专利名称：对大肠杆菌o58和痢疾志贺氏菌5型的o－抗原特异的核苷酸的制作方法
技术领域：
本发明涉及大肠杆菌O58(Escherichia coli O58)和痢疾志贺氏菌5型(Shigella bodyii 5)中控制O-抗原合成的基因簇的核苷酸全序列，特别是涉及大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型中控制O-抗原合成的基因簇中的寡核苷酸，可利用这些对O-抗原特异的寡核苷酸快速、准确地检测人体及环境中的大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型并鉴定这些致病菌中的O-抗原。
背景技术：
志贺氏菌是随着人类进化而发展起来的致病菌，能侵袭结肠膜上皮细胞，导致自限性化脓性感染病灶，引起人类的细菌性痢疾。人类对志贺氏菌有较高的敏感性，只需要少于十个菌就可以引起人的感染，儿童和成人易感染，特别是儿童，易引起急性中毒性痢疾，而志贺氏菌的O-抗原是志贺氏菌引起疾病的主要原因之一。
大肠杆菌O58也是致病菌，它属于STEC(Shiga toxin-producingEscherichia coli)，即产Shiga毒素的大肠杆菌，它是引起牲畜疾病的重要的病原菌[Steven P et al(2001)“Virulence Properties and Serotypesof Shiga Toxin-Producing Escherichia coli from Healthy AustralianSlaughter-Age Sheep”.Journal of Clinical Microbiology，Vol.39，No.5，2017-2021]；此外在中东和北非也发现大肠杆菌O58能导致三岁以下儿童的腹泻[Leonard F.Perusk I et al(1999)“Phenotypic Diversity ofEnterotoxigenic Escherichia coli Strains from a Community-Based Studyof Pediatric Diarrhea in Periurban Egypt”JOURNAL OF CLINICALMICROBIOLOGY.2974 2978 Vol.37，No.9]。因此对大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型的检测是重要的，需要一个可以快速、准确地检测大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型的方法。
位于大肠杆菌表面的脂多糖是大肠杆菌致病的诱因，而O-抗原是脂多糖最外层结构，是免疫系统识别的目标和噬菌体吸附的位点。O-抗原的缺失会造成许多病原体的血清敏感，或者严重削弱病原体的毒力[Frank etal(1987)“The function of antibody and complement in the lysis ofbacteria”.Rev Infect Dis 1771750-1753.Pluschke G et al“Role ofthe capsule and the O-antigen in resistance of O18K1Escherichia colito complement-mediated king”.J Bacteriol 42907-913]。大肠杆菌是一个种，种内的菌株一般通过O-抗原和H-抗原(有时通过K-抗原)来鉴定。其中O-抗原具有高度多样性，大肠杆菌有166种不同的O-抗原，O-抗原的变化可能是大肠杆菌的起源和维持其多样性的主要原因[Reeves，P.R(1992)“Variation in antigens，niche specific selection and bacterialpopulations”.FEMS Microbiol.Lett，100509-516]。
O-抗原是革兰氏阴性细菌脂多糖中的O特异性多糖成分，它由许多重复的寡糖单位组成。O-抗原的合成过程研究得较清楚先由糖基转移酶将核苷二磷酸单糖转移到一个固定在细胞内膜的脂分子上，然后在内膜的内侧合成寡糖单位，O-抗原的寡糖单位再通过o-抗原转运酶被转移到内膜外侧，而后通过聚合酶聚合成多糖，再被连接到一个糖脂分子上形成脂多糖分子[Whitfield，C.(1995)“Biosynthesis of lipopolysaccharide Oantigens”.Trends in Microbiology.3178-185；Schnaitman，C.A.andJ.D.Klena.(1993)“Genetics of lipopolysaccharide biosynthesis inentericbacteria”.Microbiological Reviews，57(3)655-682]。编码负责O-抗原合成的所有酶分子的基因一般在染色体上相邻排列，形成一个基因簇[Reeves，P.R.，et al.(1996)“Bacterial polysaccharide synthesis and genenomenclature”Trends in Microbiology，4495-503]。在大肠杆菌、志贺氏菌和沙门氏菌中，O-抗原基因簇位于galF和gnd基因之间[Lei Wang.et al(2001)“Sequence analysis of four Shigella boydii O-antigen lociimplicationfor Escherichia coli and Shigella relationships”.Infection andImmunity，116923-6930；Lei Wang and Peter Reeves(2000)“The Escherichiacoli O111 and Salmonella enterica O35 gene clustersgene clusters encodingthe same colitose-containing O antigen are highly conserved”.Journal ofBacteriology.1825256-5261]。O-抗原基因簇含有三类基因糖合成路径基因，糖基转移酶基因，寡糖单位处理基因，其中糖合成路径基因编码的酶合成O-抗原所需的核苷二磷酸单糖；糖基转移酶基因编码的酶将核苷二磷酸单糖及其它分子转到单糖上从而使单糖聚合成寡糖单位；寡糖单位处理基因包括o-抗原转运酶基因和聚合酶基因，它们将寡糖单位转移到细菌内膜外侧，再聚合成多糖。糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因只存在于携带这些基因的基因簇里。O-抗原中单糖的不同，单糖间联结键的不同和寡糖单位之间联结键的不同构成了O-抗原的多样性，而单糖的组成、单糖间的联结键及寡糖单位之间的联结键是由O-抗原基因簇中的基因控制着，所以O-抗原基因簇决定了O-抗原的合成，也决定了O-抗原的多样性。
因为O-抗原是极强的抗原，是大肠杆菌重要的致病因素之一，同时它又具有极强的多样性，这启示我们能研究一种快速、准确地检测大肠杆菌及其O-抗原的特异性好、灵敏度高的方法。以表面多糖为目标的血清学免疫反应自上世纪30年代以来一直被用于对细菌的分型和鉴定，是鉴定致病菌的唯一的手段。这种诊断方法需要大量的抗血清，而抗血清一般种类不全，数量不足，大量的抗血清在制备和储存中也存在一些困难。另一方面此法耗时长、灵敏度低、漏检率高、准确性差，所以，现在普遍认为这种传统的血清学检测方法将为现代分子生物学方法取代。1993年，Luk，J.M.C et.al用沙门氏菌(S.enterica)O-抗原基因簇的特异核苷酸序列通过PCR方法鉴定了沙门氏菌的O-抗原[Luk，J.M.C.et.al.(1993)“Selective amplification ofabequose and paratose synthase genes(rfb)by polymerase chain reactionfor identification of S.enterica major serogroups(A，B，C2，andD)”，J.Clin.Microbiol.312118-2123]。Luk，et.al的方法是将相应于沙门氏菌血清型E1，D1，A，B和C2的O-抗原内的CDP-阿比可糖和CDP-泰威糖的合成基因的核苷酸序列排列后得到对不同血清型的沙门氏菌特异的寡核苷酸。1996年，Paton，A.W et.al用对E.coli O111的O-抗原特异的源于wbdI基因的寡核苷酸鉴定了一株产毒素的E.coli O111的血清型[“Molecularmicrobiological investigation of an outbreak of Hemolytic-UremicSyndrome caused by dry fermented sausage contaminated with Shiga-liketoxin producing Escherichia coli”.J.Clin.Microbiol.341622-1627]，但是后来的研究表明Paton，A.W et.al的用源于wbdI基因的寡核苷酸鉴定E.coli O111的血清型的方法有假阳性结果出现。Bastin D.A.and Reeves，P.R.认为，这是由于wbdI基因是一个推测的糖合成路径基因[Bastin D.A.andReeves，P.R.(1995)“Sequence and analysis of the O antigen gene(rfb)cluster of Escherichia coli O111”.Gene 16417-23]，而在其它细菌的O-抗原的结构中也可能有这个糖，所以糖合成路径基因对于O-抗原并不是高度特异的。
大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型的O-抗原的结构已知。它们的结构是完全一样的，它是由4个糖组成的重复单位[B.A.Dmitriev.V.L et al(1977)“Somatic antigens of Shigella.The strucuture of the specificpolysaccharide chain of Shigella dysenteriae type 5lipopolysaccharide”.European Journal of Biochemistry，Vol 78，381-387].[B.A.Dmitriev.V.L et al(1977)，European Journal ofBiochemistry，Vol 79，111-115].
发明内容
本发明的目的是提供了一种对大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型的O-抗原特异的核苷酸。它是大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型的O-抗原基因簇中的核苷酸，是源于o-抗原转运酶基因、聚合酶基因及糖基转移酶基因的特异的核苷酸。
本发明的一个目的是提供了大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型的O-抗原基因簇的全长核苷酸序列。
本发明的次一目的是提供了构成大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型的O-抗原基因簇的基因转运酶基因即wzx基因或与wzx有相似功能的基因；聚合酶基因即wzy基因或与wzy有相似功能的基因；糖基转移酶基因，包括orf6、orf9、orf11、orf12基因；糖合成路径基因，包括rmlB、rmlD、rmlA、rmlC、manB、manC、orf7、orf8基因。它们在O-抗原基因簇中的起始位置和终止位置及核苷酸序列都列在表4中。
本发明的又一目的是提供了寡核苷酸，它们分别源于大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型的O-抗原基因簇中编码转运酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因；源于编码聚合酶的基因，包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因；源于编码糖基转移酶的基因，包括orf6、orf9、orf11、orf12基因。它们是上述基因内的寡核苷酸，长度在10-20nt；它们对大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型的O-抗原是特异的；尤其是表1中列出的源于编码转运酶的基因和聚合酶的基因的寡核苷酸，它们对大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型的O-抗原是高度特异的，而且这些寡核苷酸还可重新组合，组合后的寡核苷酸对大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型的O-抗原也是高度特异的。
本发明的另一目的是提供的上述寡核苷酸可作为引物用于核酸扩增反应，或者作为探针用于杂交反应，或者用于制造基因芯片或微阵列，从而通过这些方法来检测和鉴定大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型的O-抗原及检测和鉴定大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型。
本发明的再一目的是提供了分离大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型的O-抗原基因簇的全序列的方法。按照本方法操作可以获得其他细菌的O-抗原基因簇的全序列，也可以获得编码其他多糖抗原的细菌的基因簇的全序列。
本发明的目的是由以下技术方案实现的。
本发明对大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，其是如SEQ ID NO1所示的分离的大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型的核苷酸，全长17769个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO1的大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型的核苷酸。
前述的对大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，其中包括命名为rmlB，rmlD，rmlA，rmlC，wzx，orf6，orf7，orf8，orf9，wzy，orf11，orf12，manC，manB的14个基因组成，都位于galF基因和gnd基因之间。
前述的对大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，所述的基因包括转运酶基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因；聚合酶基因，包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因；糖基转移酶基因，包括orf6、orf9、orf11、orf12基因。其中所述的转运酶基因是SEQ ID NO1中的4728至5915碱基的核苷酸；所述的聚合酶基因是SEQ IDNO1中的9803至11134碱基的核苷酸；所述的orf6基因是SEQ ID NO1中的5905至6513碱基的核苷酸；orf9基因是SEQ ID NO1中的8977至9798碱基的核苷酸；orf11基因是SEQ ID NO1中的11127至12251碱基的核苷酸；orf12基因是SEQ ID NO1中的12333至13442碱基的核苷酸。
前述的对大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，其源于所述的wzx基因或wzy基因或糖基转移酶基因的寡核苷酸；以及它们的混合或它们的重组。
前述的对大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型的O-抗原高度特异的核苷酸，其特征在于，所述的源于wzx基因的寡核苷酸对是SEQ ID NO1中的4967至4984碱基的核苷酸和5336至5353碱基的核苷酸，SEQ ID NO1中的5341至5358碱基的核苷酸和5839至5856碱基的核苷酸；所述的源于wzy基因的寡核苷酸对是SEQ ID NO1中的10475至10492碱基的核苷酸和11855至10872碱基的核苷酸，SEQ ID NO1中的10110至10127碱基的核苷酸和10932至10949碱基的核苷酸。
前述的对大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型的O-抗原特异的核苷酸在检测表达O-抗原的细菌、鉴定细菌的O-抗原和细菌的其它多糖抗原的应用。
前述的对大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型的O-抗原特异的核苷酸的重组分子，在通过插入表达而提供表达大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型的O-抗原，以及制备细菌疫苗中的应用。
前述的对大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型的O-抗原特异的核苷酸的应用，其特征在于，它作为引物用于PCR、作为探针用于杂交反应与荧光检测、或者用于制造基因芯片或微阵列，供检测细菌。
前述的对大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5的O-抗原特异的核苷酸的分离方法，其特征在于，包括下述步骤(1)基因组的提取在培养基中培养大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型，离心收集细胞；得到的基因组DNA通过琼脂糖凝胶电泳检测；(2)通过PCR扩增大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型中的O-抗原基因簇以大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇，将得到的PCR产物，用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性，合并该long PCR产物，并用DNA纯化试剂盒纯化PCR产物；(3)构建O-抗原基因簇文库将Long PCR纯化产物应用鸟枪法构建O-抗原基因簇文库；(4)对文库中的克隆测序从文库中挑选插入片段在1kb以上的克隆用实验室常用的DNA自动测序仪对克隆中的插入片段进行测序，序列达到100％的覆盖率，从而获得O-抗原基因簇的所有序列；(5)核苷酸序列的拼接及分析应用生物信息学软件拼接和编辑所有的序列，从而得到大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列；(6)特异基因的筛选针对大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy基因设计引物；在每个基因内各设计了两对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方，以确保其特异性；用这些引物以166株大肠杆菌和43株志贺氏菌的基因组为模板进行PCR，确定wzx、wzy基因对大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型的O-抗原的高度特异性；(7)引物灵敏度的检测培养大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5，细菌计数后分别将5×103，5×102，5×101，5个和0个活菌加入到一定量的某种待检测物中，混入细菌的待检测物作为检测用样品，将样品加入LB培养基，取一些与样品混合过的LB培养基过滤，将过滤液进行培养，从培养好的菌液中取数毫升处理后作为PCR模板用寡核苷酸进行PCR反应，检测其对大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5的灵敏度。
前述的对大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型的O-抗原特异的核苷酸的分离方法，其特征在于，包括下述步骤(1)基因组的提取在5mL的LB培养基中37℃过夜培养大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型，离心收集细胞。用500ul 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul0.4M EDTA重悬细胞，37℃温育20分钟，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶继续保温20分钟。之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃温育2小时，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65℃温育30分钟。加等体积酚抽提混合物，取上清液再用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提两次，取上清液，再用等体积的乙醚抽提以除去残余的酚，上清液用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，最后将DNA重悬于30ul TE中，基因组DNA通过0.4％的琼脂糖凝胶电泳检测；(2)通过PCR扩增大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型中的O-抗原基因簇以大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇；首先根据经常发现于O-抗原基因簇上游的galF基因设计上游引物(5’ATT GTG GCT GCA GGG ATC AAA GAA ATC-3’)，再根据O-抗原基因簇下游的gnd基因设计下游引物(5’-TAG TCG CGC TGN GCC TGG ATT AAGTTC GC-3’)。用Boehringer Mannheim公司的Expand Long Template PCR方法扩增O-抗原基因簇，PCR反应程序如下在94℃预变性2分钟，然后94℃变性10秒，60℃退火30秒，68℃延伸15分钟，这样进行30个循环；最后，在68℃继续延伸7分钟，得到PCR产物，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性；合并6管long PCR产物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps纯化试剂盒纯化PCR产物；(3)构建O-抗原基因簇文库用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构建O-抗原基因簇文库。反应体系是300ng PCR纯化产物，0.9ul 0.1M MnCl2，1ul 1∶2000稀释的1mg/ml的DNaseI，反应在室温中进行；酶切10分钟使DNA片段大小集中在1kb-3kb之间，而后加入2ul 0.1M EDTA终止反应；合并4管同样的反应体系，用等体积的酚抽提一次，用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提一次，再用等体积的乙醚抽提一次后，用2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重悬于18ul水中；随后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul 100mM DTT和5单位的T4DNA聚合酶，11℃反应30分钟，将酶切产物补成平端，75℃终止反应后，加入5单位的Tth DNA聚合酶及其相应的缓冲液并将体系扩大为80ul，70℃反应20分钟，使DNA的3′端加dA尾，此混合物经等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)混合溶液抽提和等体积乙醚抽提后与Promega公司的3×103的pGEM-T-Easy载体于16℃连接24小时，总体积为90ul，其中有9ul的10×buffer和25单位的T4DNA连接酶；最后用1/10体积的3M NaAc(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇沉淀连接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到连接产物。用Bio-Rad公司的电转化感受态细胞的制备方法制备感受态大肠杆菌DH5α细胞，取2-3ul连接产物与50ul感受态大肠杆菌DH5α混合后，转到Bio-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击，电压为2.5千伏，时间为5.0毫秒-6.0毫秒，电击后立即在杯中加入1ml的SOC培养基使菌复苏，然后将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上37℃过夜培养，次日得到蓝白菌落，将得到的白色菌落即白色克隆转到含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，同时从每个克隆中提取质粒并用EcoRI酶切鉴定其中的插入片段的大小，得到的白色克隆群构成了大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型的O-抗原基因簇文库；(4)对文库中的克隆测序从文库中挑选插入片段在1000bp以上的100个克隆由上海生物工程有限公司用ABI377型DNA自动测序仪对克隆中的插入片段单向进行测序，使序列达到80％的覆盖率，再通过将相联系的序列进行反向测序及测通得到剩余20％的序列，从而获得O-抗原基因簇的所有序列；(5)核苷酸序列的拼接及分析用英国剑桥MRC(Medical ResearchCouncil)分子生物学实验室出版的Staden package软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列，从而得到大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列，序列的质量主要由两个方面来保证1)对大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型的基因组作6个Long PCR反应，然后混合这些产物以产生文库。2)对每个碱基，保证3个以上高质量的覆盖率；在得到大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型的O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美国国家生物技术信息学中心(The National Center for BiotechnologyInformation，NCBI)的orffinder发现基因，找到14个开放的阅读框，用blast系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它们是什么基因，再用英国sanger中心的Artemis软件完成基因注释，用Clustral W软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对，最后得到大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型的O-抗原基因簇的结构；(6)特异基因的筛选针对大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy基因设计引物；在每个基因内各设计了两对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方以确保其特异性；用这些引物以166种血清型的大肠杆菌和43株志贺氏菌的基因组为模板进行PCR，所有引物都在大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型中得到阳性结果，在其他组中都没有扩增到任何大小正确的带，也就是说，在大多数组中没有得到任何PCR产物带，虽然在少数组中得到PCR产物带，但其大小不符合预期大小，所以wzx、wzy基因对大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型及其O-抗原都是高度特异的。
(7)引物灵敏度的检测购买市场上的生猪肉馅，搅拌均匀，分成20g一份，存在-40℃冰箱中备用。将10μl大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型的冻存菌液接种到有20ml LB培养基的三角瓶中，于37℃，200转/分，培养12小时至饱和，取少量培养好的菌液作106和107倍的稀释，其余的菌液放于4℃的冰箱中备用，取50μl稀释菌液涂布LB琼脂平板，37度，培养1 2h，对所涂平板计数，计算原液中活菌浓度。在5份生猪肉馅中分别掺入5×103，5×102，5×101，5个和0个活菌，搅拌均匀，加入200ml LB培养基，经6层纱布过滤，过滤液于37℃，200转/分，培养12h。从培养好的菌液中取3ml菌液于6,000g离心5分钟，去上清，加100μl MQ超纯水吹开沉淀并混匀，放入100度沸水中煮15分钟，裂解液于12,000g离心8分钟，取1μ上清做为PCR模板。用4对寡核苷酸对，SEQ ID NO1中的4967至4984碱基的核苷酸和5336至5353碱基的核苷酸，SEQ ID NO1中的5341至5358碱基的核苷酸和5839至5856碱基的核苷酸，SEQ ID NO1中的10475至10492碱基的核苷酸和11855至10872碱基的核苷酸，SEQ ID NO1中的10110至10127碱基的核苷酸和10932至10949碱基的核苷酸，进行PCR反应，PCR反应体系如下MQ15.7μl，Mg2+2.5μl，Buffer2.5μl，dNTP1μl，Taq酶0.3μl，P11μl，P21μl，模板DNA1μl。PCR反应条件为95℃5′，95℃30″，56℃45″，72℃1′，72℃5′，共30个循环。反应结束后，取10μl反应产物电泳，若有与预期大小相符的扩增带，则结果为阳性，若没有，则结果为阴性。参入了5×103，5×102，5×101，和5个活菌的每份猪肉馅均在4对引物的PCR反应中得到阳性结果。参入0个活菌的猪肉馅在4对引物的PCR反应中得到阴性结果。说明使用上述方法时，这4对引物对猪肉馅中的大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型的检测灵敏度均为0.25个菌/g。
也就是，本发明的第一个方面，提供了大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型的O-抗原基因簇的全长核苷酸序列，它的全序列如SEQ ID NO1所示，全长17769个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO1的核苷酸。通过本发明的方法得到了大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型的O-抗原基因簇的结构，如表3所述，它包括命名为rmlB，rmlD，rmlA，rmlC，wzx，orf6，orf7，orf8，orf9，wzy，orf11，orf12，manC，manB的14个基因组成，都位于galF基因和gnd基因之间。
本发明的第二个方面，提供了大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型的O-抗原基因簇中的基因，即转运酶基因(wzx基因或与wzx有相似功能的基因)；聚合酶基因(wzy基因或与wzy有相似功能的基因)；糖基转移酶基因，包括orf6、orf9、orf11、orf12基因；细菌多糖抗原中特殊的糖合成路径基因，包括rmlB、rmlD、rmlA、rmlC、manB、manC、orf7、orf8基因。它们在O-抗原基因簇中的起始位置和终止位置及核苷酸序列都列在表4中。本发明尤其涉及到o-抗原转运酶基因和聚合酶基因，因为糖合成路径基因即合成核苷二磷酸单糖的基因现在被预示对较多胞外多糖是常见的、共同的，对细菌的O-抗原并不是特异的，而本发明涉及到的o-抗原转运酶基因、聚合酶基因和糖基转移酶基因对大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型的O-抗原是特异的。
本发明的第三个方面，提供了源于大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型的O-抗原基因簇中的wzy基因或与wzy有相似功能的基因和wzx基因或与wzx有相似功能的基因的寡核苷酸和糖基转移酶基因包括orf6、orf9、orf11、orf12基因的寡核苷酸，它们是这些基因中的任何一段寡核苷酸。但是，优先被用的是列于表1中源于大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型的O-抗原基因簇中的wzy基因或与wzy有相似功能的基因、wzx基因或与wzx有相似功能的基因的寡核苷酸对。在表1中也列出了这些寡核苷酸对在O-抗原基因簇中的位置及以这些寡核苷酸对为引物所做的PCR反应的产物的大小，这些PCR反应可用表中的退火温度进行。这些引物只在以大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型为模板进行的PCR扩增中得到预期大小的产物，而在以表2所列的其它菌为模板进行的PCR扩增中都未得到预期大小的产物。更详细地说，以这些寡核苷酸对为引物所做的PCR反应在大多数细菌中均未得到任何产物，所以，可以确定这些引物即表1所列的寡核苷酸对大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型及它们的O-抗原是高度特异的。
所述的对大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型的O-抗原特异的核苷酸的分离和鉴定方法包括下述步骤1)基因组的提取；2)PCR扩增大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型中的O-抗原基因簇；3)O-抗原基因簇文库的构建；4)对文库中的克隆测序；5)核苷酸序列的拼接及分析，最终获得O-抗原基因簇的结构；6)特异基因的筛选；7)引物灵敏度的检测。
本发明的其他方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
如本发明所述，“寡核苷酸”主要是指来源于O-抗原基因簇中的编码转运酶的基因、编码聚合酶的基因和编码糖基转移酶基因内的一段核苷酸分子，它们在长度上可改变，一般在10到20个核苷酸范围内改变。尤其是源于wzx基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO1中的4728至5915碱基的核苷酸)和wzy基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO1的9803至11134碱基)内的寡核苷酸对大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型都是高度特异的。
此外，有时两个遗传相似的编码不同O-抗原的基因簇通过基因重组或突变产生新的O-抗原，从而产生新的细菌类型，新的突变株。在这种环境中，需要筛选出多对寡核苷酸同重组基因杂交以提高检测的特异性。因此，本发明提供了一整套多对寡核苷酸的混合物，它们源于转运酶基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因；源于聚合酶基因，包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因；源于糖基转移酶基因，包括orf6、orf9、orf11、orf12基因。这些基因的混合物对一个特殊的细菌多糖抗原来说是特异的，从而使这套寡核苷酸对这个细菌的多糖抗原是特异的。更具体地说，这些寡核苷酸的混合物是源于转运酶基因、源于聚合酶基因和源于糖基转移酶基因中的寡核苷酸的组合。
在另一方面，本发明涉及寡核苷酸的鉴定，它们可以用于检测表达O-抗原的细菌和在诊断中鉴定细菌的O-抗原。
本发明涉及到一种检测食品中的一个或多个细菌多糖抗原的方法，这些抗原可以使样品能与以下至少一个基因的寡核苷酸特异性杂交，这些基因是(i)编码转运酶基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因(ii)编码聚合酶的基因，包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因。(iii)编码糖基转移酶基因，包括orf6、orf9、orf11、orf12基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交，这些细菌是大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型。可用PCR方法检测，更可以将本发明方法中的核苷酸标记后作为探针通过杂交反应如southern-blot或荧光检测，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。
本发明者考虑到以下情况当单个的特异的寡核苷酸检测无效时，寡核苷酸的混合物能与靶区域特异性杂交以检测样品。因此本发明提供了一套寡核苷酸用于本发明所述的检测方法。这里所说的寡核苷酸是指源于编码转运酶基因包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、编码聚合酶的基因包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因的寡核苷酸和编码糖基转移酶基因包括orf6、orf9、orf11、orf12基因的寡核苷酸。这套寡核苷酸对一个特殊的细菌的O-抗原来说是特异的，这一特殊的细菌O-抗原是由大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型表达的。
另一方面，本发明涉及到一种检测排泄物中的一个或多个细菌多糖抗原的方法，这些抗原可以使样品能与以下至少一个基因的寡核苷酸特异性杂交，这些基因是(i)编码转运酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因(ii)编码聚合酶的基因，包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因(iii)编码糖基转移酶基因，包括orf6、orf9、orf11、orf12基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交。这些细菌是大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型。可用本发明中的寡核苷酸作引物通过PCR的方法检测样品，也可将本发明中的寡核苷酸分子标记后作为探针通过杂交反应如southern-blot或荧光检测，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。
一般一对寡核苷酸可能与同样的基因杂交也可与不同的基因杂交，但它们中必须有一个寡核苷酸能特异性杂交到特殊抗原型的特异序列上，另一个寡核苷酸可杂交于非特异性区域。因此，当特殊的多糖抗原基因簇中的寡核苷酸被重新组合时，至少能选出一对寡核苷酸与多糖抗原基因簇中特异基因混合物杂交，或者选出多对寡核苷酸与特异基因的混合物杂交。甚至即使当一个特殊的基因簇中所有基因都独一无二时，此方法也能应用于识别此基因簇内的基因混合物的核苷酸分子。因此本发明提供了一整套用于检测本发明方法的多对寡核苷酸，在这里多对寡核苷酸是源于编码转运酶的基因包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因；源于编码聚合酶的基因包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因；源于编码糖基转移酶的基因包括orf6、orf9、orf11、orf12基因。这套寡核苷酸对一个特殊的细菌多糖来说是特异的，这套寡核苷酸可能是糖合成中必须基因的核苷酸。
另一方面，本发明也涉及到一种检测源于病人的样品中的一个或多个细菌多糖抗原的方法。样品中的一个或多个细菌多糖抗原可以使样品能与以下至少一个基因中的一对寡核苷酸中的一个特异性杂交，这些基因是(i)编码转运酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因(ii)编码聚合酶的基因，包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因(iii)编码糖基转移酶基因，包括orf6、orf9、orf11、orf12基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与样品中的至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交，这些细菌是大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型。可用本发明中的寡核苷酸作引物通过PCR的方法检测样品，也可将本发明中的寡核苷酸标记后作为探针通过杂交反应，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。
更详细地说，以上描述的方法可以理解为当寡核苷酸对被使用时，其中的一个寡核苷酸分子能杂交到一个并不是来源于wzx基因或与wzx有相似功能的基因及wzy基因或与wzy有相似功能的基因和糖基转移酶基因包括orf6、orf9、orf11、orf12基因的序列上。此外，当两个寡核苷酸都能杂交上时，它们可能杂交于同一基因也可能杂交到不同基因上。也即，当交叉反应出现问题时，可选择寡核苷酸的混合物来检测混合的基因以提供检测的特异性。
本发明者相信本发明不必限于以上所提的核苷酸序列编码的特定的O-抗原，而且广泛应用于检测所有表达O-抗原和鉴定O-抗原的细菌。由于O-抗原合成和其他多糖抗原(如细菌胞外抗原)合成之间的相似性，本发明的方法和分子也应用于这些其他的多糖抗原。
本发明首次公开了大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型的O-抗原基因簇的全长序列，而且可从这个未被克隆的全长基因簇的序列中产生重组分子，通过插入表达可产生表达大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型的O-抗原，并成为有用的疫苗。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(NewYorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件。
实施例1基因组的提取。
在5mL的LB培养基中37℃过夜培养大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型，离心收集细胞。用500ul 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重悬细胞，37℃温育20分钟，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶继续保温20分钟。之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃温育2小时，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65℃温育30分钟。加等体积酚抽提混合物，取上清液，再用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(2 5∶24∶1)溶液抽提两次，取上清液，再用等体积的乙醚抽提以除去残余的酚。上清液用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，最后将DNA重悬于30ul TE中。基因组DNA通过0.4％的琼脂糖凝胶电泳检测。
实施例2通过PCR扩增大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型中O-抗原基因簇。
以大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇。首先根据经常发现于O-抗原基因簇上游的galF基因设计上游引物(5’ATT GTG GCT GCA GGG ATC AAA GAA ATC-3’)，再根据O-抗原基因簇下游的gnd基因设计下游引物(5’-TAG TCG CGC TGN GCC TGG ATTAAG TTC GC-3’)。用Boehringer Mannheim公司的Expand Long Template PCR方法扩增O-抗原基因簇，PCR反应程序如下在94℃预变性2分钟；然后94℃变性10秒，61℃退火30秒，68℃延伸15分钟，这样进行30个循环；最后，在68℃继续延伸7分钟，得到PCR产物，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性。合并6管long PCR产物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps纯化试剂盒纯化PCR产物。
实施例3构建O-抗原基因簇文库。
首先是连接产物的获得用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构建O-抗原基因簇文库。反应体系是300ng PCR纯化产物，0.9ul 0.1M MnCl2，1ul 1∶2000稀释的1mg/ml的DNaseI，反应在室温中进行。酶切10分钟使DNA片段大小集中在1kb-3kb之间，而后加入2ul 0.1M EDTA终止反应。合并4管同样的反应体系，用等体积的酚抽提一次，用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提一次，再用等体积的乙醚抽提一次后，用2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重悬于18ul水中。随后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul 100mM DTT和5单位的T4DNA聚合酶，11℃反应30分钟，将酶切产物补成平端，75℃终止反应后，加入5单位的Tth DNA聚合酶及其相应的缓冲液并将体系扩大为80ul，70℃反应20分钟，使DNA的3′端加dA尾。此混合物经等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)混合溶液抽提和等体积乙醚抽提后与Promega公司的3×103的pGEM-T-Easy载体于16℃连接24小时，总体积为90ul。其中有9ul的10×buffer和25单位的T4DNA连接酶。最后用1/10体积的3M NaAc(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇沉淀连接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到连接产物。
其次是感受态细胞的制备参照Bio-Rad公司提供的方法制备感受态细胞大肠杆菌DH5α。取一环大肠杆菌DH5α单菌落于5ml的LB培养基中，180rpm培养10小时后，取2ml培养物转接到200ml的LB培养基中，37℃ 250rpm剧烈振荡培养到OD600 0.5左右，然后冰浴冷却20分钟，于4℃ 4000rpm离心15分钟。倾尽上清液，用冷的冰预冷的去离子灭菌水200ml吹散菌体，于4℃ 4000rpm离心15分钟。再用冷的冰预冷的去离子灭菌水100ml吹散菌体，于4℃ 4000rpm离心15分钟。用冷的冰预冷的10％的甘油悬浮细胞，4℃ 6000rpm离心10分钟，弃上清液，最后沉淀用1ml冰预冷的10％的甘油悬浮细胞，即为感受态细胞。将制得的感受态细胞分装为50ul一管，-70℃保存。
最后是电转化感受态细胞取2-3ul连接产物与50ul感受态大肠杆菌DH5α混合后，转到Bio-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击，电压为2.5千伏，时间为5.0毫秒-6.0毫秒。电击后立即在杯中加入1ml的SOC培养基使菌复苏。然后立即将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上37℃倒置过夜培养，次日得到蓝白菌落。将得到的白色菌落即白色克隆转到含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，同时从每个克隆中提取质粒并用EcoRI酶切鉴定其中的插入片段的大小，得到白色克隆群构成了大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型的O-抗原基因簇文库。
实施例4对文库中的克隆测序。
从文库中挑选插入片段在1000bp以上的100个克隆由上海生物工程有限公司用ABI377型DNA自动测序仪对克隆中的插入片段单向进行测序，使序列达到80％的覆盖率。剩余20％的序列再通过反向测序及将有些序列测通得到，最后获得O-抗原基因簇的所有序列。
实施例5核苷酸序列的拼接及分析。
用英国剑桥MRC(Medical Research Council)分子生物学实验室出版的Staden package软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列，从而得到大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列(见序列列表)。序列的质量主要由两个方面来保证1)对大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型的基因组作6个Long PCR反应，然后混合这些产物以产生文库。2)对每个碱基，保证3个以上高质量的覆盖率。在得到大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型的O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美国国家生物技术信息学中心(The National Center for Biotechnology Information，NCBI)的orffinder发现基因，找到14个开放的阅读框，用blast系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它们是什么基因，再用英国sanger中心的Artemis软件完成基因注释，用Clustral W软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对，最后得到大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型的O-抗原基因簇的结构，如表3所示。
通过检索和比较，发现orf1编码的蛋白与Shigella boydii的dTDP-D-葡萄糖-4，6-脱氢酶在361个氨基酸中有98％的相同性，98％的相似性。dTDP-D-葡萄糖-4，6-脱氢酶由rmlB基因编码，高度的相同性表明orf1也是rmlB基因，命名为rmlB。Orf2编码的蛋白与Escherichiacoli的dTDP-D-葡萄糖-4-鼠李糖还原酶在299个氨基酸中有98％的相同性，99％的相似性。dTDP-D-葡萄糖-4-鼠李糖还原酶由rmlD基因编码，高度的相同性表明orf1也是fmlD基因，命名为rmlD。Orf3编码的蛋白与Shigella boydii的葡萄糖-1-磷酸胸苷转移酶在291个氨基酸中有97％的相同性，98％的相似性。葡萄糖-1-磷酸胸苷转移酶由rmlA基因编码，高度的相同性表明orf3也是rmlA基因，命名为rmlA。Orf4编码的蛋白与Escherichia coli的dTDP-6-脱氧-D-葡萄糖3，5-变位酶在173个氨基酸中有88％的相同性，89％的相似性。dTDP-D-葡萄糖4，6-脱氢酶由rmlC基因编码，较高的相同性表明orf4也是rmlC基因，命名为rmlC。这四个基因共同合成鼠李糖。blast比较表明orf5编码的蛋白与Plesiomonas shigelloides的O-抗原转运酶Wzx在393个氨基酸的序列中有23％的相同性，44％的相似性。并且通过Eisenberg等人的算法[Eisenberg，D，Schwarz，E.etal(1984).Analysis of membrane andsurface protein sequences with the hydrophobic momentplot.J.Mol.Biol.179125-142]发现orf5有10个潜在的穿膜区，这是Wzx蛋白的典型特征，Wzx蛋白的氨基端有一个大约40个氨基酸的保守基序，所以可以确定orf5是wzx基因，命名为wzx。Orf6编码的蛋白与Chromobacterium violaceum的胞外多糖的乙酰基转移酶在152个氨基酸中有44％的相同性，57％的相似性，因此推测orf6也是一个乙酰基转移酶基因，将orf6暂命名为orf6。Orf7编码的蛋白与Bacillusanthracis的pyruvyl-transferase在77个氨基酸中有24％的相同性，49％的相似性，推测orf7也是一个产生pyruvyl-transferase的基因，暂命名为orf7。Orf8编码的蛋白与Methanothermobacterthermautotrophicus的辅酶F420-还原脱氢酶在399个氨基酸中有29％的相同性，48％的相似性。通过对Pfam蛋白基序数据库的搜索，发现orf8编码的蛋白与保守的基序PF00535的E value为3.4×e-35，因此推测orf8也是一个编码还原脱氢酶的基因，将orf8暂命名为orf8。Orf9编码的蛋白与Ureaplasma urealyticum的糖基转移酶在100个氨基酸中有28％的相同性，31％的相似性，推测orf9也编码一个糖基转移酶，将orf9暂命名为orf9。Orf10编码的蛋白与Vibrio cholerae的O-抗原聚合酶在198个氨基酸的序列中有30％的相同性，43％的相似性。并且通过Eisenberg等人的算法[Eisenberg，D，Schwarz，E.etal(1984).Analysis of membrane andsurface protein sequences with the hydrophobic momentplot.J.Mol.Biol.179125-142]发现orf10编码的蛋白有11个潜在的穿膜区，它与许多Wzy蛋白有相似的二级结构，并且有一个大的胞质内亲水环(loop)，具有典型的O-抗原聚合酶的特征，所以确定orf10是wzy基因，命名为wzy。 Orf11编码的蛋白与Escherichia coli的糖基转移酶在335个氨基酸中有27％的相同性，48％的相似性，推测Orf11也编码一个糖基转移酶，将orf11暂命名为Orf11。Orf12编码的蛋白与Bacteroides thetaiotaomicron的糖基转移酶在369个氨基酸中有46％的相同性，65％的相似性，通过对Pfam蛋白基序数据库的搜索，发现orf12编码的蛋白与糖基转移酶家族保守基序PF00535的E value为1.5×e-35，因此推测orf12也是一个糖基转移酶基因，暂命名为orf12。rf13编码的蛋白与Escherichia coli O157H7的manC基因编码的mannose-1-phosphate guanyltransferase在472个氨基酸中有70％的相同性，86％的相似性，高度的相同性表明orf13也是一个manC基因，因此将orf13命名为manC。Orf14编码的蛋白与Escherichia coli的manB基因编码的phosphomannomutase在456个氨基酸中有99％的相同性，99％的相似性，高度的相同性表明orf14也是一个manB基因，因此将orf14命名为manB。
实施例6特异基因的筛选针对大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy基因设计引物，这些基因在核苷酸序列中的位置见表1。
在表1中列出了大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型的O抗原基因簇的转运酶基因、聚合酶基因及它们的相应的功能和大小。在每个基因内，我们各设计了两对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方以确保其特异性。在表中还列出了每个引物在SEQ ID NO1中的位置和大小。以每对引物用表中所列的相应的退火温度以表2中的所有菌的基因组为模板进行PCR，得到了相应的PCR产物，其大小也列于表中。
mdh(malate dehydrogenase)基因是存在于所有的大肠杆菌的基因组中且高度保守的一个基因，所以我们根据mdh基因设计了引物(5′-TTC ATC CTA AACTCC TTA TT-3′)和(5′-TAA TCG CAG GGG AAA GCA GG-3′)，然后从166种血清型的大肠杆菌中提取基因组，方法如前所述。用这对引物从166种血清型的大肠杆菌的基因组中PCR以鉴定大肠杆菌并检测其基因组的质量。
表2是用于筛选特异基因的166种血清型的大肠杆菌和43株志贺氏菌及它们的来源，为了检测的方便，我们将它们每12-19个菌分为一组。它们的来源都列于表中。
在第3组中含有大肠杆菌O58，在第9组中含有痢疾志贺氏菌5型的基因组DNA作为阳性对照。第13组中是不含有大肠杆菌O58的基因组DNA，第14组中是不含有痢疾志贺氏菌5型的基因组DNA，作为阴性对照。以每组菌做模板，用表1中的每对引物按如下条件做PCR在95℃预变性2分钟后，95℃变性15秒，退火温度因引物的不同而不同(参照表1)，退火时间是50秒，72℃延伸2分钟，这样进行30个循环。最后在72℃继续延伸10分钟，反应体系是25ul。反应完毕后，取10ulPCR产物通过0.8％琼脂糖凝胶电泳检测扩增出的片段。
对于wzx、wzy基因，每个基因都有两对引物被检测，每对引物除了在第3组中做PCR后得到了预期大小的正确的一条带外，在其他组中都没有扩增到任何大小正确的带。所以wzx、wzy基因对大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型及其O-抗原都是高度特异的。
最后，通过PCR从大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型中筛选到对大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型的O-抗原高度特异的基因wzx、wzy基因。而这些基因内的任何一段10-20nt的寡核苷酸对大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型的O-抗原是特异的，尤其是上述每个基因中的引物即寡核苷酸对经PCR检测后证实对大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型是高度特异的。所有的这些寡核苷酸都可用于快速准确地检测人体和环境中的大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型，并能鉴定它们的O-抗原。
实施例7引物灵敏度的检测。
购买市场上的生猪肉馅，搅拌均匀，分成20g一份，存在-40℃冰箱中备用。将10μl大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型的冻存菌液接种到有20ml LB培养基的三角瓶中，于37℃，200转/分，培养12小时至饱和，取少量培养好的菌液作106和107倍的稀释，其余的菌液放于4℃的冰箱中备用，取50μl稀释菌液涂布LB琼脂平板，37度，培养12h，对所涂平板计数，计算原液中活菌浓度。在5份生猪肉馅中分别掺入5×103，5×102，5×101，5个和0个活菌，搅拌均匀，加入200ml LB培养基，经6层纱布过滤，过滤液于37℃，200转/分，培养12h。从培养好的菌液中取3ml菌液于6,000g离心5分钟，去上清，加100μl MQ超纯水吹开沉淀并混匀，放入100度沸水中煮15分钟，裂解液于12,000g离心8分钟，取1μ上清做为PCR模板。用4对寡核苷酸对，SEQ ID NO1中的4967至4984碱基的核苷酸和5336至5353碱基的核苷酸，SEQ ID NO1中的5341至5358碱基的核苷酸和5839至5856碱基的核苷酸，SEQ ID NO1中的10475至10492碱基的核苷酸和11855至10872碱基的核苷酸，SEQ ID NO1中的10110至10127碱基的核苷酸和10932至10949碱基的核苷酸，进行PCR反应，PCR反应体系如下MQ15.7μl，Mg2+2.5μl，Buffer2.5μl，dNTP1μl，Taq酶0.3μl，P11μl，P21μl，模板DNA1μl。PCR反应条件为95℃5′，95℃30″，56℃45″，72℃1′，72℃5′，共30个循环。反应结束后，取10μl反应产物电泳，若有与预期大小相符的扩增带，则结果为阳性，若没有，则结果为阴性。参入了5×103，5×102，5×101，和5个活菌的每份猪肉馅均在4对引物的PCR反应中得到阳性结果。参入0个活菌的猪肉馅在4对引物的PCR反应中得到阴性结果。说明使用上述方法时，这4对引物对猪肉馅中的大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型的检测灵敏度均为0.25个菌/g。
通过对O抗原基因簇的克隆和在减毒的疫苗菌株中的表达，可以组建重组疫苗。O抗原为最主要的革兰氏阴性菌的表面抗原，可以引起强烈的免疫反应，是制造重组疫苗的最好的靶分子之一。在1993年Viret实验室成功的将志贺氏菌Sonnei的O抗原基因簇在一株沙门氏菌Tyziai疫苗菌中表达，动物实验证明可以引起兔子的免疫反应(Molecular Microbiology1993，7239-252)。中国军事医学科学院的小组也在从事与Viret实验室类似的工作。王磊实验室在1999年成功的将大肠杆菌O111的O抗原基因簇在沙门氏菌疫苗STM-1中表达，并证明组建成的菌株可以引起小鼠的血液和体液反应(Microbial Pathogenesis 1999，2755-59)。所以本发明大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型的O抗原特异基因序列可以应用于组建重组疫苗。
根据本发明的对大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型的O-抗原特异的核苷酸序列(SEQ ID NO1所示)，构造特异核酸探针，将其固定到芯片的载体上制成生物芯片，将要检测的样品适当处理后，与生物芯片进行杂交反应，然后利用生物芯片信号分析设备就可以得到样品中相应的细菌情况。这种大肠杆菌O抗原鉴定的DNA芯片将可以直接用于临床和其它检验场所(如食品加工和生产行业，畜牧兽医行业海关检疫等的微生物检验)。这种芯片只需要扩大产量，在完全相同的条件下就可以产业化。
表3是大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型的O-抗原基因簇的结构表。在表中列出了大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型的O-抗原基因簇的结构，它们的结构是完全一样的，共由14个基因组成，每个基因用方框表示，并在方框内写入基因的名称。在O-抗原基因簇的两端是galF基因和gnd基因，它们不属于O-抗原基因簇，我们只是用它们的一段序列设计引物来扩增O-抗原基因簇的全长序列。
表4是大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型的O-抗原基因簇中的基因的位置表，在表中列出了大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型的O-抗原基因簇中的所有开放阅读框在全序列中的准确位置，在每个开放阅读框的起始密码子和终止密码子的下面划线。在细菌中开放阅读框的起始密码子有两个ATG和GTG。
序列列表SEQUENCE LISTING<110> 天津生物芯片技术有限责任公司<120> 对大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型的O-抗原特异的核苷酸<160> 1
<170> PatentIn version 3.1<210> 1<211> 17769<212> DNA<213> Escherichia coli and shigella<400> 1attgtggctg cagggatcaa agaaatcctc ctggtaactc acgcgtccaa gaacgcggtc 60gaaaaccact tcgacacctc ttatgaatta gaatctctcc ttgagcagcg cgtgaagcgt120caactgcttg cggaagtgca gtccatctgt ccaccgggcg tgaccattat gaacgtgcgt180cagggcgaac ctttaggttt gggccgctcc attttatgtg cacgacctgc cattggtgac240aacccatttg tcgtggtgct gccagacgtt gtgatcgatg acgccagcgc cgacccgctg300cgctacaacc ttgctgccat gattgcgcgc ttcaacgaaa cgggccgcag ccaggtgctg360gcaaaacgta tgccgggtga cctctctgaa tactctgtca tccagaccaa agagccgctg420gatcgtgagg gtaaagtcag ccgcattgtt gaatttattg aaaaaccaga tcagccgcag480acgctggact cagacatcat ggccgttggt cgctatgtgc tttctgcaga tatttggccg540gaacttgaac gcactcagcc tggtgcatgg gggcgtattc agctgactga tgctattgcc600gaactggcta aaaaacagtc tgttgatgca atgctgatga caggcgacag ctacgactgc660ggtaaaaaaa tgggctatat acaggcgttt gtgaagtatg gactgcgtaa cctaaaagaa720ggggcgaagt tccggaaagg gattgagaag ctgttaagcg aataatgaaa atctgaccgg780atgtaacggt tgataagaaa attataacgg cagtgaagat tcgtggcgaa agtaatttgt840tgcgaatctt cctgccgttg ttttatataa acaatcagaa taacaatgag ttagcaatag900gattttagtc aaagttttcc aggattttcc ttgtttccag agtggattgg taagacaatt960agcgtttgaa tttttcgggt ttagcgcgag taggtaatgc tcgtcacatc gtcggcatgc 1020a tcaaactgag agccgcttat ttcacagcat gctctgaagt aatatggaat aataaagtga 1140a g a g t a c g t
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表1大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型的O抗原基因簇中wzx基因、wzy基因及其中的引物及PCR数据产生正 PCR的基 基因的 正向引物位置 反向引物位置 PCR产物 确大小 退火温功能因 碱基位置 长度 电泳带 度的组数 (℃)wzx O-抗原 4728-5915 4967-4984 5336-5353 387bp 1* 58转运酶5341-5358 5839-5856 516bp 1* 58wzy O-抗原 9803-11134 10475-1049211855-10872398bp 1** 58聚合酶10110-1012710932-10949840bp 1* 581*除了在第3组中产生正确大小的电泳带外，在第9组中也产生正确大小的电泳带。这两组都是阳性对照组1**除了在第3组中产生正确大小的电泳带外，在第9组中也产生正确大小的电泳带。在第6组中有一条大小不正确的电泳带表2 166种血清型的大肠杆菌和43株志贺氏菌及它们的来源组号 该组中含有的菌株 来源1、野生型大肠杆菌 O1，O2，O5，O7，O8，O9，O12，O13，O14，O15，O16，O17，O18， IMVSaO19ab，O20，O21，O22，O23，O242、野生型大肠杆菌 O4，O10，O25，O26，O27，O28，O29，O30，O32，O33，O34，O35， IMVSaO36，O37，O38，O40，O41，O42，O433、野生型大肠杆菌 O6，O44，O45，O46，O48，O49，O50，O51，O52，O54，O55，O56， IMVSaO57，O58，O60，O61，O62，O534、野生型大肠杆菌 O63，O65，O66，O69，O70，O71，O74，O75，O76，O77，O78， IMVSaO79，O80，O81，O82，O83，O685、野生型大肠杆菌 O84，O85，O86，O87，O88，O89，O90，O91，O92，O98，O99， IMVSaO101，O102，O103，O104，O105，O106，O97，6、野生型大肠杆菌 O107，O108，O109，O110，O111，O112ab，O112ac，O113， IMVSaO115，O116，O118，O120，O123，O125，O126，O128，O1177、野生型大肠杆菌 O129，O130，O131，O132，O133，O134，O135，O58，O137，IMVSaO138，O139，O141，O142，O143，O144，O145，O1408、野生型大肠杆菌 O146，O147，O148，O150，O152，O154，O156，O157，O158， IMVSaO159，O160，O161，O163，O164，O165，O166，O153 b9、野生型大肠杆菌 O168，O169，O170，O171，O172，O173， c痢疾志贺氏菌 D1，D2，D3，D4，D5，D6，D7，D8，D9，D10，D11，D12，D13 d10、鲍氏志贺氏菌 B1，B2，B3，B4，B6，B7，B8，B9，B10，B11，B12，B13，B14，B15， dB16，B17，B1811、福氏志贺氏菌 F1a，F1b，F2a，F2b，F3，F4a，F4b，F5(v4)，F5(v7)，F6， dDS，DR12、野生型大肠杆菌 O3，O11，O39，O59，O64，O73，O96，O95，O100，O114，O151，O155， IMVSaO124，O167，O162，O121，O127，O149，O11913、野生型大肠杆菌 去除大肠杆菌O58的第3组菌14、野生型大肠杆菌 去除痢疾志贺氏菌5型的第9组菌为了检测的方便，每12-19个菌分为一组，总共12组，第13组和第14组作为阴性对照a.Institude of Medical and Veterinary Science，Anelaide，Australiab.Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmarkc.O172和O173来自于Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmark，其余来自于IMVSd.中国预防医学科学院流行病学研究所表3是大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型的O-抗原基因簇的结构表 galF rmlB rmlDrmlArmlC wzxorf7 orf8 orf9 orf10 wzy orf12 orf13 manC manB gnd1kb表4是大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型的O-抗原基因簇中的基因的位置表ATTGTGGCTG CAGGGATCAA AGAAATCCTC CTGGTAACTC ACGCGTCCAA GAACGCGGTC 60GAAAACCACT TCGACACCTC TTATGAATTA GAATCTCTCC TTGAGCAGCG CGTGAAGCGT120CAACTGCTTG CGGAAGTGCA GTCCATCTGT CCACCGGGCG TGACCATTAT GAACGTGCGT180CAGGGCGAAC CTTTAGGTTT GGGCCGCTCC ATTTTATGTG CACGACCTGC CATTGGTGAC240AACCCATTTG TCGTGGTGCT GCCAGACGTT GTGATCGATG ACGCCAGCGC CGACCCGCTG300CGCTACAACC TTGCTGCCAT GATTGCGCGC TTCAACGAAA CGGGCCGCAG CCAGGTGCTG360GCAAAACGTA TGCCGGGTGA CCTCTCTGAA TACTCTGTCA TCCAGACCAA AGAGCCGCTG420GATCGTGAGG GTAAAGTCAG CCGCATTGTT GAATTTATTG AAAAACCAGA TCAGCCGCAG480ACGCTGGACT CAGACATCAT GGCCGTTGGT CGCTATGTGC TTTCTGCAGA TATTTGGCCG540GAACTTGAAC GCACTCAGCC TGGTGCATGG GGGCGTATTC AGCTGACTGA TGCTATTGCC600GAACTGGCTA AAAAACAGTC TGTTGATGCA ATGCTGATGA CAGGCGACAG CTACGACTGC660GGTAAAAAAA TGGGCTATAT ACAGGCGTTT GTGAAGTATG GACTGCGTAA CCTAAAAGAA720GGGGCGAAGT TCCGGAAAGG GATTGAGAAG CTGTTAAGCG AATAATGAAA ATCTGACCGG780ATGTAACGGT TGATAAGAAA ATTATAACGG CAGTGAAGAT TCGTGGCGAA AGTAATTTGT840TGCGAATCTT CCTGCCGTTG TTTTATATAA ACAATCAGAA TAACAATGAG TTAGCAATAG900GATTTTAGTC AAAGTTTTCC AGGATTTTCC TTGTTTCCAG AGTGGATTGG TAAGACAATT960AGCGTTTGAA TTTTTCGGGT TTAGCGCGAG TAGGTAATGC TCGTCACATC GTCGGCATGC 1020A Orf1的起始TCAAACTGAG AGCCGCTTAT TTCACAGCAT GCTCTGAAGT AATATGGAAT AATAAAGTGA 1140A G AG T A CG T T TC A C C AGAAAAATAG CTTCCGTTTT CATCATATTT CTACTGACGA AGTCTATGGT GATTTGCCTC 1560A
CT T CA A T C ACTTTCCGGA AAAATTGATT CCACTAGTAA TTCTTAATGC TCTGGAAGGT AAGGCATTAC1800CTATTTATGG CAAAGGGGAT CAAATTCGTG ACTGGCTGTA TGTTGAAGAT CATGCGCGTG1860CGTTATATAC CGTCGTAACC GAAGGTAAAG CGGGTGAAAC TTATAACATT GGTGGACACA1920ACGAAAAGAA AAACATCGAT GTAGTGCTCA CTATTTGTGA TTTGTTGGAT GAGATTGTAC1980CGAAAGAGAA ATCTTACCGC GAGCAAATTA CTTATGTTGC CGATCGCCCG GGACACGATC2040GCCGTTATGC GATTGATGCA GAGAAGATTA GCCGCGAATT GGGCTGGAAA CCGCAGGAAA2100CGTTTGAGAG CGGGATTCGT AAAACGGTGG AATGGTACCT GTCCAATACA AAATGGGTTG2160ATAATGTGAA AAGTGGTGAC TATCAATCGT GGATTGAACA GAACTATGAG GGCCGCCAGT2220Orf2的起始Orf1的终止AATGAATATC CTCCTTTTTG GCAAAACAGG GCAGGTAGGT TGGGAACTAC AGCGTGCTCT2280GGCACCTCTG GGTAATTTGA TTGCTCTTGA TGTTCACTCC ACTGATTACT GTGGTGATTT2340TAGTAATCCT GAAGGTGTAG CTGAAACCGT AAGAAGCATT CGGCCTGATA TTATTGTCAA2400CGCAGCCGCT CACACCGCAG TAGACAAAGC AGAATCAGAA CCGGAGTTTG CACAATTACT2460TAACGCAACA AGTGTCGAAG CGATTGCGAA AGCAGCAAAT GAAGTTGGAG CTTGGGTTAT2520CCATTACTCG ACTGATTACG TCTTCCCTGG AAATGGCGAC ATGCCATGGC TGGAGACGGA2580G AGAGCATTGT GCGAAGCACC TAATTTTCCG TACAAGCTGG GTCTATGCAG GTAAAGGAAA2700TAACTTCGCC AAAACGATGT TGCGTCTGGC AAAAGAGCGT GAAGAATTAG CCGTTATTAA2760TGATCAGTTT GGTGCGCCAA CAGGTGCTGA ACTGCTGGCT GATTGTACGG CACATGCAAT2820TCGTGTGGCA CTGAATAAAC CAGAAGTCGC AGGCTTGTAT CATCTGGTAG CCAGTGGTAC2880CACAACCTGG CACGATTATG CTGCGCTGGT TTTTGAAGAG GCGCGCAAAG CAGGCATTCC2940CCTTGCACTC AACAAGCTCA ATGCAGTACC AACAACAGCC TATCCTACAC CAGCCCGTCG3000CCCCCATAAC TCTCGCCTTA ATACAGAAAA ATTTCAGCAG AACTTTGCGC TTGTCTTGCC3060Orf2的终止TGACTGGCAG GTTGGTGTGA AACGAATGCT CAACGAATTA TTTACGACTA CAGCAATTTA3120Orf3的起始 G GAAAACGCGT AAAGGTACTA TTTTAGCGGG TGGTTCTGGT ACTCGTCTTT ATCCTGTGAC3240TATGGCTGTC AGTAAACAGC TATTACCTAT TTATGATAAG CCGATGATCT ATTACCCGCT3300TTCTACACTG ATGTTAGCGG GTATTCGCGA TATTCTGATT ATCAGTACGC CGCAGGATAC3360TCCTCGTTTT CAACAACTGC TGGGTGACGG GAGCCAGTGG GGGCTAAATC TTCAGTATAA3420AGTGCAACCG AGTCCAGATG GTCTTGCGCA GGCATTTATC ATCGGTGAAG AGTTTATCGG3480TGGTGATGAT CGTGCTTTGG TTCTTGGTGA TAATATCTTC TACGGTCATG ATCTGCCGAA3540GTTAATGGAT GTCGCTGTTA ACAAAGAAAG TGGTGCAACG GTATTTGCCT ATCACGTTAA3600TGATCCTGAA CGCTACGGTG TCGTTGAGTT TGATAAAAAT GGTACGGCGA TCAGCCTGGA3660AGAAAAACCG CTACAACCAA AAAGTAATTA TGCGGTAACC GGGCTTTATT TCTATGATAA3720T CGATATTAAC CGTATTTATA TGGAACAGGG GCGTTTATCT GTTGCCATGA TGGGCCGTGG3840TTATGCATGG CTGGACACGG GGACACATCA AAGCCTGATT GAGGCAAGCA ACTTCATTGC3900
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ATCGCGCGGT GATGTACCGC TGATGGAAGA AAAGACAAAA CTTATCCTTG AGTTACTGAA16260Orf14的终止CAAGTAATTC AGTAATTTCA TATAAATGGG TTTTAAAAAA CGGAAAAGAT GAGATATCCG16320GTGTGGTATA GCCAAGGTAA TGCTATTCAG TATCTCTATG AGTGAGTTAA CATCTATACC16380ACATTTAAGC CGCACACTTG GCGGTAACCA CCCCTGACAG GAGTAAACAA TGTCAAAGCA16440ACAGATCGGC GTCGTCGGTA TGGCAGTGAT GGGACGCAAC CTCGCGCTCA ACATCGAAAG16500CCGTGGTTAT ACCGTCTCTA TTTTCAACCG TTCCCGTGAT AAGACGGAAG AAATTATTGC16560CGAAAATCCA GGCAAGAAAC TGGTTCCTTA CTATACGGTG AAAGAATTCG TTGAATCTCT16620TGAAACGCCT CGTCGCATCC TGTTAATGGT GAAAGCAGGT GCAGGCACGG ATGCTGCTAT16680TGATTCCCTT AAGCCATACC TCGATAAAGG TGACATCATC ATTGATGGTG GTAATACCTT16740CTTCCAGGAC ACCATTCGTC GTAACCGTGA GCTTTCTGCC GAAGGTTTTA ACTTCATCGG16800TACCGGTGTT TCCGGCGGTG AAGAGGGGGC GCTGAAAGGG CCTTCCATCA TGCCTGGTGG16860CCAGAAAGAA GCCTATGAAC TGGTTGCGCC GATCCTGACC AAAATCGCCG CCGTTGCTGA16920AGATGGCGAA CCGTGCGTTA CCTATATCGG TGCCGATGGC GCGGGTCACT ATGTGAAGAT16980GGTTCACAAC GGTATTGAAT ACGGTGATAT GCAACTGATT GCTGAAGCCT ATTCTCTCCT17040GAAAGGCGGC CTGAATCTCT CTAACGAAGA ACTGGCACAG ACCTTTACCG AGTGGAATAA17100CGGTGAACTG AGCAGCTACC TGATCGACAT CACCAAAGAT ATCTTCACCA AAAAAGATGA17160AGACGGTAAC TATCTGGTTG ATGTGATCCT GGATGAAGCG GCTAACAAAG GTACCGGTAA17220ATGGACCAGC CAGAGCGCGC TGGATCTCGG CGAACCGCTG TCGTTGATTA CTGAGTCAGT17280GTTTGCACGT TATATCTCGT CTCTGAAAGA TCAGCGCGTG GCCGCGTCTA AAGTTCTCTC17340TGGTCCGCAA GCACAGCCAG CTGGCGATAA AGCTGAGTTC ATCGAGAAAG TTCGTCGTGC17400C TGAAGAGTAC AACTGGGATC TGAACTACGG CGAAATCGCG AAGATTTTCC GTGCTGGCTG17520T T CGCTAACCTG CTGCTGGCTC CGTACTTCAA GCAAATTGCC GATGACTACC AGCAGGCGCT17640GCGTGATGTC GTTGCTTATG CAGTACAGAA CGGTATCCCG GTTCCGACCT TCGCTGCTGC17700GGTTGCCTAT TATGACAGCT ACCGTGCCGC TGTTCTGCCT GCGAACCTGA TTCAGGCCCA17760GCGTGACTA17769表中的序列是大肠杆菌O58的O抗原基因簇的核苷酸序列，痢疾志贺氏菌5型的O抗原基因簇的核苷酸序列与大肠杆菌O58的O抗原基因簇的核苷酸序列有99.76％是一样的，不一样的碱基用方框表示，在这个碱基的上方是痢疾志贺氏菌5型的核苷酸。从表4中可知大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型的O抗原基因簇的每个基因的起始和终止的位置都是一样的。
以上仅是本发明较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡依本发明技术实质对以上实施例作修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。
权利要求
1.一种对大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，其是如SEQ ID NO1所示的分离的大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型的核苷酸，全长都是17769个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO1的大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型的核苷酸。
2.按照权利要求1所述的对大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，其包括命名为rmlB，rmlD，rmlA，rmlC，wzx，orf6，orf7，orf8，orf9，wzy，orf11，orf12，manC，manB的14个基因组成，都位于galF基因和gnd基因之间。
3.按照权利要求2所述的对大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，所述基因中具有高度特异性的基因包括转运酶基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因；聚合酶基因，包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因；糖基转移酶基因，包括orf6、orf9、orf11、orf12基因。其中所述的转运酶基因是SEQ ID NO1中的4728至5915碱基的核苷酸；所述的聚合酶基因是SEQ ID NO1中的9803至11134碱基的核苷酸；所述的orf6基因是SEQ ID NO1中的5905至6513碱基的核苷酸；orf9基因是SEQ ID NO1中的8977至9798碱基的核苷酸；orf11基因是SEQ ID NO1中的11127至12251碱基的核苷酸；orf12基因是SEQ ID NO1中的12333至13442碱基的核苷酸。
4.按照权利要求1或2所述的对大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，其还包括源于所述的wzx基因或wzy基因中的寡核苷酸或糖基转移酶基因，以及它们的混合或它们的重组。
5.按照权利要求4所述的对大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型的O-抗原高度特异的核苷酸，其特征在于，所述的源于wzx基因的寡核苷酸对是SEQ ID NO1中的4967至4984碱基的核苷酸和5336至5353碱基的核苷酸，SEQ ID NO1中的5341至5358碱基的核苷酸和5839至5856碱基的核苷酸；所述的源于wzy基因的寡核苷酸对是SEQ ID NO1中的10475至10492碱基的核苷酸和11855至10872碱基的核苷酸，SEQ ID NO1中的10110至10127碱基的核苷酸和10932至10949碱基的核苷酸。
6.权利要求1所述的对大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型的O-抗原特异的核苷酸在检测表达O-抗原的细菌、鉴定细菌的O-抗原和细菌的其它多糖抗原的应用。
7.权利要求1所述的对大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型的O-抗原特异的核苷酸的重组分子，在通过插入表达而提供表达大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型的O-抗原，以及制备细菌疫苗中的应用。
8.权利要求1所述的对大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型的O-抗原特异的核苷酸的应用，其特征在于，它作为引物用于PCR、作为探针用于杂交反应与荧光检测、或者用于制造基因芯片或微阵列，供检测细菌。
9.权利要求1所述的对大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型的O-抗原特异的核苷酸的分离方法，其特征在于，其包括下述步骤(1)基因组的提取在培养基中培养大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型，离心收集细胞；得到的基因组DNA通过琼脂糖凝胶电泳检测；(2)通过PCR扩增大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型中的O-抗原基因簇以大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇，将得到的PCR产物，用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性，合并该long PCR产物，并用DNA纯化试剂盒纯化PCR产物；(3)构建O-抗原基因簇文库将Long PCR纯化产物应用鸟枪法构建O-抗原基因簇文库；(4)对文库中的克隆测序从文库中挑选插入片段在1kb以上的克隆用实验室常用的DNA自动测序仪对克隆中的插入片段进行测序，序列达到100％的覆盖率，从而获得O-抗原基因簇的所有序列；(5)核苷酸序列的拼接及分析应用生物信息学软件拼接和编辑所有的序列，从而得到大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列；(6)特异基因的筛选针对大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy、基因设计引物；在每个基因内各设计了两对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方，以确保其特异性；用这些引物以166株大肠杆菌和43株志贺氏菌的基因组为模板进行PCR，确定wzx、wzy基因对大肠杆菌O51型的O-抗原的高度特异性；(7)引物灵敏度的检测培养大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5，细菌计数后分别将5×103，5×102，5×101，5个和0个活菌加入到一定量的某种待检测物中，混入细菌的待检测物作为检测用样品，将样品加入LB培养基，取一些与样品混合过的LB培养基过滤，将过滤液进行培养，从培养好的菌液中取数毫升处理后作为PCR模板用寡核苷酸进行PCR反应，检测其对大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型的灵敏度。
10.权利要求9所述的对大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型的O-抗原特异的核苷酸的分离和鉴定方法，其特征在于，包括下述步骤(1)基因组的提取在5mL的LB培养基中37℃过夜培养大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型，离心收集细胞。用500ul 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul0.4M EDTA重悬细胞，37℃温育20分钟，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶继续保温20分钟。之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃温育2小时，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65℃温育30分钟。加等体积酚抽提混合物，取上清液，再用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)的溶液抽提两次，取上清液再用等体积的乙醚抽提以除去残余的酚，上清液用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，最后将DNA重悬于30ul TE中，基因组DNA通过0.4％的琼脂糖凝胶电泳检测；(2)通过PCR扩增大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型中的O-抗原基因簇以大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇；首先根据经常发现于O-抗原基因簇上游的galF基因设计上游引物(5’ATT GTG GCT GCA GGG ATC AAA GAA ATC-3’)，再根据O-抗原基因簇下游的gnd基因设计下游引物(5’-TAG TCG CGC TGN GCC TGG ATT AAGTTC GC-3’)。用Boehringer Mannheim公司的Expand Long Template PCR方法扩增O-抗原基因簇，PCR反应程序如下在94℃预变性2分钟，然后94℃变性10秒，60℃退火30秒，68℃延伸15分钟，这样进行30个循环；最后，在68℃继续延伸7分钟，得到PCR产物，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性；合并6管long PCR产物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps纯化试剂盒纯化PCR产物；(3)构建O-抗原基因簇文库用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构建O-抗原基因簇文库；反应体系是300ng PCR纯化产物，0.9ul 0.1MMnCl2，1ul 1∶2000稀释的1mg/ml的DNaseI，反应在室温中进行；酶切10分钟使DNA片段大小集中在1kb-3kb之间，而后加入2ul 0.1M EDTA终止反应；合并4管同样的反应体系，用等体积的酚抽提一次，用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)溶液抽提一次，再用等体积的乙醚抽提一次后，用2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重悬于18ul水中；随后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul 100mM DTT和5单位的T4DNA聚合酶，11℃反应30分钟，将酶切产物补成平端，75℃终止反应后，加入5单位的Tth DNA聚合酶及其相应的缓冲液并将体系扩大为80ul，70℃反应20分钟，使DNA的3′端加dA尾。此混合物经等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)溶液抽提和等体积乙醚抽提后与Promega公司的3×103的pGEM-T-Easy载体于16℃连接24小时，总体积为90ul，其中有9ul的10×buffer和25单位的T4DNA连接酶；最后用1/10体积的3M NaAc(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇沉淀连接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到连接产物；用Bio-Rad公司的电转化感受态细胞的制备方法制备感受态大肠杆菌DH5α细胞，取2-3ul连接产物与50ul感受态大肠杆菌DH5α混合后，转到Bio-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击，电压为2.5千伏，时间为5.0毫秒-6.0毫秒，电击后立即在杯中加入1ml的SOC培养基使菌复苏，然后将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上37℃过夜培养，次日得到蓝白菌落，将得到的白色菌落即白色克隆转到含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，同时从每个克隆中提取质粒并用EcoRI酶切鉴定其中的插入片段的大小，得到的白色克隆群构成了大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型的O-抗原基因簇文库；(4)对文库中的克隆测序从文库中挑选插入片段在1000bp以上的100个克隆由上海生物工程有限公司用ABI377型DNA自动测序仪对克隆中的插入片段单向进行测序，使序列达到80％的覆盖率，再通过将相联系的序列进行反向测序及测通得到剩余20％的序列，从而获得O-抗原基因簇的所有序列。(5)核苷酸序列的拼接及分析用英国剑桥MRC(Medical ResearchCouncil)分子生物学实验室出版的Staden package软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列，从而得到大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列，序列的质量主要由两个方面来保证1)对大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型的基因组作6个Long PCR反应，然后混合这些产物以产生文库。2)对每个碱基，保证3个以上高质量的覆盖率；在得到大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型的O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美国国家生物技术信息学中心(The National Center for BiotechnologyInformation，NCBI)的orffinder发现基因，找到14个开放的阅读框，用blast系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它们是什么基因，再用英国sanger中心的Artemis软件完成基因注释，用Clustral W软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对，最后得到大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型的O-抗原基因簇的结构；(6)特异基因筛选针对大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型的O-抗原基因簇中wzx和wzy基因设计引物；在每个基因内各设计两对引物，每对引物分布在相应基因内不同地方以确保其特异性；用这些引物以166种血清型的大肠杆菌和43株志贺氏菌基因组为模板进行PCR，所有引物在大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型中得到阳性结果，在其他组中没有扩增到任何大小正确的带，也就是，在大多数组中没有得到任何PCR产物带，虽在少数组中得到PCR产物带，但其大小不符合预期大小，所以wzx、wzy基因对大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型及其O-抗原都是高度特异的。(7)引物灵敏度的检测将大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型的冻存菌液接种到有LB培养基的三角瓶中，30℃-40℃培养，180至250转/分，培养数小时至饱和，取培养好的菌液稀释，取稀释菌液涂布LB琼脂平板，30℃至40℃，培养数小时计数，计算原液中活菌浓度；在5份重量均为20g的生猪肉馅中分别掺入5×103，5×102，5×101，5个和0个活菌，搅拌均匀，加入LB培养基，过滤，过滤液于30℃-40℃培养，180至250转/分，培养数小时；从培养好的菌液中取数ml于6,000g离心数分钟，去上清，加MQ超纯水吹开沉淀并混匀，放入100℃沸水中煮数分钟，裂解液于12,000g离心数分钟，取上清做为PCR模板；用寡核苷酸(SEQ ID NO1中的4 967至4984碱基的核苷酸和5336至5353碱基的核苷酸，SEQ ID NO1中的5341至5358碱基的核苷酸和5839至5856碱基的核苷酸，SEQ ID NO1中的10475至10492碱基的核苷酸和11855至10872碱基的核苷酸，SEQ ID NO1中的10110至10127碱基的核苷酸和10932至10949碱基的核苷酸)进行PCR反应，PCR反应体系如下MQ15.7μl，Mg2+2.5μl，Buffer2.5μl，dNTP1μl，Taq酶0.3μl，P11μl，P21μl，模板DNA1μl。PCR反应条件为95℃5′，95℃30″，56℃45″，72℃1′，72℃5′，共30个循环；反应结束后，取10μl反应产物电泳，若有与预期大小相符的扩增带，则结果为阳性，若没有，则结果为阴性；参入了5×103，5×102，5×101，和5个活菌的每份猪肉馅均在4对引物的PCR反应中得到阳性结果；参入0个活菌的猪肉馅在4对引物的PCR反应中得到阴性结果；说明使用上述方法时，这4对引物对猪肉馅中的大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5的检测灵敏度均为0.25个菌/g。
全文摘要
本发明提供一种对大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型的O－抗原特异的核苷酸，它是大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型中控制O－抗原合成的基因簇的核苷酸全序列，如SEQ ID NO1所示的分离的核苷酸，全长17769个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO1的核苷酸；还包括源于大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型的O－抗原基因簇中的寡糖单位处理基因的寡核苷酸；本发明通过PCR证实寡核苷酸对大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型的O－抗原都有高度的特异性；本发明还公开了用本发明的寡核苷酸检测和鉴定人体及环境中的大肠杆菌O58和痢疾志贺氏菌5型的方法。
文档编号C12P19/00GK1563062SQ20041001904
公开日2005年1月12日 申请日期2004年4月19日 优先权日2004年4月19日
发明者王磊, 杨静华, 冯露 申请人:天津生物芯片技术有限责任公司