Hcmv感染诊断试剂的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种用于诊断人巨细胞病毒感染的试剂，包括：人巨细胞病毒DNA PCR扩增引物，miRNA-UL112-3p正向PCR扩增引物，以及miRNA-UL112-5p正向PCR扩增引物。本发明所述试剂，采用PCR方法，分别对非肿瘤患者(其中HCMV特异性CD8+T淋巴细胞阳性患者57例、HCMV特异性CD8+T淋巴细胞阴性患者35例)、肿瘤化疗患者外周血单个核细胞miR-UL112水平进行检测，发现各组间miR-UL-112-3p、5p水平均有明显差异，说明miR-UL-112-3p、5p水平对于HCMV潜伏、激发感染一定诊断价值。
【专利说明】HCMV感染诊断试剂
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种用于诊断HCMV感染的试剂，尤其涉及一种根据人外周血单个核 细胞miRNA-UL112水平诊断HCMV感染的试剂。
【背景技术】
[0002] 人巨细胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV)属于孢疫病毒科，是人类疱疫病毒 组中最大的一种病毒，可引起人类巨细胞病毒感染。HCMV在人群中普遍易感，成人对HCMV 的感染率高达90 %以上，通常无明显症状，潜伏在宿主细胞中，为隐性感染，而在免疫功能 低下或缺陷时，如妊娠、多次输血、移植受者（HCMV病毒感染也是器官移植失败的主要原因 之一）、艾滋病患者等，常呈激发感染（显性感染），病毒可侵袭多个器官和系统，引起严重 疾病，严重者可致死亡。因此，早期监测HCMV潜伏、激活感染状态，对于免疫功能低下患者 至关重要。
[0003] 然而由于HCMV病毒在人体内感染的普遍存在，通常潜伏在宿主细胞中不引起明 显症状，给HCMV激活感染的诊断带来很大困难。目前HCMV感染诊断方法主要有：
[0004] 1)分离培养
[0005] 用临床标本进行体外分离培养，是目前诊断HCMV感染最可靠的方法，被认为是检 测HCMV感染状态的金标准。该方法将检测标本（血液、尿液、唾液、腹水、脐血、脑脊液、气 管灌洗液等）接种于成纤维细胞，出现细胞病变即为阳性。但是由于HCMV病毒体外增殖缓 慢，初次分离至少需一个月才能使检测细胞出现病变，实验周期长、易污染，且无法与其他 病毒感染区分、对于经药物治疗后的标本病毒分离常为阴性结果，因而临床应用受限，现主 要应用于科研。
[0006] 2)病毒抗原学检测
[0007] 目前主要应用的是pp65抗原血症检测法，当HCMV激活感染时，PP65抗原于6? 24小时内表达于外周血淋巴细胞、单核细胞、多形核白细胞和血管内皮细胞中，是HCMV活 动性感染的早期诊断诊断标志物，但是由于存在假阳性、假阴性结果，该方法目前还存在争 议。
[0008] 3)血清学检测抗体
[0009] 特异性抗体检测主要是检测HCMV感染后刺激机体产生的抗巨细胞病毒IgM和IgG 抗体。抗HCMV IgG抗体多份血清检测可用于HCMV临床诊断，血清IgG抗体阳性转化表明 是原发感染，而连续监测IgG滴度急剧升高表明存在HCMV活动性感染，但是HCMV成人感染 率极高，IgG大多数人为阳性，检测意义不大；血清抗HCMV特异性IgM抗体检测，因其抗体 存在时间短，诊出阳性率较低，另外Bendiksen等[3]研究发现，IgM水平与病毒复制无关， 因此IgM也不能潜伏、激发感染诊断的良好指标。
[0010] 4)核酸杂交、原位杂交检测
[0011]目前对于HCMV的测序已经完成，大大促进了核酸杂交技术在HCMV诊断中的应用。 采用该方法能直接在感染组织中发现包涵体，较传统的免疫组织化学方法更为灵敏、特异。 但是由于方法学上的特殊性，完成全过程受诸多因素的影响，包括：标本处理时间，固定剂 的选择，单克隆抗体细胞株的特异性等，另外该方法对镜检人员技术要求较高，方法上难以 实现高通量检测，抗污染能力不强，成本过高，目前难以普及。
[0012] 5) PCR 方法
[0013] PCR方法检测HCMV，灵敏度为0. 15fg，敏感度和特异度较高，可以实现对病毒检测 的量化，在检测病毒活动性、评价抗病毒疗效等方面具有重要的意义。
[0014] 从目前PCR检测结果来看，单用一对PCR引物可引起假阴性，主要原因可能是临床 标本中HCMV病毒株的不同、或者病毒基因组中极小变异、以及病毒拷贝数太低所致。此外， 引物设计序列针对HCMV同一基因的不同部位，PCR结果也有明显差异，方法还需标准化，目 前市场上还没有商品化的HCMV的PCR诊断试剂盒。
[0015] 综上所述，目前还没有便捷的、明确的方法明显的区分HCMV的潜伏、激发感染。
【发明内容】
[0016] 针对目前人巨细胞病毒的潜伏、激发感染检测方法的缺乏，本发明提供了一 种用于诊断人巨细胞病毒感染的试剂，通过对外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)的miRNA-UL112水平的检测，诊断人巨细胞病毒感染状态。
[0017] 本发明第一个方面是提供一种用于诊断人巨细胞病毒感染的引物，包括：
[0018] 人巨细胞病毒DNA PCR扩增引物，miRNA-ULl 12-3p正向PCR扩增引物，以及 miRNA-UL 112-5p正向PCR扩增引物。
[0019] 其中，本发明第一个方面的一种优选实施例中，miRNA-UL112-3p正向PCR扩增引 物序列为：5' -AAGTGACGGTGAGATCCAGGCT-3'。
[0020] 其中，本发明第一个方面的一种优选实施例中，miRNA-UL112-5p正向PCR扩增引 物序列为：5' -CCTCCGGATCACATGGTTACTCA-3'。
[0021] 其中，本发明第一个方面的一种优选实施例中，人巨细胞病毒DNA PCR扩增引物包 括：
[0022] 正向引物：5' -ATGGTGGCTACGGTTCAGG-3' ；
[0023] 反向引物：5 ' -GGCGAAGATGCGGTAGATG-3 '。
[0024] 本方面第二个方面是提供一种用于诊断人巨细胞病毒感染的试剂盒，包括从外周 血单个核细胞中提取人巨细胞病毒DNA的试剂，和用于诊断人巨细胞病毒感染的引物；
[0025] 所述用于诊断人巨细胞病毒感染的引物包括：人巨细胞病毒DNA PCR扩增引物， miRNA-ULl 12-3p正向PCR扩增引物，以及miRNA-ULl 12-5p正向PCR扩增引物。
[0026] 其中，本发明第二个方面的一种优选实施例中，所述提取人巨细胞病毒DNA的试 剂包括缓冲液、蛋白酶K、RNase free ddH20。
[0027] 其中，所述缓冲液优选为磷酸盐缓冲液和/或改良磷酸盐缓冲液。
[0028] 其中，本发明第二个方面的一种优选实施例中，miRNA-UL112_3p正向PCR扩增引 物序列为：5' -AAGTGACGGTGAGATCCAGGCT-3'。
[0029] 其中，本发明第二个方面的一种优选实施例中，miRNA-UL112_5p正向PCR扩增引 物序列为：5' -CCTCCGGATCACATGGTTACTCA-3'。
[0030] 其中，本发明第二个方面的一种优选实施例中，所述试剂盒还包括 miRNA-ULl 12PCR扩增内参引物序列。
[0031] 其中，所述miRNA-UL112PCR扩增内参引物序列为Takara公司生产的商品名为 CD201-0145的引物序列。
[0032] 其中，本发明第二个方面的一种优选实施例中，人巨细胞病毒DNA PCR扩增引物包 括：
[0033] 正向引物：5' -ATGGTGGCTACGGTTCAGG-3,；
[0034] 反向引物：5 ' -GGCGAAGATGCGGTAGATG-3 '。
[0035] 其中，本发明第二个方面的一种优选实施例中，所述试剂盒还包括人巨细胞病毒 DNA PCR扩增内参引物序列。
[0036] 其中，所述人巨细胞病毒DNA PCR扩增内参引物序列优选为：
[0037] 正向引物：5' -CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3' ；
[0038] 反向引物：5 ' -CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3，。
[0039] 其中，本发明第二个方面的一种优选实施例中，所述试剂盒还包括聚合酶。
[0040] 本发明第三个方面是提供miR-UL112水平在检测人巨细胞病毒
[0041] 本发明所述引物和试剂盒,采用PCR方法，分别对非肿瘤患者、肿瘤化疗患者外周 血单个核细胞miR-UL112水平进行检测，发现两组间miR-UL-112-3p、5p水平均有明显差 异，说明miR-UL-112-3p、5p水平对于HCMV潜伏、激发感染一定诊断价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0042] 图 1 为miR-UL112-3p、5p ROC 曲线图；其中，（a)为非肿瘤患者miR-UL112-3p ROC 曲线图；(b)非肿瘤患者miR-UL112-5p ROC曲线图。
【具体实施方式】
[0043] 一、材料
[0044] 1、标本来源
[0045] 选取2012年3月至2014年3月门诊非肿瘤患者92例，年龄50-70岁，前期应用 HCMV PP65合成多肽片段刺激患者外周血单个核细胞，采用酶联免疫斑点试验（ELISP0T)、 细胞增殖实验等方法检测对HCMV特异性多肽反应的CD8 +T淋巴细胞，根据CD8+T淋巴细胞 的高低将患者分为两组，其中HCMV特异性⑶8+T淋巴细胞高水平组（简称⑶8+细胞高水平 组）57例，HCMV特异性⑶8+T淋巴细胞低水平组（简称⑶8+细胞低水平组）35例。另选取 肿瘤化疗患者30例，患者年龄52-72岁，常规方法分离外周血单个核细胞，-80°C保存待测。
[0046] 2、仪器试剂
[0047] HCMV-DNA、miR-UL-112-3p、miRNA-112-5p引物由北京天根生化公司设计合成，弓丨 物序列见表1。细胞基因组提取试剂盒（DP315)、单个核细胞miRNA提取试剂盒（DP501)、 miRNA RT-PCR试剂盒（MP401)均购自天根生化科技（北京）有限公司。DNA RT-PCR (RR420) 试剂盒购自Takara Bio INC. (TaKara生物有限公司）。聚合酶链式反应仪购自美国应用生 物系统公司）。
[0048] 表ImiRNA反转录与定量PCR引物、DNA定量PCR引物
【权利要求】
1. 一种用于诊断人巨细胞病毒感染的引物，其特征在于，包括： 人巨细胞病毒DNA PCR扩增引物，miRNA-UL112-3p正向PCR扩增引物，以及 miRNA-UL112-5p正向PCR扩增引物。
2. 根据权利要求1所述的引物，其特征在于，miRNA-UL112-3p正向PCR扩增引物序列 为：5' -AAGTGACGGTGAGATCCAGGCT-3'。
3. 根据权利要求1所述的引物，其特征在于，miRNA-UL112-5p正向PCR扩增引物序列 为：5, -CCTCCGGATCACATGGTTACTCA-3，。
4. 根据权利要求1所述的引物，其特征在于，人巨细胞病毒DNA PCR扩增引物包括： 正向引物：5' -ATGGTGGCTACGGTTCAGG-3' ； 反向引物：5' -GGCGAAGATGCGGTAGATG-3'。
5. -种用于诊断人巨细胞病毒感染的试剂盒，其特征在于，包括从外周血单个核细胞 中提取人巨细胞病毒DNA的试剂，和用于诊断人巨细胞病毒感染的引物； 所述用于诊断人巨细胞病毒感染的引物包括：人巨细胞病毒DNA PCR扩增引物， miRNA-UL112-3p正向PCR扩增引物，以及miRNA-UL112-5p正向PCR扩增引物。
6. 根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述提取人巨细胞病毒DNA的试剂包括 缓冲液、蛋白酶K、RNase free ddH20。
7. 根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括miRNA-UL112PCR扩 增内参引物序列。
8. 根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括人巨细胞病毒DNA PCR扩增内参引物序列。
9. 根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述人巨细胞病毒DNA PCR扩增内参引 物序列为： 正向引物：5' -CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3' ； 反向引物：5' -CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3'。
10. 根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括聚合酶。
【文档编号】C12Q1/68GK104263849SQ201410254049
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年6月9日 优先权日:2014年6月9日
【发明者】康向东, 洪建 , 许健, 吴蓉, 相芬芬 申请人:上海市普陀区中心医院