶标不断出现，再加上高通量筛选方法的建立，使新药筛选工作获得了快速的发展。
理想的靶标应该是细胞存活所必需的，在病原菌中高度保守，而在人体中不存在或差异很大的物质。目前所用的靶标绝大多数是具有明确生化功能的蛋白质，这类靶标虽然筛选相对容易，但存在着一个缺点，即对找到的抗生素，细菌可能会通过作用位点(靶标)的突变来产生抗药性。RNA作为靶标来筛选抗生素的工作目前已越来越受到关注，Echer认为就靶标而言，RNA的价值要比基因组大一倍，Steven也认为用RNA作靶标筛得的抗生素抗药性发展较慢。实际上，氨基糖苷类抗生素就可通过与核糖体16S rRNA的A位点结合而发挥作用。研究表明，编码16S rRNA的基因(rDNA)全长约1500bp，由一系列保守区和可变区间隔而成，这些保守序列在千百万年的进化过程中几乎没发生过变化，如1351～1369位(以大肠杆菌为标准)是G-菌的保守区，1401～1419位是G+菌的保守区，1167～1189位在所有细菌中都保守。链霉素与rRNA的结合位点是由16S rDNA的非保守区编码的，因此当rRNA上的第524位由鸟嘌呤(G)突变成胞嘧啶(C)时，链霉素就不能很好地与之结合，细菌就产生了对链霉素的抗性。如果以rRNA的保守序列作靶标去筛选抗生素，将会大大减小这类抗药性的产生。
RNA除了可与一些小分子物质结合外，还能与蛋白质(RNA-bindingproteins)、反义寡核苷酸(antisense oligonucleotides)结合。不过大多数蛋白质和反义寡核苷酸分子量较大，很难进入病原微生物的细胞内，如果能从微生物代谢产物中筛选到可与RNA特异结合的多肽类物质，将有可能成为具有应用前景的抗生素。
除了蛋白质和RNA外，DNA在细菌的生命活动过程中也扮演着非常重要的角色。但用DNA作靶标筛选抗生素的工作还没有受到重视，主要原因是目前发现的作用于DNA的抗生素大都缺乏选择毒性。但DNA作为靶标的潜力值得关注。研究表明某些物质可与DNA发生特异性结合，如大肠杆菌乳糖操纵子中的阻遏蛋白可识别一段26bp的DNA序列并与之结合。Carrasco证实抗癌抗生素AT2433-B1能与特定DNA序列相识别。Charles发现卡那霉素和新霉素的异硫氰酸盐可共价连接于特定的DNA片段上。因此，如果以rDNA的保守区为靶标去筛选能与之发生特异性结合的物质，有可能开发出能专一性地抑制细菌生长而不影响人体DNA功能的抗生素。
由于rRNA与rDNA的负链除了U取代T外，其它都一样，因此，以其保守序列为靶标筛选得到的抗生物质进入细胞后，除能与rRNA结合影响核糖体的组装，破坏核糖体的功能外，还有可能与DNA结合抑制复制的进行；而且这些作为靶标的区域在细菌中高度保守，因作用靶标变异而产生的抗药性几乎不太可能发生。由此而筛选得到的抗生素不仅在医疗领域，而且在食品保鲜、物品防腐等方面具有巨大的应用前景。
发明内容
本发明所解决的技术问题是提供了一种基于原核生物核糖体核酸为靶标的抗细菌药物筛选方法，建立了基于细菌核糖体核酸，特别是其中的保守序列为靶标的新型抗生素筛选模型。
本发明主要包括以下步骤1)合成致病细菌核糖体核酸(包括16S rRNA、16S rDNA、23S rRNA或23S rDNA全序列中至少含18个碱基的序列，特别是其中的保守片段)作为抗生素筛选的靶标，将上述靶标固定在载体A上；2)将核酸随机片段(含8～12个碱基)固定在载体B上；3)将待筛选物质浓缩后溶解于缓冲液中；4)用固定有核酸随机片段的载体B吸附去除待筛选物浓缩液中的非特异性结合物；5)用固定有靶标的载体A捕获待筛选物浓缩液中的特异性结合物；6)用洗脱液洗下结合在靶标上的特异性结合物，进行抑菌试验；7)对有抑菌能力的特异性结合物进行分离纯化，得到抗生素候选物。
核糖体核酸及核酸随机片段的合成为一项成熟技术，本发明所需的细菌核糖体核酸及核酸随机片段可以在研究室合成，也可以向生物技术公司购买。
本发明可以以某一种特定致病菌的16S rRNA或23S rRNA为靶标筛选能与之特异结合的专一性抗生素，如以耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的16S rRNA或23S rRNA为靶标筛选对这类致病菌有特异抑制作用的专性抗生素；也可以以某一类致病菌共有的rRNA保守序列为靶标筛选广谱抗生素，这些保守序列可以来自16S rRNA(或16S rDNA)，也可以来自23S rRNA(23SrDNA)。如来自16S rRNA在所有细菌中都保守的AGAGUUUGAUCCUGGCUCAG、GGUUACCUUGUUACGACUU和AGGAGGUGAUCCAACCGCA；或是来自16S rRNA在革兰氏阳性致病菌中保守的如GGCUUCUGCUGUUACAAA，或是来自16S rRNA在革兰氏阴性致病菌中保守的如CCCGGCUUCGUAUUCACC，或是来自16S rRNA只在某一类病原菌如立克次氏体中保守的序列如UAAUGCCGGGAACUAUAAGAA；或是来自23S rRNA在所有细菌中都保守的序列如UUCGCCUUUCCCUCACGGUACU等。
本发明采用的细菌核糖体核酸序列可以是人工合成的保守片段(至少含18个碱基)，或是以27F，1492R为引物经聚合酶链反应(PCR)合成的16S rDNA全序列，或是以其他引物经PCR合成的16S rDNA部分序列，也可以是来自23S rRNA的序列。
本发明采用的靶标固定化材料可以是在southern blotting中常用的硝酸纤维素膜、PVDF膜或尼龙膜，可以是在基因芯片中常用的玻璃或硅片，可以是核酸亲和层析中常用的纤维素或Sepharose，也可以是其他能吸附核酸的材料，如琼脂糖，羟基磷灰石，聚丙烯等。
本发明所使用的随机片段由A、T(U)、G、C四种碱基随机组装而成，长度约为10个碱基。
本发明将上述核酸随机片段固定在载体B上，先用这些随机片段尽可能去除发酵液中的非特异性结合物；也可以用动物细胞DNA代替核酸随机片段去除非特异性结合物。
本发明所述的待筛选物质可以是微生物发酵液，也可以是动植物组织提取液或动植物细胞培养液。这些待筛选物质应先用萃取、蒸发等常规方法浓缩，一方面提高有效物质浓度，另一方面去除大分子杂质，破坏DNA酶和RNA酶以防靶标降解。然后将浓缩物溶于适量磷酸缓冲液中，离心去除水不溶物(作为抗生素，应有足够水溶性)后制成待筛选物浓缩液。
本发明对潜在抗生素的捕获可采用滤膜过滤、液相“杂交”、亲和结合等方法。所谓滤膜过滤法就是将靶标固定在滤膜上，让待筛选物浓缩液流经滤膜，特异性结合物就留在膜上，不能与靶标结合的物质就被过滤下来，就象普通的过滤一样；液相“杂交”法就是直接将靶标与待筛选物浓缩液在一定条件下保温，让潜在抗生素与靶标结合，然后将靶标-潜在抗生素结合物分离出来的过程；亲和结合法就是先将靶标结合在特定的载体如纤维素颗粒上，然后与待筛选物浓缩液保温，让潜在抗生素与靶标亲和结合的过程，就象mRNA的亲和层析一样。
本发明所使用的洗脱液可以是不同离子强度的溶液，也可以是不同pH的溶液，必要时可用核酸酶将靶标破坏，让结合物释放。
采用本发明可以根据某一种致病细菌特有的核糖体核酸序列筛选出能特异抑制该菌生长的专一性抗生素，或根据致病细菌共有的核糖体核酸保守序列筛选出能抑制各类细菌生长的广谱抗生素，从而使大规模、高通量筛选抗药性发展慢的新型抗生素成为可能。
具体实施例方式
实施例1滤膜过滤法筛选针对MRSA的专一性抗生素的方法包括以下步骤1.培养耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)，用DNA提取试剂盒提取其总DNA；2.人工合成16S rDNA的引物27F(5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3’)和1492R(5’GGTTACCTTGTTACGACTU 3’)；3.PCR合成MRSA的16S rDNA全序列；具体操作条件如下0.2mmol/L(each)dNTP，400nmol/L(each)引物，5mmol/L MgCl2和1U Taqplus，总体积50μL。反应条件94℃变性3分钟后进行30个循环的PCR反应，每一循环包括94℃变性1分钟，55℃退火45秒，72℃延伸1分钟。30个循环结束后，再在72℃延伸10分钟。PCR产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳分离后，用PCR纯化试剂盒纯化；4.将纯化的MRSA的16S rDNA全序列在95℃水浴中加热5分钟后快速放在冰浴中处理5分钟，然后将变性的16S rDNA均匀地加到硝酸纤维素膜上，吸附固定30分钟，真空抽干，紫外线照射30秒，制成固定有靶标的滤膜A，备用；5.用核酸合成仪人工合成含12个碱基的核酸随机片段，均匀地加到尼龙膜上，吸附固定30分钟，真空抽干，紫外线照射30秒。制成固定有核酸随机片段的滤膜B，备用；6.筛选具有抗菌活性的微生物菌株，摇瓶发酵，收集发酵液，用乙酸乙酯抽提，收集有机相，在旋转蒸发仪上蒸去乙酸乙酯，残留物用两倍体积的pH7.0磷酸缓冲液溶解，离心去除沉淀，将上清液加至布氏漏斗上，漏斗中预先放有作为“滤纸”的上述固定有核酸随机片段的尼龙膜(滤膜B)，以去除非特异性结合物，滤液缓慢流经上述固定有靶标的硝酸纤维素膜(滤膜A)上，让特异性结合物与靶标充分结合；7.用酸性洗脱液(0.1mol/L甘氨酸-HCl缓冲液，pH3.0)洗涤，将洗下的特异性结合物回收(作为药物，结合力越强越好，因此可先用pH6.8的磷酸缓冲液洗掉结合力较弱的成分)；8.进行抗菌抑菌试验并分离纯化具有抗菌活性的相关化合物；9.对纯化的抗生素进行化学结构的确定。
实施例2液相“杂交”试验筛选广谱抗菌药物的方法包括以下步骤1.委托有关生物技术公司合成致病细菌23S rRNA第6区段的保守片段GCGAUUUCCGAACGGGGAAACCC；2.筛选具有抗菌活性的微生物菌株，摇瓶发酵，将发酵产物过滤，滤液用乙酸乙酯抽提，收集有机相，在旋转蒸发仪上蒸去乙酸乙酯，残留物用两倍体积的pH7.0磷酸缓冲液溶解，5000g离心10分钟，去除沉淀，将上清液转移至一干净培养皿中；3.委托有关生物技术公司合成含10个碱基的核酸随机片段，加至上述培养皿中，30℃恒温摇床上缓慢振摇30分钟；4.将一张DE-81滤膜(直径比培养皿内径略小)浸至培养皿中，30℃恒温摇床上缓慢振摇30分钟，由于DE-81滤膜能强烈吸附并滞留核酸，那些能与核酸随机结合的物质也一同被去除；5.将合成的23S rRNA第6区段的保守序列加至培养皿中，30℃恒温摇床上缓慢振摇60分钟；6.将一张新的干净DE-81滤膜(直径比培养皿内径略小)浸至培养皿中，30℃恒温摇床上缓慢振摇30分钟，那些能与靶标寡核苷酸片段特异结合的物质被转移至膜上；7.用高离子强度洗脱液(1mol/L NaCl，0.1mol/L EDTA，20mmol/L Tris，pH 8.0)洗涤上述膜，将特异性结合物回收；8.进行抗菌抑菌试验，判断抗菌活性；9.大规模分离纯化相关物质，确定该物质结构。
实施例3亲和结合试验筛选广谱抗菌药物的方法包括以下步骤1.人工合成致病细菌16S rRNA的保守序列GCAUCAGGUCAAGUCAUC；2.将合成的保守片段溶于适量去离子水中，使成0.1mmol/L的溶液，然后均匀地加到尼龙膜A上，吸附固定30分钟，室温干燥，80℃真空炉干烤30分钟，制成固定有靶标的滤膜A，备用；3.人工合成长度为8个碱基的核酸随机片段，同上法溶解后均匀地加到尼龙膜B上，吸附固定30分钟，室温干燥，80℃真空炉干烤30分钟，制成固定有核酸随机片段的滤膜B，备用；4.筛选具有抗菌活性的中草药，粉碎后用80％的丙酮水溶液浸提，普通滤纸过滤，滤液加至旋转蒸发仪中，蒸去丙酮，得浸提浓缩液；5.将滤膜B放于一干净培养皿中，加入浸提浓缩液，30℃摇床缓慢振摇30分钟，去滤膜B；6.将滤膜A放于培养皿中，30℃摇床缓慢振摇60分钟，取滤膜A；7.用pH8.0，6.0，5.0，4.0的Tris-HCl洗脱液分段洗涤，将滤膜A上的特异性结合物回收；8.进一步进行抗菌抑菌试验并对收集物进行分离纯化。
实施例4亲和结合试验筛选抗破伤风梭状芽孢杆菌的专一性抗生素的方法包括以下步骤1.人工合成破伤风梭状芽孢杆菌16S rRNA的特异性片段ACCCUAGAGCAUAAGGGGCAUGAUGAUUUG；2.将合成的片段连接到纤维素上(可请有关生物技术公司加工)，制成靶标-纤维素亲和层析用的固定相，备用；3.用酚氯仿抽提法提取小牛胸腺DNA，用碱变性液(终浓度为0.4mol/LNaOH，40mmol/LEDTA)室温处理10分钟使DNA变性后，均匀地加到硝酸纤维素膜上，吸附固定30分钟，室温干燥，80℃真空炉干烤30分钟，制成固定有动物细胞DNA的滤膜，备用；
4.筛选具有抗菌活性的微生物菌株，摇瓶发酵，收集并浓缩发酵液，溶于适量pH7.0的磷酸缓冲液中，过滤；5.将滤膜用pH7.0的磷酸缓冲液漂洗后，放于一干净培养皿中，加入上述滤液，30℃摇床缓慢振摇30分钟，让能与动物细胞DNA结合的物质吸附到滤膜上，去滤膜；6.在滤液中加入靶标-纤维素颗粒(固定相)，混合均匀，30℃摇床缓慢振摇30分钟；7.将上述混合物加至层析柱上，弃去未被结合的溶液；8.以不同离子强度的洗脱缓冲液(分别含0.2，0.6，1.0和1.4mol/LNaCl的Tris-HCl缓冲液，pH7.0)作流动相分段层析，收集层析液；9.进行抗菌抑菌试验；10.对有抗菌活性的成分进行大规模分离纯化，确定物质结构。
权利要求
1.一种抗生素的筛选方法，其特征在于该方法包括以下步骤1)以细菌核糖体核酸作为靶标，将其固定在载体A上；2)将核酸随机片段固定在载体B上；3)将待筛选物质浓缩后溶解于缓冲液中；4)用固定有核酸随机片段的载体B吸附去除待筛选物浓缩液中的非特异性结合物；5)用固定有靶标的载体A捕获待筛选物浓缩液中的特异性结合物；6)用洗脱液洗下结合在靶标上的特异性结合物，进行抑菌试验；7)对有抑菌能力的特异性结合物进行分离纯化，得到抗生素候选物。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的细菌核糖体核酸为16S rRNA、16S rDNA、23S rRNA和23S rDNA中的一种。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的细菌核糖体核酸为全序列中至少含18个碱基的序列。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的核酸随机片段长度为8～12个碱基。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的载体为硝酸纤维素膜、尼龙膜、玻璃、硅片、纤维素、Sepharose、琼脂糖、羟基磷灰石、聚丙烯中的一种。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的缓冲液为中性磷酸缓冲液。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的特异性结合物的捕获可采用滤膜过滤法、液相“杂交”法、亲和结合法中的一种。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的洗脱液为不同离子强度的溶液。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的洗脱液为不同pH值的溶液。
全文摘要
本发明涉及一种抗细菌药物的筛选方法。传统上抗生素是根据抑菌能力来筛选的。本发明的包括以下步骤合成致病细菌核糖体核酸作为抗生素筛选的靶标固定在载体A上；将核酸随机片段固定在载体B上；将待筛选物质溶解于缓冲液中；用固定有核酸随机片段的载体B吸附去除待筛选物浓缩液中的非特异性结合物；用固定有靶标的载体A捕获待筛选物浓缩液中的特异性结合物；用洗脱液洗下结合在靶标上的特异性结合物，进行抑菌试验；对有抑菌能力的特异性结合物进行分离纯化。采用本发明方法可以筛选出能特异抑制某菌生长的专一性抗生素，也可以筛选出能抑制各类细菌生长的广谱抗生素。
文档编号C12Q1/18GK1557965SQ20041001602
公开日2004年12月29日 申请日期2004年1月18日 优先权日2004年1月18日
发明者吴根福 申请人:浙江大学