专利名称：三种新型尿激酶原突变体的制作方法
技术领域：
本发明涉及在血栓溶解治疗中使用的新型尿激酶原(prourokinase，pro-UK)突变体(pro-Ukm)，pro-Ukm以对凝血酶或/和纤溶酶原激活剂抑制剂-1具有抵抗力为特点。
背景资料pro-UK是一种单链丝氨酸蛋白酶原，由411个氨基酸残基组成，分子质量54kDa。pro-UK的一个突出特征是其具有较高的内在活性(intrinsic activity)，其内在活性比其它丝氨酸蛋白酶原(如胰蛋白酶原和糜蛋白酶原)高10000倍以上，表现为对人工合成的底物和纤维蛋白溶解酶原的激活作用。
pro-UK经激肽释放酶(kallikrein)或纤溶酶(plasmin)激活在Lys158-Ile159断开形成双链尿激酶(urokinase)。pro-UK和尿激酶均能激活纤维蛋白溶解酶原(plasminogen，简称纤溶酶原)，使之成为纤维蛋白溶解酶(plasmin)，纤维蛋白溶解酶可将血栓处的纤维蛋白和其他血浆蛋白降解，因而pro-UK和尿激酶均可用于血栓梗塞的治疗。
另外，凝血酶(thrombin)可催化pro-UK的Arg156-Phe157之间肽键的水解，产生凝血酶断裂型的尿激酶双链，该双链仅具有微弱的激活纤溶酶原的活性，并且可有效抵抗纤维蛋白溶解酶对其的活化。新形成的血栓中凝血酶浓度较高，使pro-UK活性迅速降低，从而影响了pro-UK治疗血栓的效果。研究发现凝血酶具有作用位点专一性，只能水解Arg/Lys-Xaa间的肽键(Chang J Y.Thrombin specificity，requirement for apolar amino acids adjacent to thethrombin cleavage site of polypeptide substrate.Eur J Biochem，1985，151217～224.)。
pro-UK的催化活性至少受到四种丝氨酸蛋白酶抑制剂的调控，分别是pro-UK激活剂抑制剂(plaminogen activator inhibitor，PAI)1、2、3和微管连接蛋白-1(nexin 1)。其中PAI-1是血浆中纤维蛋白溶解酶原激活剂(plaminogen activator，PA)的主要抑制剂，其可与PA形成稳定的PA-PAI-1复合物，该复合物可很快被肝实质细胞捕获和降解，这就是PA在血栓溶解治疗中半衰期的主要原因。研究发现，pro-UK表面可变环中的许多带正电荷氨基酸残基(R178RHRGGS184)可与PAI-1分子中的带负电荷氨基酸残基形成“盐桥”，该盐桥在PA与PAI-1结合过程中起决定性作用(Adams DS，Griffin LA，Nachajko WR，Reddy VB，Wei CM.A synthetic DNA encoding a modified human urokinase resistant to inhibition by serumplasminogen activator inhibitor.J Biol Chem.1991；266(13)8476-82.)。用苯甲酰甲醛处理尿激酶原，可导致Arg残基改变，研究结果表明改变四个Arg残基可使衍生物在血浆中最稳定，且具有更高的溶栓活性，推测该四个Arg残基中有3个位于尿激酶原表面的可变环(178RRHRGGS184)中，另外的一个Arg残基可能就是Arg156(Moukhametova LI，Aisina RB，YuLG，et al.Properties of the urokinase-type plasminogen activator modified with phenylglyoxal.Russian Journal of Bioorganic Chemistry，2002，28(4)278-283.)。
尿激酶对纤维蛋白没有选择性，可非特异性地激活血循环中的纤溶酶原，产生较高浓度的游离的纤溶酶，从而产生系统性的纤溶状态，引起出血或中风等副作用。与尿激酶相比，pro-UK的一个显著特征是在低剂量时更具有选择性，在低浓度时它对结合在纤维蛋白表面的纤溶酶原具有激活作用而对游离的纤溶酶原的激活作用很弱。但是，在临床治疗血栓时，为了保证溶栓效果而使用较高的剂量，pro-UK就丧失了其低剂量时的特异性。
本发明的目的是为了解决以上问题，对pro-UK基因进行改造，获得具有优良溶解血栓作用的pro-UKm，它具有天然pro-UK的氨基酸序列，对第156的精氨酸(Arg156)进行突变为赖氨酸(Lys)，称为尿激酶原突变体1(pro-Ukm1)；对第178，179，181位的精氨酸(Arg178 179，181)进行突变为178Lys，179Lys，181His，称为尿激酶原突变体2(pro-Ukm2)；还将第156和第178，179，181位的精氨酸(Arg156，178，181)位点突变成了156Lys、178Lys、179Lys、181His，这一突变体称为尿激酶原突变体3(pro-Ukm3)。这些突变体可使其对凝血酶和PAI-1的抵抗力提高，从而延长pro-UK在血浆中的存活时间和降低pro-UK的临床使用量。
发明内容
本发明以pro-UK基因为目的基因，采用PCR定点诱变法对特定位点进行了突变，通过脂质体介导将pro-UK突变体转入真核细胞进行表达。
本发明的技术内容包括通过定点突变，构建两种对凝血酶和/或PAI-1具有抵抗力的pro-UK突变基因，即将pro-UK第156位Arg和第178，179，181位的精氨酸分别变成赖氨酸或组氨酸以及组合突变体，以降低凝血酶对pro-UK的水解和PAI-1与pro-UK的结合。本发明按照上述设计思想，采用PCR定点诱变法获得突变基因，连入pGEM-3ZF，转导至大肠杆菌感受态细胞中，挑选阳性克隆并对其质粒DNA中的pro-UK基因序列进行测定。
表达载体的构建，即从导入三种pro-UKm的克隆载体pGEM-3ZF上回收pro-UKm，连入pcDNA3.1，转导至大肠杆菌感受态细胞中，挑选阳性克隆并对其质粒DNA中的pro-UK基因序列进行测定。
pro-UKm在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中的表达，即将表达载体线性化，通过脂质体法转染CHO细胞，通过G418抗性筛选获得阳性克隆。将阳性克隆扩大培养，收集上清液。
pro-UKm的性质分析，即琼脂糖纤维蛋白溶圈法测定活性，SDS-PAGE测定表达蛋白的单双链比例，表达蛋白对凝血酶抵抗力和在血浆中稳定性。
图1 pro-UKm1的156位Arg突变为His的示意图。
图2 pro-UKm2的178位和179位的Arg突变为Lys、181位的Arg突变为His的示意图。
图3 pro-UKm3的156位Arg突变为His、178位和179位的Arg突变为Lys、181位的Arg突变为His的示意图。
具体实施例方式
1.对凝血酶或PAI-1具有抵抗力的pro-Ukm基因的构建1.1对凝血酶具有抵抗力的pro-Ukm1基因的构建根据凝血酶作用位点的专一性Arg/Lys-Xaa的要求，本发明采用PCR定点诱变法将编码Arg156的碱基CGC突变为CAC(编码His)，以避免凝血酶对其活性的影响。
设计四条引物为A1 5’CTC GGT ACC ATG AGA GCC CTG CTG GCG CGC 3’·A2 5’CCC AAT AAT CTT AAA GTG GGG CCT CAG AGT CT 3’A3 5’AG ACT CTG AGG CCC CAC TTT AAG ATT ATT GGG3’A4 5’TCT GAT ATC AGA GGG CCA GGC CAT TCT CTT CC 3’分别以A1和A2，A3和A4为上下游引物采用高保真DNA聚合酶PCR扩增pro-UK基因(见图1)，条件为94℃，5min→(94℃，30sec→65℃，30 sec→72℃，45 sec)×30→72℃，6min。1％琼脂糖电泳回收长度分别为0.54kb和0.78kb的片段，以该两个片段为模板，以A1和A4为引物，PCR扩增得到突变基因，扩增条件如上。突变基因经KpnI+EcoRV酶切后连接入同样双酶切的pGEM-3ZF，转化大肠杆菌感受态DH5α，挑选阳性克隆接种至5ml LB/Amp(100μg/ml)培养液中，37℃振荡培养10小时，用碱裂解法提取重组质粒，用KpnI+EcoRV(3.2kb+1.3kb)、Bgl I(2.7kb+1.6kb+0.2kb)、PstI(3.6kb+0.9kb)进行酶切鉴定后，酶切正确的重组质粒转化大肠杆菌感受态DH5α，37℃振荡培养10小时，利用试剂盒提取重组质粒，酶切鉴定，酶切正确的质粒对其质粒DNA中的尿激酶原基因序列进行测定。
1.2对PAI-1具有抵抗力的pro-Ukm2基因的构建本发明将编码Arg178，Arg179，Arg181的碱基AGG，AGG，CGG分别突变为AAG，AAG，CAT(分别编码Lys，Lys，His)，降低scu-PA表面可变环的正电荷，以减少其与PAI-1的结合，从而获得稳定高效的突变体。
设计两条引物为C2 5’GT GAC AGA GCC CCC ATG GTG CTT CTT GTA GAT 3’C3 5’ATC TAC AAG AAG CAC CAT GGG GGC TCT GTC AC 3’分别以A1和C2，C3和A4为上下游引物采用PCR扩增pro-UK基因(见图2)，条件为94℃，5min→(94℃，30sec→65℃，30 sec→72℃，45 sec)×30→72℃，6min。1％琼脂糖电泳回收长度为分别0.62kb和0.70kb的片段，以该两个片段为模板，以A1和A4为引物，PCR扩增得到突变基因，扩增条件如上。突变基因经KpnI+EcoRV酶切后接入同样双酶切的pGEM-3ZF，转化大肠杆菌感受态DH5α，挑选阳性克隆接种至5ml LB/Amp(100μg/ml)培养液中，37℃振荡培养10小时，用碱裂解法提取重组质粒，用KpnI+EcoRV(3.2kb+1.3kb)、BglI(2.7kb+1.6kb+0.2kb)、PstI(3.6kb+0.9kb)进行酶切鉴定后，酶切正确的重组质粒转化大肠杆菌感受态DH5α，利用试剂盒提取重组质粒，酶切鉴定，酶切正确的质粒对其质粒DNA中的pro-UK基因序列进行测定。
1.3对凝血酶和PAI-1有抵抗力的pro-Ukm3基因的构建以对PAI-1有抵抗力的Pro-UKm基因为模板，分别以A1和A2，A3和A4为上下游引物，采用构建对凝血酶有抵抗力的pro-UKm基因的具体方法(见图3)，获得对凝血酶和PAI-1均有抵抗力的pro-UKm基因，测序后进行表达载体的构建。
2.含有尿激酶原突变体的表达载体的构建KpnI+EcoRV酶切重组pGEM-3ZF，利用试剂盒回收1.3kb片段，连接入经同样双酶切的pcDNA3.1，转化大肠杆菌感受态DH5α，经氨苄青霉素抗性筛选获得阳性克隆，接种至5ml LB/Amp(200μg/ml)培养液中，37℃振荡培养10小时，用碱裂解法提取重组质粒，用KpnI+EcoRV、PstI、NcoI酶切重组pcDNA3.1，得到的片段依次为5.4kb+1.3kb、2.3kb+4.4kb、3.3kb+2.1kb+0.7kb+0.6kb(含有Pro-UKm2和Pro-Ukm3基因的重组pcDNA3.1经NcoI酶切为3.3kb+1.7kb+0.7kb+0.6kb+0.3kb)。
3.突变体在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中的表达将酶切正确的质粒转化大肠杆菌DH5α，接种至5ml LB/Amp(100μg/ml)培养液中，37℃振荡培养10小时，用试剂盒提取质粒，用MfeI酶切线形化重组质粒pcDNA3.1，试剂盒回收线性化片段(大小约为6.7kb)，再用Bst1107I酶切，回收4.33kb片段。复苏冷冻保存的CHO细胞，37℃，5％CO2条件下进行细胞培养，细胞培养液(1/3CHO-S-SFMII+2/3DMEM)中添加了1％非必需氨基酸、1％丙酮酸钠和1％双抗(青霉素&链霉素)，待其生长至70％-90％汇合时，采用脂质体包裹4.33kb片段转染CHO细胞。用Geneticin分别在96孔板和90mm培养皿中筛选抗性克隆，Geneticin的浓度为1200μg/mL，每隔3天换液，换液3次后将所得的抗性克隆用0.25％胰蛋白酶消化后转至24孔板，每天均收集上清液，采用纤维蛋白溶圈法测定活性，挑选出表达外源蛋白活性高的细胞株，0.25％胰蛋白酶消化后将其转至细胞培养瓶培养。
4.pro-UKm的性质分析收集细胞培养瓶中的细胞上清液，经过初步纯化后进行性质分析。
4.1琼脂糖纤维蛋白溶圈法测定活性将1％琼脂糖凝胶加热至沸腾，吸取10ml热溶液至50ml小锥形瓶，冷却至40℃左右，加入1ml牛血纤维蛋白原溶液(10mg/ml)，迅速混合均匀，再加入凝血酶溶液(1.68U/ml)1ml，迅速混合均匀，立即倒入90mm细胞培养皿，轻倾使之均匀分布，吸弃气泡，室温下放置30min，用内径为2mm的打孔器打孔，每孔内加入样品8μl，将培养皿置于湿盒内，37℃放置10h。以尿激酶标准品作对照，测定重组蛋白的溶圈大小，以粗略估计溶栓活性。
4.2.SDS-PAGE测定表达蛋白的单双链比例将初步纯化的目的蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶还原电泳，以pro-UK标准品作对照，所用分离胶浓度为12％，电压为100V。将电泳后的凝胶用考马斯亮蓝染色4h后，用不含染料的甲醇-乙酸液脱色，观测50kb左右蛋白条带，计算其所占比例。
4.3.表达蛋白对凝血酶抵抗力和在血浆中稳定性的研究初步纯化的pro-UKm与1ml人血浆混和并置于37℃水中温浴，每隔1小时，取出20μl利用纤维蛋白溶圈法测定溶栓活性。
4.4.用于细菌、酵母和动物生物反应器的表达研究将三种pro-Ukm的基因DNA分别连接到细菌表达载体、酵母表达载体和动物乳腺表达载体进行表达研究。
尿激酶原突变体1核苷酸序列SEQUENCE LISTING<110>中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所<120>三种新型尿激酶原突变体<130>尿激酶原突变体1核苷酸序列<141>2004-04-20<160>1<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>1296<212>DNA<213>human<400>1atgagagccc tgctggcgcg cctgcttctc tgcgtcctgg tcgtgagcga ctccaaaggc 60agcaatgaac ttcatcaagt tccatcgaac tgtgactgtc taaatggagg aacatgtgtg 120tccaacaagt acttctccaa cattcactgg tgcaactgcc caaagaaatt cggagggcag 180cactgtgaaa tagataagtc aaaaacctgc tatgagggga atggtcactt ttaccgagga 240aaggccagca ctgacaccat gggccggccc tgcctgccct ggaactctgc cactgtcctt 300cagcaaacgt accatgccca cagatctgat gctcttcagc tgggcctggg gaaacataat 360tactgcagga acccagacaa ccggaggcga ccctggtgct atgtgcaggt gggcctaaag 420ctgcttgtcc aagagtgcat ggtgcatgac tgcgcagatg gaaaaaagcc ctcctctcct 480ccagaagaat taaaatttca gtgtggccaa aagactctga ggccccactt taagattatt 540gggggagaat tcaccaccat cgagaaccag ccctggtttg cggccatcta caggaggcac 600cgggggggct ctgtcaccta cgtgtgtgga ggcagcctca tcagcccttg ctgggtgatc 660agcgccacac actgcttcat tgattaccca aagaaggagg actacatcgt ctacctgggt 720
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尿激酶原突变体2核苷酸序列SEQUENCE LISTING<110>中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所<120>三种新型尿激酶原突变体<130>尿激酶原突变体2核苷酸序列<141>2004-04-20<160>1<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>1296<212>DNA<213>human<400>1atgagagccc tgctggcgcg cctgcttctc tgcgtcctgg tcgtgagcga ctccaaaggc60agcaatgaac ttcatcaagt tccatcgaac tgtgactgtc taaatggagg aacatgtgtg120tccaacaagt acttctccaa cattcactgg tgcaactgcc caaagaaatt cggagggcag180cactgtgaaa tagataagtc aaaaacctgc tatgagggga atggtcactt ttaccgagga240aaggccagca ctgacaccat gggccggccc tgcctgccct ggaactctgc cactgtcctt300cagcaaacgt accatgccca cagatctgat gctcttcagc tgggcctggg gaaacataat360tactgcagga acccagacaa ccggaggcga ccctggtgct atgtgcaggt gggcctaaag420ctgcttgtcc aagagtgcat ggtgcatgac tgcgcagatg gaaaaaagcc ctcctctcct480ccagaagaat taaaatttca gtgtggccaa aagactctga ggccccgctt taagattatt540gggggagaat tcaccaccat cgagaaccag ccctggtttg cggccatcta caagaagcac600catgggggct ctgtcaccta cgtgtgtgga ggcagcctca tcagcccttg ctgggtgatc660agcgccacac actgcttcat tgattaccca aagaaggagg actacatcgt ctacctgggt720
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Asp Ser Lys Gly Ser Asn Glu Leu His Gln Val Pro Ser Asn Cys Asp20 25 30Cys Leu Asn Gly Gly Thr Cys Val Ser Asn Lys Tyr Phe Ser Asn Ile35 40 45His Trp Cys Asn Cys Pro Lys Lys Phe Gly Gly Gln His Cys Glu Ile50 55 60Asp Lys Ser Lys Thr Cys Tyr Glu Gly Asn Gly His Phe Tyr Arg Gly65 70 75 80Lys Ala Ser Thr Asp Thr Met Gly Arg Pro Cys Leu Pro Trp Asn Ser85 90 95Ala Thr Val Leu Gln Gln Thr Tyr His Ala His Arg Ser Asp Ala Leu100 105 110Gln Leu Gly Leu Gly Lys His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Arg115 120 125Arg Arg Pro Trp Cys Tyr Val Gln Val Gly Leu Lys Pro Leu Val Gln130 135 140Glu Cys Met Val His Asp Trp Ala Asp Gly Lys Lys Pro Ser Ser Pro145 150 155 160Pro Glu Glu Leu Lys Phe Gln Cys Gly Gln Lys Thr Leu Arg Pro Arg165 170 175Phe Lys Ile Ile Gly Gly Glu Phe Thr Thr Ile Glu Asn Gln Pro Trp180 185 190Phe Ala Ala Ile Tyr Lys Lys His His Gly Gly Ser Val Thr Tyr Val195 200 205Cys Gly Gly Ser Leu Ile Ser Pro Cys Trp Val Ile Ser Ala Thr His210 215 220
Cys Phe Ile Asp Tyr Pro Lys Lys Glu Asp Tyr Ile Val Tyr Leu Gly225 230 235 240Arg Ser Arg Leu Asn Ser Asn Thr Gln Gly Glu Met Lys Phe Glu Val245 250 255Glu Asn Leu Ile Leu His Lys Asp Tyr Ser Ala Asp Thr Leu Ala His260 265 270His Asn Asp Ile Ala Leu Leu Lys Ile Arg Ser Lys Glu Gly Arg Cys275 280 285Ala Gln Pro Ser Arg Thr Ile Gln Thr Ile Cys Leu Pro Ser Met Tyr290 295 300Asn Asp Pro Gln Phe Gly Thr Ser Cys Glu Ile Thr Gly Phe Gly Lys305 310 315 320Glu Asn Ser Thr Asp Tyr Leu Tyr Pro Glu Gln Leu Lys Met Thr Val325 330 335Val Lys Leu Ile Ser His Arg Glu Cys Gln Gln Pro His Tyr Tyr Gly340 345 350Ser Glu Val Thr Thr Lys Met Leu Cys Ala Ala Asp Pro Gln Trp Lys355 360 365Thr Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Ser Leu370 375 380Gln Cys Arg Met Thr Leu Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Arg Gly Cys385 390 395 400Ala Leu Lys Asp Lys Pro Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser His Phe Leu405 410 415Pro Trp Ile Arg Ser His Thr Lys Glu Glu Asn Gly Leu Val Leu420 425 430
尿激酶原突变体3核苷酸序列SEQUENCE LISTING<110>中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所<120>三种新型尿激酶原突变体<130>尿激酶原突变体3核苷酸序列<141>2004-04-20<160>1<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>1296<212>DNA<213>human<400>1atgagagccc tgctggcgcg cctgcttctc tgcgtcctgg tcgtgagcga ctccaaaggc60agcaatgaac ttcatcaagt tccatcgaac tgtgactgtc taaatggagg aacatgtgtg120tccaacaagt acttctccaa cattcactgg tgcaactgcc caaagaaatt cggagggcag180cactgtgaaa tagataagtc aaaaacctgc tatgagggga atggtcactt ttaccgagga240aaggccagca ctgacaccat gggccggccc tgcctgccct ggaactctgc cactgtcctt300cagcaaacgt accatgccca cagatctgat gctcttcagc tgggcctggg gaaacataat360tactgcagga acccagacaa ccggaggcga ccctggtgct atgtgcaggt gggcctaaag420ctgcttgtcc aagagtgcat ggtgcatgac tgcgcagatg gaaaaaagcc ctcctctcct480ccagaagaat taaaatttca gtgtggccaa aagactctga ggccccactt taagattatt540gggggagaat tcaccaccat cgagaaccag ccctggtttg cggccatcta caagaagcac600catgggggct ctgtcaccta cgtgtgtgga ggcagcctca tcagcccttg ctgggtgatc660agcgccacac actgcttcat tgattaccca aagaaggagg actacatcgt ctacctgggt720cgctcaaggc ttaactccaa cacgcaaggg gagatgaagt ttgaggtgga aaacctcatc780
ctacacaagg actacagcgc tgacacgctt gctcaccaca acgacattgc cttgctgaag 840atccgttcca aggagggcag gtgtgcgcag ccatcccgga ctatacagac catctgcctg 900ccctcgatgt ataacgatcc ccagtttggc acaagctgtg agatcactgg ctttggaaaa 960gagaattcta ccgactatct ctatccggag cagctgaaaa tgactgttgt gaagctgatt 1020tcccaccggg agtgtcagca gccccactac tacggctctg aagtcaccac caaaatgctg 1080tgtgctgctg acccacagtg gaaaacagat tcctgccagg gagactcagg gggacccctc 1140gtctgttccc tccaaggccg catgactttg actggaattg tgagctgggg ccgtggatgt 1200gccctgaagg acaagccagg cgtctacacg agagtctcac acttcttacc ctggatccgc 1260agtcacacca aggaagagaa tggcctggcc ctctga1296人尿激酶原突变体3的氨基酸序列SEQUENCE LISTING<110>中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所<120>三种新型尿激酶原突变体<130>人尿激酶原突变体3的氨基酸序列<141>2004-04-20<160>1<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>431<212>PRT<213>human<400>1Met Arg Ala Leu Leu Ala Arg Leu Leu Leu Cys Val Leu Val Val Ser1 5 10 15Asp Ser Lys Gly Ser Asn Glu Leu His Gln Val Pro Ser Asn Cys Asp20 25 30
Cys Leu Asn Gly Gly Thr Cys Val Ser Asn Lys Tyr Phe Ser Asn Ile35 40 45His Trp Cys Asn Cys Pro Lys Lys Phe Gly Gly Gln His Cys Glu Ile50 55 60Asp Lys Ser Lys Thr Cys Tyr Glu Gly Asn Gly His Phe Tyr Arg Gly65 70 75 80Lys Ala Ser Thr Asp Thr Met Gly Arg Pro Cys Leu Pro Trp Asn Ser85 90 95Ala Thr Val Leu Gln Gln Thr Tyr His Ala His Arg Ser Asp Ala Leu100 105 110Gln Leu Gly Leu Gly Lys His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Arg115 120 125Arg Arg Pro Trp Cys Tyr Val Gln Val Gly Leu Lys Pro Leu Val Gln130 135 140Glu Cys Met Val His Asp Trp Ala Asp Gly Lys Lys Pro Ser Ser Pro145 150 155 160Pro Glu Glu Leu Lys Phe Gln Cys Gly Gln Lys Thr Leu Arg Pro His165 170 175Phe Lys Ile Ile Gly Gly Glu Phe Thr Thr Ile Glu Asn Gln Pro Trp180 185 190Phe Ala Ala Ile Tyr Lys Lys His His Gly Gly Ser Val Thr Tyr Val195 200 205Cys Gly Gly Ser Leu Ile Ser Pro Cys Trp Val Ile Ser Ala Thr His210 215 220Cys Phe Ile Asp Tyr Pro Lys Lys Glu Asp Tyr Ile Val Tyr Leu Gly225 230 235 240Arg Ser Arg Leu Asn Ser Asn Thr Gln Gly Glu Met Lys Phe Glu Val245 250 255
Glu Asn Leu Ile Leu His Lys Asp Tyr Ser Ala Asp Thr Leu Ala His260 265 270His Asn Asp Ile Ala Leu Leu Lys Ile Arg Ser Lys Glu Gly Arg Cys275 280 285Ala Gln Pro Ser Arg Thr Ile Gln Thr Ile Cys Leu Pro Ser Met Tyr290 295 300Asn Asp Pro Gln Phe Gly Thr Ser Cys Glu Ile Thr Gly Phe Gly Lys305 310 315 320Glu Asn Ser Thr Asp Tyr Leu Tyr Pro Glu Gln Leu Lys Met Thr Val325 330 335Val Lys Leu Ile Ser His Arg Glu Cys Gln Gln Pro His Tyr Tyr Gly340 345 350Ser Glu Val Thr Thr Lys Met Leu Cys Ala Ala Asp Pro Gln Trp Lys355 360 365Thr Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Ser Leu370 375 380Gln Cys Arg Met Thr Leu Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Arg Gly Cys385 390 395 400Ala Leu Lys Asp Lys Pro Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser His Phe Leu405 410 415Pro Trp Ile Arg Ser His Thr Lys Glu Glu Asn Gly Leu Val Leu420 425 430
权利要求
1.三种具有血栓溶解活性的尿激酶原(pro-UK)突变体(pro-UKm)，它们在天然pro-UK的氨基酸序列基础上经人工定向突变，除突变处的序列外，其它部分不变。三种突变体具有与天然pro-UK同样或更高的溶栓能力，比天然pro-UK有更好的稳定性和更长的半衰期。
2.根据权利要求书1所述的pro-UKm，其特征在于抵抗凝血酶和/或纤溶酶原激活剂抑制剂-1对尿激酶原活性的影响，从而提高溶栓能力和降低给药剂量。
3.根据权利要求书2所述的pro-UKm，其中天然pro-UK的氨基酸序列中第156、178，179，181位的精氨酸(Arg156，178，179，181)被其他氨基酸所代替。
4.根据权利要求书3所述的pro-UKm，其特征在于第156、178，179，181位的精氨酸(Arg156， 178，179，181)，或者是用赖氨酸代替，或者是用组氨酸代替以及多种组合突变。
5.一种编码权利要求书2、3和4所述的pro-UKm的蛋白分子。
6.用权利要求书5所述的蛋白编码DNA分子转染的细胞和酵母。
7.用权利要求书5所述的蛋白编码DNA分子转化的细菌。
8.用权利要求书5所述的蛋白编码DNA分子制备的动物生物反应器。
全文摘要
为了消除凝血酶的作用位点，消弱纤溶酶原激活剂抑制剂－1(plaminogen activator inhibitor－1，PAI－1)与尿激酶原的结合，使尿激酶原突变体对凝血酶和PAI－1的抵抗力提高，从而延长尿激酶原在血浆中的半衰期和降低尿激酶原的临床使用量，对天然尿激酶原基因采用PCR定点诱变法进行了突变，对第156位精氨酸(Arg
文档编号C12N9/72GK1690199SQ20041003393
公开日2005年11月2日 申请日期2004年4月21日 优先权日2004年4月21日
发明者于永生, 邓继先, 张正光 申请人:中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所