专利名称：Y染色体细微缺失诊断试剂和对其进行pcr扩增的方法
技术领域：
本发明涉及一种用于诊断Y染色体细微缺失的试剂和对该试剂进行PCR扩增的方法。
背景技术：
目前，世界范围内有15％的育龄夫妇患者患有不孕不育症，其中男性不育的因素约占40％，影响男性不育的一个重要原因是遗传因素(基因和染色体异常)，其中由于基因异常导致不育的占男性不育中的10～15％。有文献报道90％的男性不育症是由于生精功能障碍引起的，其中特发性生精障碍占60％，半数以上属原因不明者，而Y染色体正常与否起着至关重要的作用，因此研究Y染色体的相关基因有重要的临床价值，在少精症和无精症的男性患者中，Y染色体微缺失占20.5％，据对Y染色体遗传序列的研究证实，Y染色体上微缺失是引起男子不育的主要原因之一。近几年研究表明，大约15％的无精症患者及5～10％少精症患者表现有Y染色体长臂的缺失。Y染色体容易缺失，因为它含有重复序列的长区域。但一般情况下Y染色体的微缺失常规染色体检查难以确定，只能通过分子检测发现。因此，查出病因，尤其是发病的分子生物学基础尤为重要。这些缺失位于AZFa、AZFb和AZFc，这些区域含有无精子基因(azoospermia factor，AZF)，控制精子的产生。通过PCR确定AZFa、AZFb和AZFc这些区域，如果PCR反应无产物，即有缺失存在。不同的人缺失的长度不同，一般缺失的是AZFa，AZFa和AZFb，AZFc，AZFb和AZFc，AZFa、AZFb和AZFc，单纯AZFb缺失很少见或从未见到。无精、少精和不育男子通过这项检测可以知道不育的生物学基础。该病无法治愈，如果他们通过ICSI获得孩子，他们的孩子将会同样的Y缺失。因此，检测Y染色体细微缺失有重要的临床价值。目前国内实验室用细胞遗传学方法可以检测Y染色体大的缺失，但是没有稳定的分子遗传学检测试剂。
发明内容
本发明的目的是提供一种Y染色体细微缺失诊断试剂和对其进行PCR扩增的方法，它可以检测Y染色体大的缺失，具有稳定的分子遗传学检测试剂。在AZFa区域，检测sY87基因；在AZFb区域，检测sY143基因；在AZFc区域，检测ex2DAZ基因。所有检测可以在同一管内完成，同时选用染色体上男、女共有的基因RhE作为对照。本发明的Y染色体细微缺失诊断试剂由下述成分制成(1)用pH＝7～8的TE分别溶解下列引物干粉sY87-F、sY87-R、sY143-R、ex2DAZ-F、ex2DAZ-R、RhEY-F、RhEY-R，分别制成10pmol/μl的sY87-F、sY87-R、sY143-R、ex2DAZ-F、ex2DAZ-R、RhEY-F、RhEY-R溶液；(2)在24μl反应体系中分别加入如下成分0.2μl sY87-F、0.2μlsY87-R、0.175μl sY143-F、0.175μl sY143-R、0.1μl ex2DAZ-F、0.1μl ex2DAZ-R、0.075μl RhEY-F、0.075μl RhEY-R、2.5μl 10x缓冲液、25mM 1.5μl MgCl2溶液、dNTPs溶液2μl、0.125μl250U的Taq酶，加dH2O至24μl。对Y染色体细微缺失诊断试剂进行PCR扩增的方法为a、按照上述方法配制Y染色体细微缺失诊断试剂；b、然后向试剂内加入1μl DNA样本；c、在94℃对b步骤的Y染色体细微缺失诊断试剂进行预变性8分钟(激活Taq酶)；d、然后分别在94℃、50℃、72℃各变性1分钟；e、重复d步骤，共循环32次，最后将试剂盒冷却至15℃。本发明具有如下优点(1)本发明选择三个AZF区域的接近中心的位点进行实验，既可以筛选出造成生精障碍的患者，又避免了不必要的浪费，各个实验室所选择的目标序列(sequence tagged site，STS)及其数目不同，有的研究人员只选用一个位点，有的研究人员选用多个位点进行筛选；(2)本发明为国内填补了一项空白，它具有检验稳定、灵敏、快速的优点，而且实验成本仅为国外相关试剂盒价格的十分之一；(3)因为本项研究应用于临床，可以检测出许多以往查不出病因的无精与少精症男子的病因，由于AZF基因的缺失造成的不育是无法治疗的，而通过ICSI获得的孩子，他们的儿子将会有同样的Y染色体细微缺失，因此这项检测对提高人口素质，避免病残儿的出生有非常重要的临床价值。
图1为AZFa、AZFb、AZFc三个区域在Y染色体上的位置图，图2为电泳结果图，从左往右依次为孔道1为100bp分子量标准，孔道2为正常男性对照，孔道3为正常女性对照，孔道4为空白对照，孔道5为有DAZ缺失的患者，孔道6为有DAZ缺失的患者，孔道7-12为结果正常的患者，图3为电泳结果图，从左往右依次为孔道1为为正常男性对照，孔道2为正常女性对照，孔道3为空白对照，孔道4为有DAZ缺失的患者，孔道5为有SY87、SY143、DAZ缺失的患者。
具体实施例方式具体实施方式
一本实施方式的Y染色体细微缺失诊断试剂由下述成分制成(1)用pH＝7～8的TE分别溶解下列引物干粉sY87-F、sY87-R、sY143-R、ex2DAZ-F、ex2DAZ-R、RhEY-F、RhEY-R，分别制成10pmol/μl的sY87-F、sY87-R、sY143-R、ex2DAZ-F、ex2DAZ-R、RhEY-F、RhEY-R溶液；(2)在24μl反应体系中分别加入如下成分0.2μl sY87-F、0.2μl sY87-R、0.175μl sY143-F、0.175μl sY143-R、0.1μl ex2DAZ-F、0.1μl ex2DAZ-R、0.075μlRhEY-F、0.075μl RhEY-R、2.5μl 10x缓冲液、25mM 1.5μl MgCl2溶液、混合的dNTPs溶液2μl，加dH2O至24μl，此外，每个反应体系中加入0.125μl 250U的Taq酶。
其中检测sY87基因缺失的引物序列为上游5’-TAAAGCTCTGTTGCTTGAAAAGAGGG-3’，下游5’-TAGTGTGTAAATGGCACCATACATGACTA-3’；检测sY143区域内微小缺失的引物序列为上游5’-CCCCTGCAGGATGAGAAGCAGGTAG-3’，下游5’-AGCTGCCGTGTGCTGGAGACTAATC-3’；检测DAZ区域内微小缺失的引物序列为上游5’-CCATCTCCAGAGAGGCCAGCACCCAGT-3’，下游5’-TTGGCACGATTTTGCCTTCTGGTAACACC-3’；RhE的引物序列为上游5’-GGATGTTCTGGCCAAGTGTCAACTCT-3’，下游5’-TTTGGGGGTGAGCCAAGGATGACC-3’具体实施方式
二本实施方式是这样对Y染色体细微缺失诊断试剂进行PCR扩增的(1)用pH＝7～8的TE分别溶解下列引物干粉sY87-F、sY87-R、sY143-R、ex2DAZ-F、ex2DAZ-R、RhEY-F、RhEY-R，分别制成10pmol/μl的sY87-F、sY87-R、sY143-R、ex2DAZ-F、ex2DAZ-R、RhEY-F、RhEY-R溶液；
(2)在24μl反应体系中分别加入如下成分0.2μl sY87-F、0.2μl sY87-R、0.175μl sY143-F、0.175μl sY143-R、0.1μl ex2DAZ-F、0.1μl ex2DAZ-R、0.075μlRhEY-F、0.075μl RhEY-R、2.5μl 10x缓冲液、25mM 1.5μl MgCl2溶液、混合的dNTPs溶液2μl，加dH2O至24μl，此外，每个反应体系中加入0.125μl250U的Taq酶。
其中检测sY87基因缺失的引物序列为上游5’-TAAAGCTCTGTTGCTTGAAAAGAGGG-3’，下游5’-TAGTGTGTAAATGGCACCATACATGACTA-3’；检测sY143区域内微小缺失的引物序列为上游5’-CCCCTGCAGGATGAGAAGCAGGTAG-3’，下游5’-AGCTGCCGTGTGCTGGAGACTAATC-3’；检测DAZ区域内微小缺失的引物序列为上游5’-CCATCTCCAGAGAGGCCAGCACCCAGT-3’，下游5’-TTGGCACGATTTTGCCTTCTGGTAACACC-3’；RhE的引物序列为上游5’-GGATGTTCTGGCCAAGTGTCAACTCT-3’，下游5’-TTTGGGGGTGAGCCAAGGATGACC-3’(3)、然后向试剂内加入1μl DNA样本；(4)、在94℃对b步骤的Y染色体细微缺失诊断试剂进行预变性8分钟(激活Taq酶)；d、然后分别在94℃、50℃、72℃各变性1分钟；(5)、重复d步骤，共循环32次，最后将试剂冷却至15℃。
具体实施方式
二本实施方式是这样实现的一、配制Y染色体细微缺失诊断试剂(1)用pH＝7.5的TE分别溶解下列引物干粉sY87-F、sY87-R、sY143-R、ex2DAZ-F、ex2DAZ-R、RhEY-F、RhEY-R，分别制成10pmol/μl的sY87-F、sY87-R、sY143-R、ex2DAZ-F、ex2DAZ-R、RhEY-F、RhEY-R溶液；(2)在24μl反应体系中分别加入如下成分0.2μl sY87-F、0.2μl sY87-R、0.175μl sY143-F、0.175μl sY143-R、0.1μl ex2DAZ-F、0.1μl ex2DAZ-R、0.075μlRhEY-F、0.075μl RhEY-R、2.5μl 10x缓冲液、25mM 1.5μl MgCl2溶液、混合的dNTPs溶液2μl，加dH2O至24μl，此外，每个反应体系中加入0.125μl250U的Taq酶(采用AmpliTaq Gold的Taq酶)，其中10xPCR缓冲液由下述成分组成100mM Tris-HCl(pH＝8.3)、500mMKCl、15mM MgCl2、0.01％Gelatin；dNTPs是这样制得的将含320ul 10mM的A、T、C、G等量混合四种引物，充分混合后，每管中dATP的浓度是2.5mM，dCTP的浓度也应是2.5mM；其中检测sY87基因缺失的引物序列为上游5’-TAAAGCTCTGTTGCTTGAAAAGAGGG-3’，下游5’-TAGTGTGTAAATGGCACCATACATGACTA-3’；检测sY143区域内微小缺失的引物序列为上游5’-CCCCTGCAGGATGAGAAGCAGGTAG-3’，下游5’-AGCTGCCGTGTGCTGGAGACTAATC-3’；检测DAZ区域内微小缺失的引物序列为上游5’-CCATCTCCAGAGAGGCCAGCACCCAGT-3’，下游5’-TTGGCACGATTTTGCCTTCTGGTAACACC-3’；RhE的引物序列为上游5’-GGATGTTCTGGCCAAGTGTCAACTCT-3’，下游5’-TTTGGGGGTGAGCCAAGGATGACC-3’(3)取外周血(EDTA抗凝)，从中提取有核细胞，然后分离纯化DNA，然后取1μl DNA样本加入到(2)中的试剂中，准备用PCR方法扩增DNA。
常规实验是每次都要用正常男性和女性对照，也要用未加DNA的阴性对照，如果可能也要用已证实的异常的男性DNA作为阳性对照，但不是必须。
二、PCR扩增a、在94℃对上述Y染色体细微缺失诊断试剂进行预变性8分钟，以激活Taq酶；b、然后分别在94℃、50℃、72℃各变性1分钟；c、重复b步骤，共循环32次，最后将试剂盒冷却至15℃，恒温10分钟，然后放室温准备电泳。
三、电泳①配制12％聚丙烯酰胺凝胶，垂直点泳，其中12％聚丙烯酰胺凝胶是这样配制的i、配制100ml 40％聚丙烯酰胺取0.4g双丙烯酰胺、11.6g丙烯酰胺，然后加入超纯水至100ml，搅拌溶解；ii、配制2升10xTBE(原液)在1.5升超纯水中溶解下列试剂242.3gTris Base、111.3g硼酸、40ml 500mM EDTA二钠盐(pH8.0)，加超纯水至2升，充分混匀；iii、配制100ml 12％聚丙烯酰胺取30ml 40％聚丙烯酰胺、10ml 10xTBE，然后加入60ml超纯水，iv、配制1块12％聚丙烯酰胺凝胶10ml 12％聚丙烯酰胺、100μl 10％过硫酸胺、5μl TEMED；②向每管反应物中加入2μl溴酚蓝，充分混合；③每管取10μl反应物加于聚丙烯酰胺胶孔中，同时加100bp分子量标准，在电压为400V的条件下运行胶30分钟，或低电压长时间；④然后在0.5mg/L EB溶液中染胶5分钟，拍好照片后弃掉凝胶，照片结果如图2和图3。
正常男性对照有SY87、SY143、DAZ、RhE四条带，正常女性对照只有RhE一条带，空白对照没有带。确定男性对照有4条带，女性只有1条带；确定病人应有RhE带，如果没此带，结果无效。
预期带型为321bpSY143只男性有；167bpSY87 只男性有；137bpRhE 男女都有；87bp DAZ 只男性有。
权利要求
1.Y染色体细微缺失诊断试剂，其特征在于它由下述成分制成(1)用pH＝7～8的TE分别溶解下列引物干粉sY87-F、sY87-R、sY143-R、ex2DAZ-F、ex2DAZ-R、RhEY-F、RhEY-R，分别制成10pmol/μl的sY87-F、sY87-R、sY143-R、ex2DAZ-F、ex2DAZ-R、RhEY-F、RhEY-R溶液；(2)在24μl反应体系中分别加入如下成分0.2μl sY87-F、0.2μl sY87-R、0.175μl sY143-F、0.175μl sY143-R、0.1μl ex2DAZ-F、0.1μl ex2DAZ-R、0.075μl RhEY-F、0.075μlRhEY-R、2.5μl 10x缓冲液、25mM 1.5μl MgCl2溶液、混合的dNTPs溶液2μl，加dH2O至24μl，此外，每个反应体系中加入0.125μl250U的Taq酶。
2.根据权利要求1所述的Y染色体细微缺失诊断试剂，其特征在于所述检测SY87基因缺失的引物序列为上游5’-TAAAGCTCTGTTGCTTGAAAAGAGGG-3’，下游5’-TAGTGTGTAAATGGCACCATACATGACTA-3’
3.根据权利要求1所述的Y染色体细微缺失诊断试剂，其特征在于所述检测SY143区域内微小缺失的引物序列为上游5’-CCCCTGCAGGATGAGAAGCAGGTAG-3’，下游5’-AGCTGCCGTGTGCTGGAGACTAATC-3’
4.根据权利要求1所述的Y染色体细微缺失诊断试剂，其特征在于所述检测DAZ区域内微小缺失的引物序列为上游5’-CCATCTCCAGAGAGGCCAGCACCCAGT-3’，下游5’-TTGGCACGATTTTGCCTTCTGGTAACACC-3’
5.根据权利要求1所述的Y染色体细微缺失诊断试剂，其特征在于所述RhE的引物序列为上游5’-GGATGTTCTGGCCAAGTGTCAACTCT-3’，下游5’-TTTGGGGGTGAGCCAAGGATGACC-3’。
6.对Y染色体细微缺失诊断试剂进行PCR扩增的方法，其特征在于它是这样实现的a、配制Y染色体细微缺失诊断试剂(1)用pH＝7～8的TE分别溶解下列引物干粉sY87-F、sY87-R、sY143-R、ex2DAZ-F、ex2DAZ-R、RhEY-F、RhEY-R，制成10pmol/μl的sY87-F、sY87-R、sY143-R、ex2DAZ-F、ex2DAZ-R、RhEY-F、RhEY-R溶液；(2)在24μl上述反应体系中分别加入如下成分0.2μl sY87-F、0.2μl sY87-R、0.175μl sY143-F、0.175μl sY143-R、0.1μlex2DAZ-F、0.1μl ex2DAZ-R、0.075μl RhEY-F、0.075μl RhEY-R、2.5μl 10x缓冲液、25mM 1.5μl MgCl2溶液、混合的dNTPs溶液2μl，加dH2O至24μl，此外，每个反应体系中加入0.125μl250U的Taq酶；b、然后向试剂内加入1μl DNA样本；c、在94℃对b步骤的Y染色体细微缺失诊断试剂进行预变性8分钟；d、然后分别在94℃、50℃、72℃各变性1分钟；e、重复d步骤，共循环32次，最后将试剂冷却至15℃。
全文摘要
Y染色体细微缺失诊断试剂和对其进行PCR扩增的方法，它涉及一种用于诊断Y染色体细微缺失的试剂和对该试剂进行PCR扩增的方法。本发明的试剂由下述成分制成(1)用pH=7～8的TE分别溶解引物干粉，制成10pmol/μl的溶液；(2)在24μl反应体系中分别加入如下成分sY87－F、sY87－R、sY143－F、sY143－R、ex2DAZ－F、ex2DAZ－R、RhEY－F、RhEY－R、10x缓冲液、MgCl
文档编号C12P19/00GK1635145SQ200410043918
公开日2005年7月6日 申请日期2004年10月8日 优先权日2004年10月8日
发明者常东 申请人:哈尔滨医科大学