专利名称：制备低聚木糖的方法及其中使用的α－葡萄糖醛酸酶的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种制备低聚木糖的方法及其中使用的α-葡萄糖醛酸酶的制备方法。
背景技术：
低聚木糖又称木寡糖，由2-7个木糖以β-1，4-糖苷键连接而成，以木二糖，木三糖为主。各项研究表明，低聚木糖，尤其是木二糖，具有显著的双歧杆菌增殖能力，不被消化性，无龋齿性以及促进人体对钙的吸收等特性，因此，低聚木糖作为一种新型功能性低聚糖成为食品工业研究开发的热点之一。我国是一个农业大国，每年产生各种农作物秸杆5.7亿吨，若仅烧以作肥料，既浪费资源又造成环境污染。因此，利用这些生物废料制备低聚木糖具有一定的经济效益和社会效益。
目前低聚木糖生产方法包括酸水解法、热水抽提、霉菌深层发酵和酶法等，木聚糖酶水解法是低聚木糖生产的主要方法，即将玉米芯用氢氧化钠溶液浸提，然后用酸中和、过滤，滤液经过处理后直接添加木聚糖酶来制备低聚糖。但是，在玉米芯，甘蔗渣和秸秆等农林废弃物中约94％的半纤维素是阿拉伯糖葡萄糖醛酸木聚糖，这类木聚糖是一条以β-1，4糖苷键相联的木聚糖主链，上面带有1，3-阿拉伯糖或1，2-葡萄糖醛酸构成的侧枝，当利用单一木聚糖酶水解这类木聚糖制备低聚木糖时，α-葡萄糖醛酸侧枝则对木聚糖酶的作用产生空间屏障，使得木聚糖酶不能结合和分解邻近这些侧枝的木聚糖，这不仅影响酶法水解的效率，而且影响低聚木糖的质量。
发明内容
本发明的目的是，针对木聚糖酶法制备低聚木糖时的不足之处，提供一种能提高酶法制备低聚木糖的水解速度、产量和质量的低聚木糖制备方法。即利用α-葡萄糖醛酸酶与木聚糖酶的协同作用。通过在木聚糖酶水解木聚糖时外加α-葡萄糖醛酸酶，一方面加速木聚糖产生木寡糖的反应速度，另一方面使酶解产物中带有α-葡萄糖醛酸侧枝的大片段得到进一步水解，提高低聚木糖的产量和纯度。本发明还提供了一种α-葡萄糖醛酸酶的制备方法。
为了达到本发明的目的所采用的技术方案包括以下步骤a.用缓冲液配制木聚糖溶液；b.向上述溶液中加入木聚糖酶和α-葡萄糖醛酸酶进行木聚糖水解；c.酶解后木聚糖水解液经后处理得到低聚木糖。
制备低聚木糖的方法中，所述的缓冲液推荐使用PH4-7的柠檬酸缓冲液、磷酸缓冲液；制备低聚木糖的方法中，对木聚糖溶液的浓度没有特殊要求，以配出的溶液粘度适合操作为准，但优选1-25％(重量比)，更好的是3-20％，最好是20％；制备低聚木糖的方法中的反应温度只要是能保持酶活性的均可，本发明推荐55-85℃，60-80℃更好，最好是80℃；制备低聚木糖的方法中，水解时间在5小时以上较好，推荐5-18小时，最好是12小时；制备低聚木糖的方法中，所述两种酶是必须的，但用量都可调节，其中木聚糖酶用量推荐8-300(U/g木聚糖)，优选50-220(U/g木聚糖)，最好是200(U/g木聚糖)；α-葡萄糖醛酸酶用量推荐6-60(U/g木聚糖)，优选8-50(U/g木聚糖)；最好是15(U/g木聚糖)。
本发明制备低聚木糖的方法中，对木聚糖溶液的浓度、酶解温度、反应时间、木聚糖酶和α-葡萄糖醛酸酶用量都没有特殊要求，不限于推荐使用的数值范围。木聚糖溶液浓度只要其粘度适合操作就可；酶解温度根据所使用的酶对温度的要求而定；反应时间根据木聚糖水解程度来控制，可以低于本发明推荐的5小时，也可以高于18小时；木聚糖酶的用量少于8(U/g木聚糖)或高于300(U/g木聚糖)时，反应仍可进行；α-葡萄糖醛酸酶的用量也可以低于本发明推荐的8(U/g木聚糖)或高于300(U/g木聚糖)。
本发明中所提到的U/g，无特别说明的，均表示(U/g木聚糖)。
本发明中所提到的浓度，无特别说明的，均表示重量比。
因为热稳定性酶在生物处理过程中具有减少污染危险、加快反应速度、可提高酶作用底物溶解度和有较高的抗化学变性等优势，可以改善木聚糖水解过程的技术和经济可行性。因此本发明中所用的酶优选耐热性酶。
本发明提供了一种耐热性α-葡萄糖醛酸酶的制备方法使用PCR将源自嗜热厌氧细菌的α-葡萄糖醛酸酶基因扩增而得到后，插入载体pET-28a(+)中，构建完成的重组质粒转化大肠杆菌BL21-CodonPlus(DE3)-RIL并令其表达。将已表达的重组菌通过离心收集细胞，随后经破胞、热处理后离心取上清液即为酶液。
上述α-葡萄糖醛酸酶的制备方法中所述的嗜热厌氧细菌，优选海栖热袍菌。海栖热袍菌是一种生长在55-90℃的海底火山口附近、严格厌氧的细菌，是提供高活性和热稳定性半纤维素酶的重要来源。天然的α-葡萄糖醛酸酶基因是根据海栖热袍菌编码的极耐热性α-葡萄糖醛酸酶的基因5’端及3’端序列所合成的适当5’端及3’端的引物，从海栖热袍菌中借助PCR扩增而得到，随后将此DNA片段插入质粒中，构建完成的重组pET-28a(+)-aguA，随后以之转化适当的宿主细胞包括大肠杆菌并令其表达。之后，将已表达的重组菌通过离心收集细胞，随后用缓冲液重悬细胞并使之破碎，经热处理后离心取上清液即为酶液。
在本发明中，木聚糖制备可参考Pellerin P等的方法(Pellerin P，GosselinM，Lepoutre JP，Samain E and Debeire P(1991)Enzymic production ofoligosaccharides from corncob xylan.Enzyme Microb Technol 132617-621)用碱从玉米芯、稻草和甘蔗渣等植物纤维中提取，用作酶转化底物。也可从Sigma公司购买。
木聚糖酶和α-葡萄糖醛酸酶的制备可以由产木聚糖降解酶系的微生物液体发酵方法制得，包括细菌和真菌，例如海栖热袍菌Thermotoga maritima、嗜热脂肪芽孢杆菌Clostridium stercoraium、嗜热解糖厌氧杆菌Thermoanaerobacterium saccharolyticum JW/SL-YS485、里氏木霉Trichodermareesei、草菇菌Volvariella volvacea等，发酵产生的木聚糖酶和α-葡萄糖醛酸酶可以经疏水柱、分子筛或离子交换树脂制备成部分纯化的酶制剂。上述菌种可从美国菌种收藏中心、中国微生物菌种保藏中心和食用菌研究所购买。木聚糖酶还可从Sigma公司购买。
本发明采用木聚糖酶和α-葡萄糖醛酸酶的联合作用，将木聚糖糖化分解，使之生成低聚木糖。与现有的单一木聚糖酶法相比较，水解速度快、木二糖含量高。将通过本发明方法得到的木聚糖酶解液进行还原糖和薄层层析色谱分析表明(见图2、图3)，在木聚糖酶水解木聚糖中，加入α-葡萄糖醛酸酶后，还原糖的生成速度迅速加快；酶解产物的主要成分为木二糖和木三糖，并伴有少量木糖。采用HPLC高压液相色谱检测表明，木二糖含量比单一木聚糖酶处理的酶解液高0.6倍(见图4、图5)。低聚木糖含量的分析在Waters HPLC 246-E高压液相色谱仪上，用Sugarpakl，6.5mm×300mm糖柱分析。色谱条件柱温85℃；流动相水；流速0.5mL/min；示差折光检测器灵敏度4，外标法标定，进样量为10μL。木二糖和木三糖标准样品购于Sigma公司。
通过利用本发明提供的基因重组技术将嗜热微生物中的α-葡萄糖醛酸酶基因分别在适当的宿主细胞中高表达获得的酶液，经SDS-PAGE电泳结果表明重组α-葡萄糖醛酸酶纯度达90％(见图1)。依本方法制得的酶蛋白不但产量高，而且具有极佳活性，并易纯化。
图1是极耐热性α-葡萄糖醛酸酶纯化过程的SDS-PAGE图谱，图中1是蛋白质标样；2是E.coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL/pET-28a(+)；3是E.coliBL21(DE3)/pET-28a(+)-aguA全细胞；4是E.coli BL21(DE3)/pET-28a(+)-aguA热处理；5是AguA纯酶。
图2是α-葡萄糖醛酸酶对玉米芯木聚糖的酶解反应的影响曲线。
图3是不同时间酶水解玉米芯木聚糖的TLC图谱；图中2，4，6，8，10是木聚糖酶水解1h，3h，5h，7h，12h；1，3，5，7，9是木聚糖酶和α-葡萄糖醛酸酶联合水解1h，3h，5h，7h，12h；11是低聚木糖标样。
图4是木聚糖酶水解玉米芯木聚糖产物的离子色谱图，图中7.801min木三糖；9.212min木二糖；11.283min木糖。
图5是木聚糖酶和α-葡萄糖醛酸酶联合水解玉米芯木聚糖产物的离子色谱图，图中7.761min木三糖；9.199min木二糖；11.149min木糖。
图6是低聚木糖的制备流程。
具体实施例方式
实施例1参照图6及其它附图，本发明的具体操作如下(1)用碱抽提玉米芯木聚糖。
取颗粒直径为3mm左右的风干玉米芯纤维，先用清水浸泡后离心除去水分，按固液比7-10∶1加入氢氧化钠溶液，终浓度为1％-3％，在室温下或高温下浸提，然后收集滤液并用酸中和至微酸性，然后用三倍体积乙醇沉淀即得木聚糖。
(2)制备酶根据Genbank中xynB、aguA序列设计两对引物，以T.maritima菌的基因组DNA为模板进行PCR扩增。Tm-xynB-N端引物为5’-CCGTTCCATGGACTACAGGATGTGC-3’，Tm-xynB-C端引物为5’-CCGCTCGAGCGGATATATCTTTCTTCCCTT-3’，Tm-aguA-N端引物为5’-GGAATTCCATATGAAAATATTACCTTCTGTGTTGAT-3’，Tm-aguA-C端引物为5’-CCCTCGAGTCTTTCTTCTATCTTTTTCTCCAG-3’。
将α-葡萄糖醛酸酶和木聚糖酶PCR产物分别插入质粒pET-28a(+)、pET-20b后，构建重组表达质粒pET-28a(+)-aguA和pET-20b-xynB。
分别取0.01μg重组表达质粒pET-20b-xynB和pET-28a(+)-aguA电转化到50μL大肠杆菌JM109(DE3)或BL21-CodonPlus(DE3)-RIL感受态细胞中后，在500μL的SOC培养基中振荡培养1h，取100μL菌液涂布于LB/Amp(100μg/mL)或Kna((30μg/mL)平板，37℃培养过夜，从而获得木聚糖酶(XynB)的基因工程菌E.coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL/pET-20b-xynB和α-葡萄糖醛酸酶(AguA)的基因工程菌E.coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL/pET-28a(+)-aguA。
海栖热袍菌的培养是将培养基经加热驱氧、充氮、冷却后加还原剂Na2S 0.5g/L，并分装于预先充氮的100mL血清瓶中，加盖密封并灭菌冷却后，用注射器按0.5％接种量接入种液，80℃静置培养8-10h即可。
所用的培养基配方为(1L)10g胰蛋白胨，5g酵母粉，27g NaCl，1mg树脂天青(resazurin)，15ml微量元素trace(Difco Maritima Broth medium)，0.5g Na2S，pH 7.0。微量元素的制备按如下配方，Nitrilotriacetic acid 1.5g，MgSO4·7H2O 3.0g，MnSO4·H2O 500.0mg，NaCl 1.0g，FeSO4·7H2O 100.0mg，Co(NO3)2·6H2O 100.0mg，CaCl2(无水)100.0mg，ZnSO4·7H2O 100.0mg，CuSO4·5H2O 10.0mg，AlK(SO4)2(无水)10.0mg，Boric acid 10.0mg，Na2MoO4·2H2O 10.0mg，Na2SeO3(无水)1.0g。先将Nitrilotriacetic acid溶于500mL水，用2-3M的KOH将pH调制6.5。再加入其他成分，定容至1L。
挑取基因工程菌E.coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL/pET-20b-xynB和BL21-CodonPlus(DE3)-RIL/pET-28a(+)-aguA的单菌落接种于5mL含有Amp或Kna抗性的LB液体培养基，37℃过夜培养，然后以1％的接种量再接入LB抗性液体培养基，转速200r/min，37℃振荡培养至OD600达0.8～1.0作液体种子，接入到发酵罐中。
LB培养基组成1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl，调pH 7.0，灭菌冷却至37℃后，加接入0.01％Amp或0.003％Kna，装液量60％。发酵罐起始pH 7.0，最终pH 7.9，通气量1∶1，温度为30℃，转速250r/min。培养至OD600达0.6～0.8，流加IPTG至浓度0.8mmol/L，继续培养6h，放罐。
以4,800×g离心10min收集细胞，用150mL磷酸钾缓冲液(50mmol/L，pH6.8)重悬，经超声波或高压细胞破碎仪(French Pressure，Thermo)破碎细胞，9,600×g离心20min，取上清于70℃下热处理20min后，9,600×g离心30min，上清液即为酶液。
(3)将碱抽提到的木聚糖用60mmol/L pH7柠檬酸缓冲液配成25％浓度后，加入耐热性木聚糖酶220U/g，耐热性α-葡萄糖醛酸酶60U/g，水解温度85℃，水解8小时。酶解后木聚糖水解液经脱色、离子交换、浓缩后即可得木二糖高含量的低聚木糖。
实施例2与实施例1基本相同，不同之处在于将木聚糖用25mmol/L pH6.3Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液配成20％浓度，酶用量耐热性木聚糖酶200U/g，耐热性α-葡萄糖醛酸酶15U/g，水解温度80℃，水解12小时。
实施例3与实施例1基本相同，不同之处在于将木聚糖用40mmol/L pH6.0Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液配成15％浓度，酶用量耐热性木聚糖酶300U/g，耐热性α-葡萄糖醛酸酶30U/g，水解温度75℃，水解5小时。
实施例4取颗粒直径为3mm左右的风干稻草纤维，先用清水浸泡后离心除去水分，按固液比7-10∶1加入氢氧化钠溶液，终浓度为1％-3％，在室温下或高温下浸提，然后收集滤液并用酸中和至微酸性，然后用三倍体积乙醇沉淀即得木聚糖。
将草菇菌(Volvariella volvacea)经液体发酵后，用尼龙膜过滤得到上清液，经60～80％硫酸铵沉淀，再用pH 6.8磷酸缓冲液使沉淀重悬，取上清液经Phenyl-agarose疏水柱、TOSOHASS-HW-55S分子筛和HTP羟基磷灰石柱层析制备成部分纯化的α-葡萄糖醛酸酶。
将碱抽提到的木聚糖用50mmol/L pH5.0柠檬酸缓冲液配成1％浓度后，加入木聚糖酶8U/g，α-葡萄糖醛酸酶6U/g，水解温度55℃，水解18小时。酶解后木聚糖水解液经脱色、离子交换、浓缩后即可得木二糖高含量的低聚木糖。
实施例5将从稻草中用碱抽提到的木聚糖用10mmol/L pH4柠檬酸缓冲液配成3％浓度后，加入木聚糖酶50U/g，α-葡萄糖醛酸酶8U/g，水解温度58℃，水解15小时。酶解后木聚糖水解液经脱色、离子交换、浓缩后即可得木二糖高含量的低聚木糖。
实施例6将从甘蔗渣中用碱抽提到的木聚糖用30mmol/L pH5.5柠檬酸缓冲液配成10％浓度后，加入木聚糖酶150U/g，α-葡萄糖醛酸酶50U/g，水解温度60℃，水解10小时。酶解后木聚糖水解液经脱色、离子交换、浓缩后即可得木二糖高含量的低聚木糖。
实施例7与实施例4基本相同，不同之处在于，木聚糖酶和α-葡萄糖醛酸酶是通过嗜热脂肪芽孢杆菌液体发酵法制得，木聚糖水解温度是70℃。
实施例8与实施例4基本相同，不同之处在于，木聚糖酶和α-葡萄糖醛酸酶是通过嗜热解糖厌氧杆菌液体发酵法制得，木聚糖水解温度是65℃。
实施例9与实施例4基本相同，不同之处在于，木聚糖购于Sigma公司，木聚糖酶和α-葡萄糖醛酸酶是通过里氏木霉液体发酵法制得。
实施例10与实施例4基本相同，不同之处在于，木聚糖溶液浓度为0.5％，反应温度是50℃，水解时间20小时，木聚糖酶用量为6U/g，α-葡萄糖醛酸酶用量为4U/g。
实施例11与实施例1基本相同，不同之处在于，木聚糖溶液浓度为28％，反应温度是90℃，水解时间4小时，木聚糖酶用量为350U/g，α-葡萄糖醛酸酶用量为70U/g。
实施例12与实施例1基本相同，不同之处在于，木聚糖溶液浓度为0.3％，反应温度是88℃，水解时间4.5小时，木聚糖酶用量为7U/g，α-葡萄糖醛酸酶用量为5U/g。
权利要求
1.一种低聚木糖的制备方法，包括以下步骤a.用缓冲液配制木聚糖溶液；b.向上述溶液中加入木聚糖酶和α-葡萄糖醛酸酶进行木聚糖水解；c.酶解后木聚糖水解液经后处理得到低聚木糖。
2.根据权利要求1所述的低聚木糖制备方法，其特征在于，所述各步骤具体操作如下a.用PH4-7的缓冲液配制木聚糖溶液，溶液浓度为1％-25％(重量比)；b.向上述溶液中加入木聚糖酶和α-葡萄糖醛酸酶，在55-85℃时水解5-18小时；其中木聚糖酶用量为8-300U/g木聚糖，α-葡萄糖醛酸酶用量为6-60U/g木聚糖；c.酶解后木聚糖水解液经后处理得到低聚木糖。
3.根据权利要求2所述的低聚木糖制备方法，其特征在于步骤a中木聚糖溶液浓度为3％-20％；步骤b中木聚糖酶用量为50-220U/g木聚糖，α-葡萄糖醛酸酶用量为8-50U/g木聚糖。
4.根据权利要求2所述的低聚木糖制备方法，其特征在于步骤b中所述反应温度是60-80℃。
5.根据权利要求4所述的低聚木糖制备方法，其特征在于a.用PH6.3缓冲液配制浓度为20％木聚糖溶液；b.向上述溶液中加入木聚糖酶和α-葡萄糖醛酸酶，在80℃时水解12小时；其中木聚糖酶用量为200U/g木聚糖，α-葡萄糖醛酸酶用量为15U/g木聚糖。
6.一种用于权利要求1所述的低聚木糖制备的α-葡萄糖醛酸酶的制备方法是使用PCR将源自嗜热厌氧细菌的α-葡萄糖醛酸酶基因扩增而得到后，插入载体pET-28a(+)中，构建完成的重组质粒转化大肠杆菌BL21-CodonPlus(DE3)-RIL并令其表达。将已表达的重组菌通过离心收集细胞，随后经破胞、热处理后离心取上清液即为酶液。
7.根据权利要求6所述的α-葡萄糖醛酸酶的制备方法，其特征在于，所述的嗜热厌氧细菌是海栖热袍菌。
8.根据权利要求7所述的α-葡萄糖醛酸酶的制备方法，其特征在于，以海栖热袍菌的基因组DNA为模板进行PCR扩增时，Tm-aguA-N端引物是5’-GGAATTCCATATGAAAATATTACCTTCTGTGTTGAT-3’，Tm-aguA-C端引物是5’-CCCTCGAGTCTTTCTTCTATCTTTTTCTCCAG-3’。
全文摘要
本发明公开了一种制备低聚木糖的方法，解决了单一酶法制备低聚木糖时水解速度慢、产量低和木二糖含量低的问题，具体技术方案是采用木聚糖酶和α－葡萄糖醛酸酶的联合作用，将木聚糖糖化分解，使之生成低聚木糖。本发明还公开了一种用于制备低聚木糖的α－葡萄糖醛酸酶的制备方法，具体方案是，使用PCR将源自供体菌的α－葡萄糖醛酸酶基因扩增而得到后，插入载体中，构建完成的重组质粒转化适当的宿主细胞并令其表达。之后，将已表达的重组菌通过离心收集细胞、破胞、热处理后离心取上清液即为酶液。根据本方法制得的酶蛋白不但产量高，而且具有极佳活性，并易纯化。
文档编号C12P19/00GK1584040SQ20041004497
公开日2005年2月23日 申请日期2004年6月9日 优先权日2004年6月9日
发明者薛业敏, 邵蔚蓝, 毛忠贵 申请人:江南大学