用于结核病诊断的结核分支杆菌蛋白的制作方法

专利名称：用于结核病诊断的结核分支杆菌蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种利用基因工程制备的结核分支杆菌蛋白，以及该蛋白在结核病诊断、结核病流行病学调查及监测中的应用和其作为抗原成份在疫苗中的应用。
背景技术：
结核分支杆菌是结核病的致病菌，每年全世界大约三百万人罹患结核杆菌导致的结核病。我国是世界上22个结核病高负担国家之一，病人人数居世界第二位，仅次于印度。近年来，结核病的发病人数在我国又呈上升趋势。
结核病是一种呼吸道传染病，因此，对该病的早期、准确诊断是有效控制该病广泛传播的关键。
在20世纪的20年代，国外研究者已将液体培养基中生长的结核杆菌裂解的可溶性产物的浓缩过滤物制成了供皮试的变态反应原(旧结核菌素，OT)。1934年seiber建立硫酸铵盐析法制备出了PPD。1982年我国开始研制PPD，其基本制备方法为将苏通培养基37℃培养8-10周培养物，100℃ 60min灭活后过滤除去菌体，然后用终浓度2％三氯醋酸盐析法沉淀，提纯蛋白衍化物，此蛋白衍生物即为PPD[王国治，中国防痨杂志，1991]。OT与PPD均能引起分支杆菌致敏机体的DTH反应，广泛应用于结核病初步诊断，结核病流行病学调查及监测。但是，由于OT与PPD中除蛋白衍化物以外，还包含结核杆菌代谢产物，菌体多糖、核酸、脂类物质以及培养基中的一些成份等，常常造成非特异性交叉反应和其他副反应。美国Konstantin在报告中指出，PPD抗原与几乎所有分支杆菌有共同抗原，存在着广泛的交叉反应[Konstantin L，et al.，Infection and Immunity，1998]；黄健报道，在1184人群的流行病学调查中，注射局部出现皮肤异常反应，如出现水疱、坏死的约占1.7％[黄健，中国防痨杂志，1994]；刘元东等报道，PPD皮试强阳性266人，其中出现水疱，坏死的人数为132人，占49.6％[刘元东等，中国防痨杂志，2000]；吴兰珍等报道89例结核性疾病(肺结核、肺外结核)患者中，PPD皮试出现水疱，坏死及反应范围超过20mm以上者占34.7％[吴兰珍等，中国防痨杂志，1991]。除此之外，还有极少数患者在PPD皮试后出现全身过敏性反应，如变态反应性坏死性血管炎，过敏性紫癜，淋巴管炎，过敏性休克等。
鉴于PPD存在上述毒副反应及特异性差问题，近年来，研究人员在寻找能取而代之的、更加特异，更加安全的变态反应原方面进行了许多有益的尝试，在众多研究中，结核分支杆菌38KDa蛋白倍受关注。
结核分支杆菌38KDa蛋白是结核分支杆菌主要的免疫原，具有较强的免疫活性。Wilkinson等英国、丹麦、意大利、印度、德国等国家学者合作研究，于1997年报道，用38KDa蛋白作豚鼠DTH变态反应原试验，其效果优于17KDa、19KDa、24KDa和32KDa蛋白，其效力与PPD基本相似。该38KDa蛋白诱发由结核分支杆菌、BCG(卡介苗)和胞内分支杆菌致敏豚鼠产生DTH，而与鸟分支杆菌、堪萨斯分支杆菌、瘰疠分支杆菌不发生或仅发生极轻微的反应[Wilkinson et al，Journal of Clinical Microbiology 1997]。尽管这种38KDa蛋白有较好的变态反应原特性，但存在的问题是结核分支杆菌合成38KDa蛋白少，仅占总蛋白的千分之一。由于通过结核分支杆菌获取38KDa蛋白产量低且需要大量培养和操作有毒菌种，存在传染人的危险，因此，研究工作者投入了大量的实验研究，通过基因工程技术发酵大肠杆菌生产重组38KDa蛋白。目前，虽然通过基因工程生产38KDa蛋白已使其产量大大增加，例如，M.Singh等通过重组大肠杆菌K-12菌株CAG629[pMS9-2]制备了重组Ag38蛋白，重组蛋白的表达量达到了总细胞蛋白的10％，但这样的表达量远远不能满足临床结核病诊断和结核病流行病学调查的需要，影响了该蛋白在结核病领域中的实际应用。
目前极需要找到一种既能大量生产，又具有良好特异性，而且更加安全的结核分支杆菌变态反应原，克服人们长期以来渴望解决的结核病诊断和筛选方面所存在的问题。
本发明通过大量研究，发现了一种特定序列的核苷酸，用具有该核苷酸序列的核酸构建重组表达载体后导入原核宿主细胞，如大肠杆菌中表达，可使重组蛋白表达量成倍增加，达到占总细菌蛋白的36％。而且，表达后的蛋白通过动物试验和临床试验证实，其有良好的变态反应原效力和高度的特异性，并且副反应极小。

发明内容
发明简述本发明公开了一种编码结核分支杆菌蛋白的如序列2所示的核苷酸序列，利用该核苷酸序列制备结核分支杆菌蛋白的方法，以及由该方法制备的结核分支杆菌蛋白。
本发明的结核分支杆菌蛋白由序列2所示核苷酸序列的核酸表达。所表达的蛋白的氨基酸序列如序列3所示。
本发明如序列2所示的核苷酸序列可以插入适合在原核宿主细胞中表达的载体中构建成表达载体，从而在原核宿主细胞中表达。优选的原核细胞表达载体为PET9d、PET22b(+)或PET15b质粒；优选的原核宿主细胞为大肠杆菌，更优选为BL21(DE3)或HMS174(DE3)。
本发明利用序列2所示核苷酸序列通过基因工程方法制备结核分支杆菌蛋白可通过如下步骤实现1)获得具有序列2所示的多核苷酸序列；2)将该多核苷酸序列导入质粒，优选PET9d、PET22b(+)或PET15b质粒；3)将该质粒导入原核宿主细胞，优选，大肠杆菌宿主细胞，更优选BL21(DE3)或HMS174(DE3)中；4)在有利于所述多核苷酸序列表达的条件下培养所述宿主细胞；和5)回收、纯化及复性所表达的重组蛋白。
本发明还涉及包含本发明结核分支杆菌蛋白的组合物以及试剂盒。所述组合物可作为结核病诊断以及结核病流行病学调查和监测试剂，用于临床结核病的诊断和结核病流行病学的调查、筛选和监测。
所述蛋白或组合物也可制备成结核病诊断试剂盒或结核病流行病学调查筛选试剂盒，方便地用于临床结核病的诊断和结核病流行病学的调查、筛选和监测。
本发明涉及到一种新的结核病诊断方法以及结核病流行病学调查和监测方法，该方法包括利用包含本发明的结核分支杆菌蛋白的试剂或试剂盒，通过皮肤试验，或血清学试验来诊断结核病患者，或筛选出结核病疑似患者。因此，本发明还涉及了包含本发明结核分支杆菌蛋白的结核病皮肤诊断或流行病学调查和监测的试剂或试剂盒，以及包含本发明结核分支杆菌蛋白的结核病血清学诊断或流行病学调查和监测的试剂或试剂盒。
本发明的结核分支杆菌蛋白作为结核杆菌变态反应原，通过动物及临床试验证实具有良好的免疫原效力，并且还具有特异性强、副作用小的特点。因此，本领域技术人员可以想到，本发明的结核分支杆菌蛋白可用来制备结核分支杆菌疫苗，如亚单位疫苗等。同样，本发明所公开的如序列2所示的核苷酸序列也可用来制备DNA疫苗，用以预防结核病。因此，本发明还涉及包含本发明结核分支杆菌蛋白或核酸的结核分支杆菌疫苗。
发明详述本发明公开了一种编码结核分支杆菌蛋白的如序列2所示的核苷酸序列，利用该核苷酸序列制备结核分支杆菌蛋白的方法，由该方法制备的包含序列3所示氨基酸序列的结核分支杆菌蛋白，以及包含该蛋白的组合物和试剂盒，同时还公开了它们在结核病诊断和结核病流行病学调查监测中的应用。另外，本发明的结核分支杆菌蛋白及本发明的核酸还可用于结核分支杆菌疫苗的制备。
本发明的一个实施方案涉及一种编码结核分支杆菌蛋白的如序列2所示的核苷酸序列。碱基的编号为常规的5’至3’顺序(翻译链的起始密码至终止密码顺序)。
序列2所示核酸序列可通过本领域常规的方法制备，优选根据Pab基因序列，如序列1(碱基的编号为常规的5’至3’顺序)所示的核苷酸序列，设计合成一对PCR引物，优选序列4和5所示序列的引物进行扩增，对扩增产物进行如下突变1.使其缺失5’端1-72位碱基；2.将第76-78位碱基TCG突变为TCT；3.使终止密码为TAA。
多核苷酸序列结构的改变影响核酸高级结构例如二级结构，从而影响该核酸在宿主细胞中的表达水平。本发明发现，具有如上所述结构的核酸分子在用适当载体和宿主细胞表达时可大大提高表达产率。
本发明的一个实施方案涉及应用如序列2所示的核苷酸序列制备结核分支杆菌蛋白的方法。根据常规方法，可将含编码本发明结核分支杆菌蛋白的如序列2所示核苷酸序列的cDNA或DNA核酸分子连接到一表达载体中，然后通过常规方法转化细胞。转化是指作为染色体外成份或者经过染色体整合将DNA导入生物以便该DNA能够复制。根据所用的宿主细胞，使用适合于该细胞的标准技术进行转化。Cohen，美国国家科学院院报，692110(1972)和Mandel等，分子生物学杂志，53154(1970)所述的采用氯化钙的钙处理一般用于原核或其它含有大量细胞壁障碍的细胞。
通常，优选原核生物用于DNA序列的起始克隆和用于本发明的载体构建。例如，大肠杆菌，枯草芽孢杆菌等芽孢杆菌和诸如鼠伤寒沙门氏菌或粘质沙雷氏菌等肠杆菌科其它细菌，和假单胞菌属的各种细菌。
一般来说，含有与原核宿主细胞相适合的复制子和调控序列的质粒载体都能与所述宿主结合使用。但优选编码本发明蛋白的DNA序列插入到PET9d、PET22b(+)或PET15b(+)载体形成重组表达载体。编码本发明蛋白的核酸与PET9d、PET22b(+)或PET15b(+)形成的杂合质粒具有高度的稳定性，有利于本发明目的蛋白的表达。
结核分支杆菌的启动子不能被大肠杆菌RNA聚合酶识别，T7噬菌体RNA聚合酶只能识别T7噬菌体启动子，所以选择T7噬菌体启动子应选择能编码T7噬菌体RNA聚合酶的宿主菌才能实现表达。理论上含有(DE3)溶源菌，并在表达蛋白前不产生T7噬菌体RNA聚合酶的宿主菌均可选择，例如，HMS174(DE3)，JM109(DE3)，BL21(DE3)均能高效表达本发明目的蛋白，但优选HMS174(DE3)和BL21(DE3)，这两种宿主细胞表达本发明目的蛋白的产量更高，而且其生长速度快，有利于提高生产效率。
在本发明的优选实施方案中，如图1所示，制备含有序列2所示多核苷酸序列的核酸分子和PET9d质粒的表达构建体，并将该构建体转化BL21(DE3)，经IPTG诱导培养4-5小时后，收集菌体。目的蛋白表达量经凝胶光密度扫描定量测定，结果占全菌体蛋白的36％-40％，所得目的蛋白经质谱法检测，分子量为35.8KDa。
可采用常规的纯化方法纯化所得到的蛋白，并使其复性。已知的纯化方法包括，例如离子交换剂进行的吸附和脱附、超速离心、凝胶过滤、亲合层析或特异性纯化方法。纯化后的本发明蛋白可用包括，例如，二硫苏糖醇或二巯基乙醇在内的常规还原剂复性。
本发明的一个实施方案涉及用上述方法制备、纯化、复性的结核分支杆菌蛋白，该蛋白具有序列3所示氨基酸序列。
本发明的一个实施方案涉及包含本发明结核分支杆菌蛋白的组合物和试剂盒。所述组合物或试剂盒可制备成结核病诊断及结核病流行病学调查和监测试剂或试剂盒形式。
本发明的一个实施方案涉及包含本发明结核分支杆菌蛋白的结核病诊断及结核病流行病学调查和监测试剂。在该产品中，本发明蛋白可以干燥粉末形式存在，在使用前稀释至所需浓度；也可以一定浓度的溶液形式存在。包含本发明结核分支杆菌蛋白的结核病诊断及结核病流行病学调查和监测试剂可包括一个容器和位于该容器表面的或与该容器相关的标签或包装插页。适当的容器有瓶子，小瓶，注射器等。容器可由各种材料如玻璃或塑料制成。该容器可内含检测结核病的本发明蛋白的组合物，并具有无菌存取口(例如该容器可以是带有能通过皮内注射针穿刺的塞子的小瓶)。所述标签或包装插页说明所述包含本发明结核分支杆菌蛋白的组合物的使用方法和用途说明。另外，该产品还可进一步包括第二个容器，其中可含有可药用的缓冲剂，例如注射用的无菌水(BWFI)、磷酸缓冲盐、Ringer’溶液和葡萄糖溶液。还可包括满足用户需要的其它材料，如其它缓冲液、稀释剂，滤器，针头和注射器。
本发明的另一实施方案涉及含本发明的结核分支杆菌蛋白的结核病诊断及流行病学调查、筛选及监测的试剂盒，在临床上用于方便、快速和准确的诊断结核病，而且，在进行大规模的结核病流行病学调查和监测中该试剂盒更显其优势。
本文所述“试剂盒”是指利用本发明蛋白完成结核病检测而组配制成的成套试剂。该试剂盒用于诊断结核病，或用于结核病的流行病调查和监测。在该试剂盒中，包括一个容器，该容器内含有本发明结核分支杆菌蛋白。本发明的结核分支杆菌蛋白可以任何方便的、合适的包装方式进行包装。例如，如果其是冻干制剂，带弹性塞子的安瓿或小玻璃瓶可通常用作容器，以便经弹性塞子可注入液体来配制一定浓度的本发明蛋白溶液。无弹性可移动盖子的安瓿(如密封的玻璃)或带弹性塞子的安瓿最方便用于本发明结核分支杆菌蛋白的可注射形式。本发明试剂盒还可包括其它多个容器，其中可分别含有检测所用的标准品，抗体或经过标记的抗体、酶，底物或缓冲液等。在该试剂盒中，还包括标签和包装插页用以提供试剂盒的使用说明。还可包括符合用户需要的其它材料，如微量滴定板等等。
在用于结核病血清学辅助检测的试剂盒中，本发明的结核分支杆菌蛋白也可以是经过标记的。具体可使用酶、荧光物质、发光物质、放射性物质、金属螯合物等标记。优选的标记性酶例如，过氧化物酶，碱性磷酸酶，β-D-半乳糖苷酶，苹果酸脱氢酶，葡萄球菌核酸酶，δ-5-类固醇异构酶，α-甘油磷酸脱氢酶，三糖磷酸异构酶，辣根过氧化物酶，天冬酰胺酶，葡萄糖氧化酶，核糖核酸酶，尿素酶，过氧化氢酶，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，葡糖淀粉酶，以及乙酰胆碱酯酶等。优选的荧光物质有，异硫氰酸荧光素，藻胆蛋白，罗丹明，藻红蛋白，藻蓝蛋白，别藻蓝蛋白，以及邻苯二醛。优选的发光物质有异鲁米诺，光泽精，鲁米诺，芳香族吖啶酯，咪唑，吖啶盐及其修饰型酯，萤光素，萤光素酶，和水母发光蛋白。优选的放射性物质有125I，127I，131I，14C，3H，32P，35S等。优选的金属物质有胶体金等。
与上述标记物结合的方法是已知的。具体可使用直接和间接标记法。常用的直接标记法是，将本发明蛋白与标记物通过一种交联剂以化学共价键结合。交联剂有N，N’-邻亚苯基二马来酰亚胺，4-(N-马来酰亚氨甲基)环己酸N-琥珀酰亚氨酯，6-马来酰亚氨己酸N-琥珀酰亚氨酯，4，4’-二硫代吡啶，及其它已知的交联剂。间接标记法的实例有，将本发明蛋白与低分子量半抗原如生物素、二硝基苯、吡哆醛、或荧光胺结合，以及将本发明蛋白用半抗原的结合配对物间接标记。抗生物素蛋白和链霉抗生物素蛋白可作为生物素的识别配体使用。
当标记物为酶时，其底物和显色剂可用于测定其活性。当使用过氧化物酶时，以H2O2作为底物溶液，并以2，2’-连氮-双-[3-乙基苯并噻唑啉磺酸]铵盐(ABTS)、5-氨基水杨酸、邻苯二胺、4-氨基氨替比林、或3，3’，5，5’-四甲基联苯胺等作为显色剂。当使用碱性磷酸酶时，可用邻硝基苯磷酸、对硝基苯磷酸等作为底物。当使用β-D-半乳糖苷酶时，可使用荧光素-二-(β-D-半乳吡喃糖苷)、4-甲基伞形基(umbelliferyl)-β-D-半乳吡喃糖苷等作为底物。
本发明的一个实施方案涉及应用包含本发明结核分支杆菌蛋白的试剂或试剂盒对个体，例如结核病疑似患者、疫区人群或有可能感染结核杆菌的个体进行检测，以辅助结核病的诊断或筛选出可疑患者。
在一个实施方案中，本发明涉及一种新的结核病诊断或流行病学调查监测方法，所述诊断或流行病学调查和监测通过应用包含本发明结核分支杆菌蛋白的试剂或试剂盒，采用常规的血清学方法来实现，例如，可以使用包含本发明的结核分支杆菌蛋白的试剂或试剂盒检测血清、脑脊液等体液中的抗结核分支杆菌抗体。检测抗结核分支杆菌抗体的方法有间接试验，如将本发明结核分支杆菌蛋白抗原吸附于固相载体，然后加入待检血清，如有相应抗体存在，则与抗原在载体上形成抗原-抗体复合物，洗涤后加入酶标抗抗体或胶体金标记抗抗体，显色观察结果。所述的间接试验方法例如ELISA法、斑点酶免疫渗滤法、斑点金标免疫渗滤法等。或者，血清学检测可使用夹心法，例如，使待检样品与结合至不溶性载体的本发明活性蛋白和标记的本发明蛋白反应，检测该反应产生的夹心复合物中的抗体量。或者还可用竞争试验来进行抗结核分支杆菌抗体的检测，例如，使标记的抗结核分支杆菌抗体与样品中的抗结核分支杆菌抗体和本发明蛋白竞争性反应，根据与本发明蛋白反应的标记的抗结核分支杆菌抗体的量来确定样品中的抗结核分支杆菌抗体的量。样品中抗结核分支杆菌抗体的效价高于对照1-4倍，优选2-3倍，更优选2倍，在临床上对结核病有辅助诊断意义，在结核病流行病学调查方面有监控意义。
任何生物学样品，如血浆、血清、血液、尿液、组织液、或脑脊液等体液，只要它们含有抗结核分支杆菌抗体，就可用本发明蛋白，包含该蛋白的组合物或试剂盒来检测。
在一个实施方案中，本发明涉及一种新的结核病诊断或流行病学调查监测方法，所述诊断或流行病学调查和监测通过应用包含本发明结核分支杆菌蛋白的试剂或试剂盒，采用例如结核病常用的皮内接种皮肤试验来进行结核病的辅助诊断，或进行结核病的流行病学调查和监测。例如，本发明的蛋白可通过例如，可用Motouw法，灭菌1ml一次性注射器，吸取0.1ml本发明结核分支杆菌蛋白于左前臂掌侧1/3处皮内注射，见有皮丘证明注射成功。于注射后24小时测量注射局部红晕或皮下硬结的横、纵径(mm)。注射局部红晕(或硬结)的平均横、纵直径≥5mm为阳性，平均直径＜5mm或无反应(以0表示)为阴性。在结核病的流行病学调查中，健康人群皮内接种皮肤试验试剂后，对皮肤试验反应阳性特别是强阳性的健康人群是结核病预防需要监控的主要人群。
在上述结核病血清学检测和皮肤检测试验中所用到的包含本发明结核分支杆菌蛋白的所有试剂或试剂盒都包括在本发明的范围内。


图1显示重组质粒酶切图。表达质粒双酶切可见约1.1kb片段的目的基因和约4.5kb的线性质粒DNA；单酶切表达质粒只见约为5.6kb片段，编码蛋白的DNA序列在准确的酶切位点与载体连接成功，重组质粒中含有预表达蛋白的基因，且插入的外源基因大小与理论一致。
图2-A-图2-B为DNA序列图。该图显示DNA序列与设计完全符合，突变位点序列正确，与基因组互补部分与基因组DNA序列完全一致。
图3显示重组工程菌SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图。该图显示工程菌在IPTG诱导条件下表达重组蛋白，工程菌不经IPTG诱导几乎不表达重组蛋白。
图4显示工程菌表达重组蛋白表达量。IPTG诱导工程菌全菌体蛋白凝胶电泳扫描显示，目的蛋白占总菌体蛋白的36％，图中峰14是本发明目的重组蛋白。
图5为本发明重组蛋白的纯化结果。包涵体溶解液经两次阴离子柱层析获得纯度较高的重组蛋白。层析纯化时，蛋白上样量为10μg。纯化后经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定呈一条带。
图6为本发明蛋白的氨基酸组成分析图，插入载体中的基因编码蛋白时框架准确，未发生移码，氨基酸组成与理论一致，表明本发明结核分支杆菌蛋白核酸分子在大肠杆菌中获得表达。
图7为N端测序图。N端序列表明ATG编码的甲硫氨酸被大肠杆菌中的酶酶解掉，N端氨基酸序列完全准确；进一步表明基因编码蛋白时框架准确未发生移位。
具体实施方案在下文中，本发明参考实施例进行具体阐述，但这些实施例不构成对本发明的限制。
实施例1本发明结核分支杆菌蛋白的制备根据Pab基因序列，通过PCR技术对Pab基因进行突变，作者设计合成了一对PCR引物。上游引物a1长37个碱基，如序列4所示，5’端设计了保护碱基和NCOI酶切位点(含起始密码ATG)，下游引物a2长34个碱基，如序列5所示，5’端设计BamHI酶切位点和终止密码TAA。以结核分支杆菌H37Rv基因组DNA为模板，通过高保真的DNA聚合酶PCR技术获得编码本发明蛋白的多核苷酸(其中5‘端碱基序列为ATGGGCTCT-(序列1)或ATGGGCTCA-(序列2)，其中最末的碱基由原碱基G突变而来。此引物的PCR扩增产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳，紫外检测呈现特异扩增条带，约为1050bp，符合设计要求。PCR产物已去掉N端编码24个氨基酸的三联密码(72个碱基)、原编码第26位氨基酸的三联密码TCG突变为TCT、终止密码为TAA。
多核苷酸和表达载体经NCOI和BamHI酶切后经经1.0％琼脂糖凝胶电泳分离，切割含DNA条带的琼脂块，并按DNA快速纯化试剂盒说明书回收DNA。回收的多核苷酸和PET9d质粒表达载体在T4DNA连接酶作用下连接成重组杂合质粒，重组杂合质粒转化感受态大肠杆菌JM109，通过挑选重组大肠杆菌菌落筛选和鉴定含重组杂合质粒的大肠杆菌杆菌JM109，要求重组杂合质粒的单酶切和双酶切图谱符合图1。重组杂合质粒中插入的目的基因经DNA全自动测序证明序列与设计完全符合。目的基因序列正确的重组杂合质粒转化表达宿主菌BL21(DE3)，该重组大肠杆菌培养至光密度为0.6-0.8时，加入0.4mmol/L IPTG诱导培养，诱导4-5小时，收集菌体。在此诱导培养条件下，目的蛋白表达量经凝胶光密度扫描占全菌体蛋白的36％-40％。本发明蛋白通过核酸序列的改变和载体与宿主细胞的选择实现了高效表达。
实施例2本发明结核分支杆菌蛋白的纯化、复性和鉴定菌体加入裂解缓冲液(1g细菌加3ml裂解缓冲液)悬浮菌体。超声破碎细菌，功率200W，超声20秒，间隙20秒，共超声80次；4℃、12000rpm离心15分钟，弃上清，沉淀分别用含1％Triton-X100洗涤2-3次。20mmol/LTris.Cl/8M尿素(pH8.0)溶解包涵体，4℃、12000rpm离心15min，收集上清。
包涵体溶解上清液上样于处理好的DEAE-52阴离子交换柱。上样完毕，用20mmol/L Tris.Cl/8 M尿素(pH8.0)充分洗去未结合的蛋白，然后0-0.3MNaCl梯度洗脱，同时收集蛋白SDS-PAGE电泳检测洗脱峰对应收集管的溶液，含目的蛋白的收集管合并透析脱盐后，再过QFF阴离子柱，0-0.5M NaCl梯度洗脱，SDS-PAGE检测洗脱峰，含目的蛋白较多且较纯的收集管合并，透析除盐复性。复性过程缓冲液为20mmol/L Tris.Cl/6M尿素(pH8.0)、4℃透析过夜；缓冲液为20mmol/L Tris.Cl/3 M尿素(pH8.0)、4℃透析过夜；缓冲液为20mmol/L Tris.Cl(pH8.0)、4℃透析2天。所有液体中均含5mM巯基乙醇。通过初步降低缓冲液尿素浓度，从而缓慢去掉蛋白中的尿素而达到复性。
整个纯化工作是在LKB层析系统仪器上完成。
纯化蛋白经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，凝胶光密度扫描显示该蛋白纯度接近96％左右，HPLC纯度测定显示纯度也接近96％。
质谱法测定重组蛋白分子量表明本发明蛋白分子量为35.8KDa。
N端氨基酸序列分析由北京大学完成，该蛋白N末端15个氨基酸依次是甘氨酸(G)-丝氨酸(S)-赖氨酸(K)-脯氨酸(P)-脯氨酸(P)-丝氨酸(S)-甘氨酸(G)-丝氨酸(S)-脯氨酸(P)-谷氨酸(E)-苏氨酸(T)-甘氨酸(G)-丙氨酸(A)-甘氨酸(G)-丙氨酸(A)。N端结果证明起始氨基酸正确、编码氨基酸三联密码正确。
等电点测定为5.64。
氨基酸组成与多肽序列相符。
肽质量指纹图谱分析表明本发明多肽赖氨酸和精氨酸在多肽序列中位置是准确的，从而间接证明多肽结构是准确的。编码该蛋白的起始密码ATG编码的甲硫氨酸不在编码的蛋白框架内。本发明蛋白的氨基酸组成表明，该蛋白是一种新的结核分支杆菌蛋白。
实施例3本发明结核分支杆菌蛋白用于皮肤变态反应原的豚鼠试验豚鼠DTH试验100只300-350g豚鼠随机分成两组，80只豚鼠于皮下注射灭活的结核杆菌H37Rv 0.2ml，注射后4周进行DTH试验。对照组豚鼠注射0.2ml生理盐水。所有豚鼠背部去毛，于脊椎两侧背部相应部位分别皮内注射0.1ml本发明蛋白和0.1ml PPD(要求注射部位出现皮丘为准)，注射后24小时和48小时检测注射部位的红晕或硬结横、纵直径(mm)，注射局部红晕(或硬结)横、纵平均直径≥5mm为阳性，平均直径＜5mm或无反应(以0表示)为阴性，结果见表1。
表1本发明蛋白用于结核杆菌致敏的豚鼠DTH试验结果


本发明蛋白诱导DTH平均硬结与PPD比值为0.93，结果表明重组蛋白诱导致敏豚鼠产生与PPD相当的DTH反应。
豚鼠DTH特异性试验不同分支杆菌致敏豚鼠，然后进行DTH试验。结果如表2所示。
表2本发明结核分支杆菌蛋白皮试变态反应原免疫特异性检测结果

注直径大小平均值/累积值；/未检测表2结果表明本发明蛋白与人型PPD与结核分支杆菌致敏豚鼠均呈阳性反应，本发明蛋白与堪萨斯分支杆菌和偶发分支杆菌致敏豚鼠无交叉反应、与卡介苗致敏豚鼠和瘰疬分支杆菌致敏豚鼠阳性反应率低于人型PPD。
以上试验表明大肠杆菌表达的本发明重组蛋白具有良好的变态反应原效力性，诱导结核分枝杆菌致敏豚鼠产生的DTH反应与PPD相当，但特异性远高于PPD。
实施例4本发明结核分支杆菌蛋白用于皮肤变态反应原的临床试验临床试验入选肺结核患者必需经过临床确诊。同体双臂Motouw法，即灭菌1ml一次性注射器，吸取0.1ml PPD于右前臂掌侧1/3处皮内注射，见有皮丘证明注射成功。另取1ml一次性注射器，吸取0.1ml本发明蛋白于左前臂掌侧1/3处皮内注射，见有皮丘证明注射成功。于注射后24小时和48小时双盲判读结果，注射局部红晕(或硬结)横、纵平均直径≥5mm为阳性，平均直径＜5mm或无反应(以0表示)为阴性。510例肺结核病人皮肤试验结果如表3所示。
表3肺结核病人皮肤试验反应结果

表3表明本发明蛋白皮肤试验结果以24-48小时观察，24小时本发明蛋白皮肤试验阳性反应率与48小时PPD皮肤试验阳性反应率相当(X2＝3.07，P＞0.05)。
上述试验证明，本发明蛋白用于结核病皮试诊断反应阳性率与PPD相当，能满足临床需要，并未见任何副反应。相反，用PPD检测，5.9％的肺结核病人PPD皮肤试验出现水泡或淋巴管炎。
实施例5本发明结核分支杆菌蛋白用于血清诊断ELISA法检测291份血清本发明蛋白每孔包被0.2-1μg，PPD包被0.2-1μg，对照孔加入包被液。该试验所用包被液为2.94g/L NaHCO3和1.50g/L Na2CO3。包被2小时以上，弃去液体，然后用PBST洗板3次，每次3分钟。样品稀释液(含0.1％BSA的PBST)1∶100稀释待检血清样品，每孔加100μl，37℃1小时，同前洗板3次。用样品稀释液(含0.1％BSA的PBST)按要求稀释HRP标记的二抗兔抗人IgG，每孔加100μl，37℃1小时，同前洗板3次，每孔加100μ1显色液(柠檬酸和磷酸二氢纳缓冲液溶解DAB，临用前加H2O2)显色，加2M硫酸2滴终止反应，酶标仪上测量各孔490nm波长处OD。大于对照OD值2倍为阳性。29l份血清ELISA检测结果见表4。
表4 重组蛋白用ELISA法检测血清的结果


表中结果表明本发明蛋白用于肺结核病人血清检测敏感性与PPD相当，但特异性高于PPD，特别是受BCG接种影响明显低于PPD，这对BCG计划接种的国家采用结核病血清学诊断具有重要意义。
实施例5本发明结核分支杆菌蛋白用于脑脊液诊断斑点酶免疫渗滤法(DIEFA)快速检测CSF抗体取合适浓度的本发明蛋白0.1ml点膜、膜干燥后封闭、加CSF、洗膜、加酶标二抗、洗膜、显色。凡是膜上出现黑色着色斑点判为阳性。整个操作在15分钟内完成。130份脑脊液样品用DIEFA检测，结果见表5。
表5本发明结核分支杆菌蛋白用于脑脊液诊断的结果

表5显示，本发明蛋白结核病人脑脊液检测阳性率达55％，特异性达97％。建立快速检测脑脊液中的结核抗体，可为结核性脑膜炎快速诊断提供辅助手段。
表4和5结果表明重组蛋白用于抗体检测敏感性较高，并具有较高的特异性。
序列表<110>庄，玉辉何，秀云张，小刚<120>用于结核病诊断的结核分支杆菌蛋白<130>PLMD4562N<160>5<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1125<212>DNA<213>结核分支杆菌H37Rv(Mycobacterium tuberculosis H37Rv)<400>1gtgaaaattc gtttgcatac gctgttggcc gtgttgaccg ctgcgccgct gctgctagca 60gcggcgggct gtggctcgaa accaccgagc ggttcgcctg aaacgggcgc cggcgccggt 120actgtcgcga ctacccccgc gtcgtcgccg gtgacgttgg cggagaccgg tagcacgctg 180ctctacccgc tgttcaacct gtggggtccg gcctttcacg agaggtatcc gaacgtcacg 240atcaccgctc agggcaccgg ttctggtgcc gggatcgcgc aggccgccgc cgggacggtc 300aacattgggg cctccgacgc ctatctgtcg gaaggtgata tggccgcgca caaggggctg 360atgaacatcg cgctagccat ctccgctcag caggtcaact acaacctgcc cggagtgagc 420gagcacctca agctgaacgg aaaagtcctg gcggccatgt accagggcac catcaaaacc 480tgggacgacc cgcagatcgc tgcgctcaac cccggcgtga acctgcccgg caccgcggta 540gttccgctgc accgctccga cgggtccggt gacaccttct tgttcaccca gtacctgtcc 600
aagcaagatc ccgagggctg gggcaagtcg cccggcttcg gcaccaccgt cgacttcccg660gcggtgccgg gtgcgctggg tgagaacggc aacggcggca tggtgaccgg ttgcgccgag720acaccgggct gcgtggccta tatcggcatc agcttcctcg accaggccag tcaacgggga780ctcggcgagg cccaactagg caatagctct ggcaatttct tgttgcccga cgcgcaaagc840attcaggccg cggcggctgg cttcgcatcg aaaaccccgg cgaaccaggc gatttcgatg900atcgacgggc ccgccccgga cggctacccg atcatcaact acgagtacgc catcgtcaac960aaccggcaaa aggacgccgc caccgcgcag accttgcagg catttctgca ctgggcgatc 1020accgacggca acaaggcctc gttcctcgac caggttcatt tccagccgct gccgcccgcg 1080gtggtgaagt tgtctgacgc gttgatcgcg acgatttcca gctag 1125<210>2<211>1056<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>对人工序列的描述序列1的突变<400>2atgggctcta aaccaccgag cggttcgcct gaaacgggcg ccggcgccgg tactgtcgcg 60actacccccg cgtcgtcgcc ggtgacgttg gcggagaccg gtagcacgct gctctacccg120ctgttcaacc tgtggggtcc ggcctttcac gagaggtatc cgaacgtcac gatcaccgct180cagggcaccg gttctggtgc cgggatcgcg caggccgccg ccgggacggt caacattggg240gcctccgacg cctatctgtc ggaaggtgat atggccgcgc acaaggggct gatgaacatc300gcgctagcca tctccgctca gcaggtcaac tacaacctgc ccggagtgag cgagcacctc360aagctgaacg gaaaagtcct ggcggccatg taccagggca ccatcaaaac ctgggacgac420ccgcagatcg ctgcgctcaa ccccggcgtg aacctgcccg gcaccgcggt agttccgctg480caccgctccg acgggtccgg tgacaccttc ttgttcaccc agtacctgtc caagcaagat540cccgagggct ggggcaagtc gcccggcttc ggcaccaccg tcgacttccc ggcggtgccg600ggtgcgctgg gtgagaacgg caacggcggc atggtgaccg gttgcgccga gacaccgggc660tgcgtggcct atatcggcat cagcttcctc gaccaggcca gtcaacgggg actcggcgag720
gcccaactag gcaatagctc tggcaatttc ttgttgcccg acgcgcaaag cattcaggcc780gcggcggctg gcttcgcatc gaaaaccccg gcgaaccagg cgatttcgat gatcgacggg840ccggccccgg acggctaccc gatcatcaac tacgagtacg ccatcgtcaa caaccggcaa900aaggacgccg ccaccgcgca gaccttgcag gcatttctgc actgggcgat caccgacggc960aacaaggcct cgttcctcga ccaggttcat ttccagccgc tgccgcccgc ggtggtgaag 1020ttgtctgacg cgttgatcgc gacgatttcc agctaa 1056<210>3<211>350<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>对人工序列的描述重组的<400>3Gly Ser Lys Pro Pro Ser Gly Ser Pro Glu Thr Gly Ala Gly Ala Gly1 5 10 15Thr Val Ala Thr Thr Pro Ala Ser Ser Pro Val Thr Leu Ala Glu Thr20 25 30Gly Ser Thr Leu Leu Tyr Pro Leu Phe Asn Leu Trp Gly Pro Ala Phe35 40 45His Glu Arg Tyr Pro Asn Val Thr Ile Thr Ala Gln Gly Thr Gly Ser50 55 60Gly Ala Gly Ile Ala Gln Ala Ala Ala Gly Thr Val Asn Ile Gly Ala65 70 75 80Ser Asp Ala Tyr Leu Ser Glu Gly Asp Met Ala Ala His Lys Gly Leu85 90 95Met Asn Ile Ala Leu Ala Ile Ser Ala Gln Gln Val Asn Tyr Asn Leu100 105 110
Pro Gly Val Ser Glu His Leu Lys Leu Asn Gly Lys Val Leu Ala Ala115 120 125Met Tyr Gln Gly Thr Ile Lys Thr Trp Asp Asp Pro Gln Ile Ala Ala130 135 140Leu Asn Pro Gly Val Asn Leu Pro Gly Thr Ala Val Val Pro Leu His145 150 155 160Arg Ser Asp Gly Ser Gly Asp Thr Phe Leu Phe Thr Gln Tyr Leu Ser165 170 175Lys Gln Asp Pro Glu Gly Trp Gly Lys Ser Pro Gly Phe Gly Thr Thr180 185 190Val Asp Phe Pro Ala Val Pro Gly Ala Leu Gly Glu Asn Gly Asn Gly195 200 205Gly Met Val Thr Gly Cys Ala Glu Thr Pro Gly Cys Val Ala Tyr Ile210 215 220Gly Ile Ser Phe Leu Asp Gln Ala Ser Gln Arg Gly Leu Gly Glu Ala225 230 235 240Gln Leu Gly Asn Ser Ser Gly Asn Phe Leu Leu Pro Asp Ala Gln Ser245 250 255Ile Gln Ala Ala Ala Ala Gly Phe Ala Ser Lys Thr Pro Ala Asn Gln260 265 270Ala Ile Ser Met Ile Asp Gly Pro Ala Pro Asp Gly Tyr Pro Ile Ile275 280 285Asn Tyr Glu Tyr Ala Ile Val Asn Asn Arg Gln Lys Asp Ala Ala Thr290 295 300Ala Gln Thr Leu Gln Ala Phe Leu His Trp Ala Ile Thr Asp Gly Asn305 310 315 320Lys Ala Ser Phe Leu Asp Gln Val His Phe Gln Pro Leu Pro Pro Ala325 330 335Val Val Lys Leu Ser Asp Ala Leu Ile Ala Thr Ile Ser Ser340 345 350
<210>4<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>对人工序列的描述上游引物<400>4cgcatgccat gggctctaaa ccaccgagcg gttcgcc 3718<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>对人工序列的描述下游引物<400>5cgggatccaa tgctggaaat cgtcgcgatc aacg 3权利要求
1.一种核酸，其具有如序列2所示的核苷酸序列。
2.一种结核分支杆菌蛋白的基因工程重组制备方法，其特征在于应用权利要求1的核酸构建表达载体，并在该载体所适合的原核宿主细胞中表达权利要求1所述核酸编码的结核分支杆菌蛋白。
3.权利要求2的方法，其中所述表达载体为PET9d、PET22b(+)或PET15b质粒。
4.权利要求2的方法，其中所述宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)或HMS174(DE3)。
5.根据权利要求2至4中任一项所述的方法制备的结核分支杆菌蛋白。
6.包含权利要求5的结核分支杆菌蛋白的组合物。
7.权利要求6所述的组合物，其为结核病诊断试剂。
8.权利要求6所述的组合物，其为结核病流行病学调查监测试剂。
9.包含权利要求5的结核分支杆菌蛋白的试剂盒。
10.权利要求9的试剂盒，其为结核病诊断及结核病流行病学调查监测试剂盒。
全文摘要
本发明涉及一种可用于结核病诊断和结核病流行病学调查和监测的结核分支杆菌蛋白，编码该多肽的多核苷酸，包含该多核苷酸的杂合质粒和原核宿主细胞。本发明还包括制备该蛋白的方法。
文档编号C12N15/11GK1696289SQ200410044568
公开日2005年11月16日 申请日期2004年5月11日 优先权日2004年5月11日
发明者庄玉辉, 何秀云, 张小刚 申请人:中国人民解放军第三○九医院