专利名称：腺病毒载体sars疫苗及其制备方法，冠状病毒s基因的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物基因工程领域，具体涉及腺病毒载体SARS疫苗，其制备方法以及揭示相关冠状病毒S基因在制备预防非典型肺炎(SARS)疫苗方面的应用。
背景技术：
中国广东地区从去年末开始爆发非典型肺炎(atypical pneumonia)，发病急，传染性强，抗生素治疗无效。目前，此病已传播至30多个国家和地区，WHO已将之命名为严重急性的呼吸道综合症(severe acuterespiratory syndrome，SARS).
目前，世界许多国家的科学家均从不同病人血清中独立分离到新型的冠状病毒(coronavirus)，病毒基因序列分析结果表明，它们与已知的冠状病毒有50％～60％的同源性，世界卫生组织(WHO)已经公布，引起SARS的病原体是冠状病毒的变异株。
冠状病毒是一种非节段性正链的RNA病毒，其基因组近30kb，可以在人和动物中传播，主要感染人和动物的呼吸系统，冠状病毒颗粒是一种具有内核心及囊膜包被地病毒，共有四种结构蛋白刺突蛋白(spike，S)，膜蛋白(membrance，M)，囊膜蛋白(envelop，E)，及核蛋白(nucleoprotein，N)。由于冠状病毒是一种RNA病毒，十分不稳定，容易发生突变以逃避宿主的免疫监督与排斥。因此，必须寻找到SARS相关冠状病毒中稳定性好且具有免疫保护作用的抗原，以进行相关疫苗的研制。
目前较少应用灭活的病毒颗粒疫苗，因为全病毒颗粒携带了病毒全基因组，安全性顾虑较大。虽然既往的冠状病毒易在体外培养获得，但此次SARS相关的冠状病毒毒性极大且遗传背景不完全清楚，因此大规模制备冠状病毒颗粒不可行。基因工程技术的发展为亚单位疫苗的开发提供了极大的便利，而且亚单位疫苗的可操作性及生物安全性好。若能筛选到具有免疫原性的病毒抗原决定簇，结合基因工程技术，可方便地对抗原决定簇进行改造，以增强其稳定性、免疫原性、生物安全性。显然，借助基因工程技术，可以非常方便地制备有效的亚单位疫苗。
根据目前研究显示，冠状病毒已知的四种结构蛋白中，刺突蛋白(spike S)是具有诱导保护性免疫反应的结构蛋白，部分学者的研究结构已经证实了冠状病毒刺突蛋白C末端为其抗原决定族所在，同时，SARS相关冠状病毒通过呼吸道引起感染，而目前仍未有可以预防SARS的疫苗。
另外，资料显示，腺病毒本身很容易感染呼吸道粘膜上皮，较易诱导呼吸道粘膜免疫反应，并且腺病毒作载体表达的免疫原在宿主细胞中表达、加工、折叠、修饰、提呈，基本上保持了免疫原的天然构象，生物活性高。
所述条件为利用缺陷型腺病毒作为载体研制和生产腺病毒SARS疫苗提供了坚实的理论基础。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种能预防流行性疾病“非典型肺炎”的腺病毒SARS疫苗，更好的防止“非典型肺炎”的发生和传播；本发明另外的目的在于提供一种利用缺陷型腺病毒作为载体，通过基因克隆、重组等手段，制备腺病毒载体SARS疫苗的方法以及揭示SARS相关冠状病毒S基因在制备疫苗中的应用。
本发明的目的是这样实现的通过生物工程手段，将SARS相关冠状病毒S基因(冠状病毒共有四个结构基因，S基因为其中之一，见下文详述)与缺陷型腺病毒重组结合，构成一种能引起粘膜免疫原性的基因疫苗。
所用Spike基因片段序列为使用Gene bank中所公布的S基因序列(Gene bank查询号gbAY278554.2)作为模版，根据序列设计PCR引物如下v1 GGTCTAGAGT TGTGGTTTCA AGTGATv2 TTTCTAGACC ATGGGTTGTG TCCTTGCTV3 TTTCTAGACC ATGGCATATA GGTTCAATGV4 TAGGTACCAA TGCCAGTAGT GGTGV5 TTGGTACCTC CGCCTCGACT TTV6 CCGGTACCAT AAGTTCGTTT ATGTGT其中V1和V4为一对，扩增S基因N端片段；V2和V5为一对引物，扩增S基因M区片段；V3和V6为一对引物，扩增S基因C端片段(如图1)，扩增后的结构见图2。
腺病毒SARS疫苗的制备首先，收集合分离康复病人血清，通过分离提取得到冠状病毒总RNA，通过反转录、测序、挑选等步骤得到S基因。接着，将S基因克隆到pShuttle质粒得到克隆体(保藏单位中国典型培养物保藏中心；保藏日期2003年5月17日；保藏号CCTCC M 203036 E.coliDH5a/pShuttle-SN以及CCTCC M 203037 E.coli DH5a/pShuttle-SC)，再将其与腺病毒骨架质粒(pAdeno-XTM)连接(其中pShuttle、pAdeno-X均购自CLONTECH Laboratory，Inc，USA)。连接后共同转染293细胞，经进一步的纯化鉴定后，用293细胞大量扩增，收集病毒液，分离纯化，即为腺病毒SARS疫苗。它可以制成喷雾剂或其它形式的药剂。主要的技术路线见图4。
本发明是一种基因工程疫苗，即是使用缺陷型腺病毒作为载体的基因疫苗，它利用本身很容易感染呼吸道粘膜上皮的腺病毒作为载体，使保护性免疫原蛋白或多肽在其中表达，诱导呼吸道粘膜免疫反应；通过诱导粘膜免疫性反应，使机体产生相应抗体，防止病毒侵染。本发明与传统的灭活病毒颗粒疫苗比较，它安全性高，并且使用方便，不受肌肉注射等特定条件限制。
目前，SARS正在世界各地快速传播，作为一种病毒性传染病，眼下尚未找到可以有效治疗的药物，此种情况下，预防是最好的手段。现已证实SARS相关冠状病毒刺突蛋白C末端为其抗原决定族所在。因此，本发明正是根据此发现，合成SARS相关冠状病毒刺突蛋白基因，将其克隆到腺病毒载体，经过扩增培养、纯化、制剂而成，能有效诱导粘膜产生抗体，产生体液免疫防止病毒侵染机体，具有广泛的临床应用前景。
四
图1是S基因片段扩增示意图。
图2是带有S基因(Spike-S)的重组缺陷型腺病毒结构图。
图3是pShuttle-SC、pShuttle-SM、pShuttle-SN重组体酶切结果。
图4是pShuttle-SC、pShuttle-SM、pShuttle-SN重组体测序结果。
图5是RT-PCR检测Ad-SN和Ad-SM的表达试验结果图6是Western blot检测Ad-SN的表达试验结果图7是Ad-SN注射或呼吸道免疫均诱导雌性大鼠产生特异性抗体(IgG)的体内表达试验结果图8是Ad-SN注射或呼吸道免疫均诱导雄性大鼠产生特异性抗体(IgG)的体内表达试验结果图9是本发明疫苗制备的技术路线图。
五具体实施例方式
以下将通过具体实施例来进一步说明本发明。
实施例1腺病毒载体SARS疫苗的制备方法腺病毒载体SARS疫苗的制备分为前期构建和后期扩增二部分前期构建取得SARS相关冠状病毒spike(SF、SN、SM、SC)基因后，用PCR方法进行扩增，经PCR后，用Xbal+Kpnl 37℃酶切，同时用此酶酶切pShuttle，连接，转化大肠杆菌DH5a，利用卡那霉素(KanR)抗性筛选阳性克隆，培养、纯化后得到pSF/SN/SM/SC-Shuttle，用1-Ceul+P1-Scel酶切，同时用此酶酶切PAdeno-XTM，酶切后连接，转化大肠杆菌DH5a，利用氨苄(Amp+)抗性筛选阳性克隆即得pAd-SF/SN/SM/SC。
扩大培养得到pAd-SF/SN/SM/SC后，再经Pacl酶切、质粒经线化后转染包装细胞，包装细胞为整合了C亚类5型腺病毒(Ad5)E1区基因的细胞系(株)，例如293细胞。经过空斑筛选，PCR鉴定为Ad-SF/SN/SM/SC后，大量培养293细胞，用Ad-SF/SN/SM/SC感染293细胞，经氯化铯分离纯化，制剂等步骤，即得到腺病毒SARS疫苗。
SARS疫苗包含SARS相关冠状病毒S基因和和缺陷型腺病毒。缺陷型腺病毒为E1区完全缺失的C亚类的5型腺病毒，即Ad5。该缺陷型腺病毒的E3区可以为完全缺失或部分缺失或不缺失。缺陷型腺病毒内装CMV启动子和BGHpolyA。
Ad-SF/SN/SM/SC克隆到腺病毒载体中的为SARS相关冠状病毒S基因全长。
克隆到腺病毒载体中的为SARS相关冠状病毒S基因包括S1结构域在内的序列。
克隆到腺病毒载体中的为SARS相关冠状病毒S基因包括S2结构域在内的序列。
克隆到腺病毒载体中的为SARS相关冠状病毒S基因包括S1、S2结构域在内的序列(碱基号为49～3585)。
克隆到腺病毒载体中的为SARS相关冠状病毒S基因跨膜区(碱基号为3686～3648)及C端片段。
实施例2克隆到腺病毒载体中的为SARS相关冠状病毒S基因N端片段。其余同实施例1。
实施例3克隆到腺病毒载体中的为SARS相关冠状病毒S基因中间片段。其余同实施例1。
实施例4克隆到腺病毒载体中的为SARS相关冠状病毒S基因C端片段。
其余同实施例1。
实施例5S基因转化pShuttle质粒和鉴定用Xbal+Kpnl 37℃水浴条件酶切，同时用此酶酶切pShuttle，连接，转化大肠杆菌DH5a，培养，利用卡那霉素(KanR)抗性筛选阳性克隆，分别得到pShuttle-SC、pShuttle-SM、pShuttle-SN，通过常规琼脂凝胶电泳鉴定和检测序列鉴定，结果见图3、图4。
实施例6对克隆得到的Ad-SN/SM进行体外表达试验。
用2.5～40 MOI感染VeroE6细胞，弃去病毒悬液，加入细胞培养液，37℃、5％CO2条件下培养，于感染后48h收集培养细胞上清，分别用RT-PCR法检测Ad-Sn和Ad-Snm的表达水平，用Western blot法检测Ad-Sn的表达水平，结果见图5、图6。
实施例7对克隆得到的Ad-SN进行体内表达试验。
将试验对象按照下述方式分组Ad-Sn滴鼻组、Ad-lacZ滴鼻组(对照，先用3％戊巴比妥腹注麻醉，滴鼻0.5mL/只)、Ad-Sn尾静脉注射组、Ad-lacZ尾静脉注射组(对照，尾静脉注射给药0.5mL/只)、空白对照组(不作任何处理)。然后按照下述方式给药每周给药一次，连续三周；从第一次给药后一周开始取血，最后一次给药2周后处死动物取血和组织，用ELISA法测定大鼠抗SARS IgG浓度，结果见图7、图8。
实施例8绿猴肾细胞(Vero E6)细胞免受SARS攻击1.接种Vero E6细胞到96孔板，2×104/孔。
2. 24小时后，接种腺病毒SARS疫苗，方法用1640培养液按4倍稀释病毒原液，接种时先将96孔板中培养液吸出弃去，PBS清洗孔一遍后，加入不同稀释度的病毒液，每一个稀释度加5个孔，50μL/孔。同时以1640培养液(不含病毒)为阴性对照。37℃，5％CO2，饱和湿度条件下孵育1小时后，加入含5％新生牛血清的1640培养液，200μL/孔，37℃，5％CO2，饱和湿度条件下培养。
3. 24小时后，接种SARS病毒，方法1640培养液稀释SARS病毒至100TCID50，接种时先将96孔板中培养液吸出弃去，PBS清洗孔一遍后，加入不同稀释度的病毒液，每一个稀释度加5个孔，50μL/孔。同时以1640培养液(不含病毒)为阴性对照。37℃，5％CO2，饱和湿度条件下孵育1小时后，加入含5％新生牛血清的1640培养液，200μL/孔，37℃，5％CO2，饱和湿度条件下培养。
4.此后每隔12到24小时观察并记录细胞病变情况，计算结果时各稀释度的每孔细胞病变评分相加，得出细胞病变指数，取各组平均数，如下
<110>中山大学肿瘤防治中心<120>腺病毒载体SARS疫苗及其制备方法，冠状病毒S基因的应用<160>4<210>1<211>3780<212>DNA<213>病毒种<220>
<221>CDS<222>(1)…(3780)<400>1atgtttattt tcttattatt tcttactctc actagtggta gtgaccttga ccggtgcacc 60acttttgatg atgttcaagc tcctaattac actcaacata cttcatctat gaggggggtt 120tactatcctg atgaaatttt tagatcagac actctttatt taactcagga tttatttctt 180ccattttatt ctaatgttac agggtttcat actattaatc atacgtttgg caaccctgtc 240atacctttta aggatggtat ttattttgct gccacagaga aatcaaatgt tgtccgtggt 300tgggtttttg gttctaccat gaacaacaag tcacagtcgg tgattattat taacaattct 360actaatgttg ttatacgagc atgtaacttt gaattgtgtg acaacccttt ctttgctgtt 420tctaaaccca tgggtacaca gacacatact atgatattcg ataatgcatt taattgcact 480ttcgagtaca tatctgatgc cttttcgctt gatgtttcag aaaagtcagg taattttaaa 540cacttacgag agtttgtgtt taaaaataaa gatgggtttc tctatgttta taagggctat 600
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权利要求
1.一种SARS疫苗，其特征在于它包含SARS相关冠状病毒S基因和复制缺陷型腺病毒。
2.根据权利要求1所述的SARS疫苗，其特征在于缺陷型腺病毒为E1区完全缺失的C亚类的5型腺病毒。
3.根据权利要求2所述的SARS疫苗，其特征在于缺陷型腺病毒为E3区完全缺失的C亚类的5型腺病毒。
4.根据权利要求2所述的SARS疫苗，其特征在于缺陷型腺病毒为E3区部分缺失的C亚类的5型腺病毒。
5.根据权利要求2所述的SARS疫苗，其特征在于缺陷型腺病毒为E3区不缺失的C亚类的5型腺病毒。
6.根据权利要求1或2所述的SARS疫苗，其特征在于缺陷型腺病毒内装CMV启动子和BGHpolyA。
7.根据权利要求1或2所述的SARS疫苗，其特征在于它包含SARS相关冠状病毒S基因全长。
8.根据权利要求1或2所述的SARS疫苗，其特征在于克隆到腺病毒载体中的为SARS相关冠状病毒S基因包括S1结构域在内的序列。
9.根据权利要求1或2所述的SARS疫苗，其特征在于克隆到腺病毒载体中的为SARS相关冠状病毒S基因包括S2结构域在内的序列。
10.根据权利要求1或2所述的SARS疫苗，其特征在于克隆到腺病毒载体中的为SARS相关冠状病毒S基因包括S1、S2结构域在内的序列。
11.根据权利要求1或2所述的SARS疫苗，其特征在于克隆到腺病毒载体中的为SARS相关冠状病毒S基因跨膜区(碱基号为3686～3648，见附表一)及C端片段。
12.一种SARS疫苗的制备方法，包括(1)取得SARS相关冠状病毒的S基因；(2)将S基因与缺陷型腺病毒重组结合；(3)转染包装细胞；(4)经扩增、分离、纯化，制成制剂。
13.根据权利要求12所述的SARS疫苗制备方法，其特征在于提取S基因后，将其克隆到pshuttle质粒，再将其与腺病毒骨架质粒(pAdeno-xTM)连接结合。
14.根据权利要求12所述的核酸疫苗的制备方法，其特征在于根据S基因序列设计PCR引物如下v1 GGTCTAGAGT TGTGGTTTCA AGTGATv2 TTTCTAGACC ATGGGTTGTG TCCTTGCTV3 TTTCTAGACC ATGGCATATA GGTTCAATGV4 TAGGTACCAA TGCCAGTAGT GGTGV5 TTGGTACCTC CGCCTCGACT TTV6 CCGGTACCAT A AGTTCGTTT ATGTGT
15.根据权利要求12所述的SARS疫苗制备方法，其特征在于包装细胞为整合了C亚类5型腺病毒(Ad5)E1区基因的细胞系(株)。
16.根据权利要求15所述的SARS疫苗制备方法，其特征在于包装细胞为293细胞。
17.根据权利要求11所述的SARS疫苗制备方法，其特征在于所述制剂为喷雾剂或注射剂。
18.SARS相关冠状病毒S基因在制备预防SARS的疫苗中的应用。
全文摘要
本发明属于生物基因工程领域，具体涉及腺病毒载体SARS疫苗，其制备方法以及相关冠状病毒S基因在制备预防非典型肺炎(SARS)疫苗方面的应用。通过生物工程手段，将相关冠状病毒S基因与缺陷型腺病毒重组结合，使保护性免疫原蛋白或多肽在其中表达，经过扩增培养、纯化、制剂而制成一种能引起粘膜免疫原性的基因疫苗，诱导呼吸道粘膜免疫反应，使机体产生相应抗体，防止病毒侵染。本发明与传统的灭活病毒颗粒疫苗比较，安全性高，使用方便，不受肌肉注射等特定条件限制，具有广泛的临床应用前景。
文档编号C12N15/861GK1562365SQ20041004428
公开日2005年1月12日 申请日期2004年5月18日 优先权日2003年5月21日
发明者黄文林, 曾益新, 汪健, 刘然义, 黄嘉凌, 黄必军, 赖坤, 吴立志, 梁志慧, 柯妙拉, 吴秀菊 申请人:中山大学肿瘤防治中心