专利名称：Sars核酸疫苗及其制备方法，冠状病毒s基因的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物基因工程领域，具体涉及非典型肺炎(SARS)核酸疫苗及其制备方法，以及SARS相关冠状病毒S基因在制备预防SARS的疫苗方面的应用。
背景技术：
中国广东地区从去年末开始爆发非典型肺炎(atypicalpneumonia)，发病急，传染性强，抗生素治疗无效。目前，此病已传播至30多个国家和地区，WHO已将之命名为严重急性的呼吸道综合症(severe acute respiratory syndrome，SARS)。
目前，世界许多国家的科学家均从不同病人血清中独立分离到新型的冠状病毒(coronavirus)，病毒基因序列分析结果表明，它们与已知的冠状病毒有50％～60％的同源性，世界卫生组织(WHO)已经公布，引起SARS的病原体是冠状病毒的变异株。
冠状病毒是一种非节段性正链的RNA病毒，其基因组近30kb，可以在人和动物中传播，主要感染人和动物的呼吸系统，冠状病毒颗粒是一种具有内核心及囊膜包被地病毒，共有四种结构蛋白刺突蛋白(spike，S)，膜蛋白(membrance，M)，囊膜蛋白(envelop，E)，及核蛋白(nucleoprotein，N)。由于冠状病毒是一种RNA病毒，十分不稳定，容易发生突变以逃避宿主的免疫监督与排斥。因此，必须寻找到SARS相关冠状病毒中稳定性好且具有免疫保护作用的抗原，以进行相关疫苗的研制。
目前较少应用灭活的病毒颗粒疫苗，因为全病毒颗粒携带了病毒全基因组，安全性顾虑较大。虽然既往的冠状病毒易在体外培养获得，但此次SARS相关的冠状病毒毒性极大且遗传背景不完全清楚，因此大规模制备冠状病毒颗粒的不可行。基因工程技术的发展为亚单位疫苗的开发提供了极大的便利，而且亚单位疫苗的可操作性及生物安全性好。若能筛选到具有免疫原性的病毒抗原决定簇，结合基因工程技术，可方便地对抗原决定簇进行改造，以增强其稳定性、免疫原性、生物安全性。显然，借助基因工程技术，可以非常方便地制备有效的亚单位疫苗。
根据目前研究显示，冠状病毒已知的四种结构蛋白中，刺突蛋白(spike S)是具有诱导保护性免疫反应的结构蛋白，部分学者的研究结构已经证实了冠状病毒刺突蛋白C末端为其抗原决定族所在，同时，SARS相关冠状病毒通过呼吸道引起感染，而目前仍未有可以预防SARS的疫苗。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种能预防流行性疾病非典型肺炎(SARS)的核酸疫苗，更好地防止“非典型肺炎”的发生和传播；本发明另外的目的在于提供上述SARS核酸疫苗的方法以及揭示SARS相关冠状病毒S基因在制备疫苗中的应用。
本发明的目的是这样实现的通过生物工程手段，将SARS相关冠状病毒S基因(冠状病毒共有四个结构基因，S基因为其中之一，见下文详述)提取，将其克隆到真核表达质粒(例如pcDNA3)，经过筛选、纯化等一系列的步骤，最后制成SARS核酸注射制剂(疫苗)。
本发明主要是通过将SARS相关冠状病毒结构基因之一S基因克隆到pcDNA3质粒，得到克隆体，将此制成核酸疫苗。其中pcDNA3质粒购自Invitrogen。
所用Spike基因片段序列为使用Gene bank中所公布的S基因序列作为模版，根据序列设计PCR引物如下Primer D15’-GTTGAATTCAACAACTAAACGAACATG-3’Primer D25’-GAGAATTCGTTCGTTTATGTGTAATG-3’Primer D35’-TTGAATTCACCATGGGAGCTGAGCATGTCGA-3’Primer D45’-ATGAATTCAGATTAAACAGGCATTACTTCTGT-3’全长扩增引物D1和D2N端扩增引物D1和D4C端扩增引物D2和D3D14(D1和D4作为引物扩增的S基因N端)扩增片段长度2172bp
D23(D2和D3作为引物扩增的S基因C端)扩增片段长度1885bpSARS核酸疫苗的制备首先，收集合分离康复病人血清，通过分离提取得到冠状病毒总RNA，通过反转录、测序、挑选等步骤得到S基因。接着，将S基因克隆到pcDNA3(见图2)，得到克隆体(保藏单位中国典型培养物保藏中心；保藏日期2003年5月17日；保藏号CCTCC M 203038E.coli JM109/pcDNA3D14)经扩增、纯化、制剂等步骤，得到SARS核酸疫苗。主要的技术路线见图9。
本发明是一种核酸疫苗，具体说是通过提取SARS相关冠状病毒S基因，即SARS相关冠状病毒抗原决定族所在基因，利用基因工程技术，将其制成核酸疫苗。本发明相较与传统的灭活病毒颗粒疫苗，它安全性高，免疫原性良好。
目前，SARS正在世界各地快速传播，作为一种病毒性传染病，眼下尚未找到可以有效治疗的药物，此种情况下，预防是最好的手段。现已证实SARS相关冠状病毒刺突蛋白C末端为其抗原决定族所在。因此，本发明正是根据此发现，提取SARS相关冠状病毒刺突蛋白，将其克隆到pcDNA3，经过扩增、纯化、制剂而成，能有效诱导机体产生抗体，防止病毒侵染机体，具有广泛的临床应用前景。
四
图1是DNA疫苗和蛋白亚单位疫苗研究引物设计。
图2是质粒pcDNA3的构建图。
图3是pcDNA3-SN克隆酶切鉴定结果。
图4是pcDNA3-SC克隆酶切鉴定结果。
图5是pcDNA3-SN克隆测序结果。
图6是pcDNA3-SC克隆测序结果。
图7是S基因转化pcDNA3质粒鉴定电泳图。
图8是注射(尾注)质粒疫苗诱导大鼠产生特异性抗体(二抗1∶6000)的结果。
图9是SARS核酸疫苗制备的技术路线图。
五具体实施例方式
以下将通过具体实施例来进一步说明本发明。
实施例1SARS核酸疫苗的制备取得SARS相关冠状病毒sPike(SF、SN、SM、SC)基因后，用PCR方法进行扩增，经PCR后，用EcoR1酶切，同时酶切pcDNA3(见图3、图4)，连接，转化大肠杆菌，利用氨苄(Ampr)抗性筛选阳性克隆(见图5、图6)，培养、纯化、制剂得到SARS核酸疫苗。
所述的剂型为注射剂。
SARS疫苗包含SARS相关冠状病毒S基因和pcDNA3质粒。克隆到pcDNA3上的为SARS相关冠状病毒S基因全长。
克隆到真核表达质粒上的为SARS相关冠状病毒S基因S1区片段。
克隆到真核表达质粒上的为SARS相关冠状病毒S基因S2区片段。
克隆到真核表达质粒上的为SARS相关冠状病毒S基因S1S2区片段(碱基号为49～3585，见序列表)。
克隆到真核表达质粒上的为SARS相关冠状病毒S基因跨膜区片段(碱基号为3686～3648，见序列表)和C端片段。
实施例2克隆到pcDNA3上的为SARS相关冠状病毒S基因N端片段。其余同实施例1。
实施例3克隆到pcDNA3上的为SARS相关冠状病毒S基因中间片段。其余同实施例1。
实施例4克隆到pcDNA3上的为SARS相关冠状病毒S基因C端片段。其余同实施例1。
实施例5S基因转化pcDNA3质粒及鉴定经PCR扩增的S基因，用EcoR1进行酶切，同时酶切pcDNA3质粒，连接、转化大肠杆菌、培养、利用氨苄抗性筛选阳性克隆，得到S基因pcDNA3重组体，利用常规琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果见图7。
实施例6SARS核酸疫苗效果试验
试验动物Visting大鼠15只，体重为100g左右(中山大学动物中心提供)。
受试物pcDNA3-SN Shuttle-SC对照物pcDNA3空载体试验方法将Visting大鼠随机分为3组，每组5只，第一组为pcDNA3-SN试验组；第二组为Shuttle-SC试验组；第三组为pcDNA3空载体，采用腿肌肉注射法和尾静脉注射法。
第一组pcDNA3-SN试验组1，2号鼠，每鼠4条腿分别肌肉注射50μg pcDNA3-SN，即每鼠共200μg。
3，4号鼠，每鼠尾静脉注射200μg pcDNA3-SN加入混合体积的支质体2000。
5号鼠不注射。
第二组Shuttle-SC试验组1，2号鼠，每鼠4条腿分别肌肉注射25μg Shuttle-SC，即每鼠共100μg。
3，4号鼠，每鼠尾静脉注射25μg Shuttle-SC加入混合体积的支质体2000。
5号鼠不注射第三组pcDNA3空载体组1，2号鼠，每鼠4条腿分别肌肉注射50μg pcDNA3空载体，即每鼠共100μg。
3，4号鼠，每鼠尾静脉注射50μg pcDNA3空载体加入混合体积的支质体2000。
5号鼠不注射注射后第7天和第14天以相同的剂量各加强一次，第21天抽血清检测。
预期效果注射pcDNA3-SN和Shuttle-SC的动物血清中能检测出SARS病毒相应片段表达的抗体；未注射及对照组的动物未能检测到SARS病毒的抗体。
结果以上实验共进行三次，均达到预期效果(见图8)。
<110>中山大学肿瘤防治中心<120>SARS核酸疫苗及其制备方法，冠状病毒S基因的应用<160>4<210>1<211>3780<212>DNA<213>病毒种<220>
<221>CDS<222>(1)…(3780)<400>1atgtttattt tcttattatt tcttactctc actagtggta gtgaccttga ccggtgcacc 60acttttgatg atgttcaagc tcctaattac actcaacata cttcatctat gaggggggtt 120tactatcctg atgaaatttt tagatcagac actctttatt taactcagga tttatttctt 180ccattttatt ctaatgttac agggtttcat actattaatc atacgtttgg caaccctgtc 240atacctttta aggatggtat ttattttgct gccacagaga aatcaaatgt tgtccgtggt 300tgggtttttg gttctaccat gaacaacaag tcacagtcgg tgattattat taacaattct 360actaatgttg ttatacgagc atgtaacttt gaattgtgtg acaacccttt ctttgctgtt 420tctaaaccca tgggtacaca gacacatact atgatattcg ataatgcatt taattgcact 480ttcgagtaca tatctgatgc cttttcgctt gatgtttcag aaaagtcagg taattttaaa 540cacttacgag agtttgtgtt taaaaataaa gatgggtttc tctatgttta taagggctat 600
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<223>根据spike基因碱基序列设计的用于PCR扩增Spike基因全长的引物(一对)<400>2gttgaattca acaactaaac gaacatggagaattcgt tcgtttatgt gtaatg<210>3<211>59
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据spike基因碱基序列设计的用于PCR扩增spike基因N端的引物(一对)<400>3gttgaattca acaactaaac gaacatgatgaattcag attaaacagg cattacttct gt<210>4<211>57<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据spike基因碱基序列设计的用于PCR扩增spike基因C端的引物(一对)<400>4gagaattcgt tcgtttatgt gtaatgttgaattcac catgggagct gagcatgtcg a
权利要求
1.一种SARS疫苗，其特征在于它包含SARS相关冠状病毒S基因和真核表达质粒。
2.根据权利要求1所述疫苗，其特征在于真核表达质粒包含CMV启动子、BGHpolyA。
3.根据权利要求1或2所述疫苗，其特征在于真核表达质粒为pcDNA3。
4.根据权利要求1或2所述疫苗，其特征在于克隆到真核表达质粒上的为SARS相关冠状病毒S基因全长。
5.根据权利要求1或2所述疫苗，其特征在于克隆到真核表达质粒上的为SARS相关冠状病毒S基因S1区片段。
6.根据权利要求1或2所述疫苗，其特征在于克隆到真核表达质粒上的为SARS相关冠状病毒S基因S2区片段。
7.根据权利要求1或2所述疫苗，其特征在于克隆到真核表达质粒上的为SARS相关冠状病毒S基因S1S2区片段。
8.根据权利要求1或2所述疫苗，其特征在于克隆到真核表达质粒上的为SARS相关冠状病毒S基因跨膜区片段和C端片段。
9.一种SARS核酸疫苗的制备方法，包括(1)取得SARS相关冠状病毒的S基因；(2)将S基因克隆到PcDNA3质粒；(3)经培养、扩增、纯化，制成制剂。
10.根据权利要求9所述的核酸疫苗的制备方法，其特征在于提取S基因后用PCR方法进行扩增，同时酶切S基因和PcDNA3后连接，转化大肠杆茵，利用氨苄(Ampr)抗性筛选阳性克隆，经培养，纯化，制成制剂。
11.根据权利要求9所述的核酸疫苗的制备方法，其特征在于将S基因克隆到PcDNA3质粒时用EcoR1酶切。
12.根据权利要求9所述的核酸疫苗的制备方法，其特征在于根据S基因序列设计PCR引物如下Primer D15’-GTTGAATTCAACAACTAAACGAACATG-3’Primer D25’-GAGAATTCGTTCGTTTATGTGTAATG-3’Primer D35’-TTGAATTCACCATGGGAGCTGAGCATGTCGA-3’Primer D45’-ATGAATTCAGATTAAACAGGCATTACTTCTGT-3’全长扩增引物D1和D2N端扩增引物D1和D4C端扩增引物D2和D3D14(D1和D4作为引物扩增的S基因N端)扩增片段长度2172bpD23(D2和D3作为引物扩增的S基因C端)扩增片段长度1885bp
13.根据权利要求8或9所述的核酸疫苗的制备方法，其特征在于所述制剂为注射剂。
14.SARS相关冠状病毒S基因在制备预防SARS的疫苗中的应用。
全文摘要
本发明属于生物基因工程领域，具体涉及非典型肺炎(SARS)核酸疫苗及其制备方法，以及SARS相关冠状病毒S基因在制备预防SARS的疫苗方面的应用。本发明是一种核酸疫苗，具体说是通过提取SARS相关冠状病毒刺突蛋白S基因，将其克隆到pcDNA3，经过扩增、纯化、制剂成为核酸疫苗。本发明相较与传统的灭活病毒颗粒疫苗，它安全性高，免疫原性良好，能有效诱导机体产生抗体，防止病毒侵染机体，具有广泛的临床应用前景。
文档编号C12N15/40GK1562366SQ20041004429
公开日2005年1月12日 申请日期2004年5月18日 优先权日2003年5月21日
发明者曾益新, 黄文林, 汪健, 覃海德, 刘鹏, 潘志刚, 冯启胜, 李疆, 黄丽惜, 张妙华, 陈丽珍 申请人:中山大学肿瘤防治中心