专利名称：一种植物金属硫蛋白的制备方法
所属领域本发明是一种利用分子生物学基因构建技术制备植物金属硫蛋白的方法。
背景技术：
自从美国哈佛医学院B.L.Vallee博士于一九五七年首先从哺乳动物体内发现金属硫蛋白(Metallothionein简称MT)以来，科学家们相继在植物(Purdue University，West Lafayette，IN 47907.Regulation and function of metallothionein genes in plants)、微生物、以及海洋生物中发现和证明了存在具有相似结构和生理功能基本一致的金属硫蛋白(Classification of Metallothionein，P.-A.Binz，J.H.R.Kgi，1999)。
金属硫蛋白是一类分子量小，含有丰富巯基，是至迄今为止所发现的在自然界生命有机体中清除自由基最强的活性多肽(Binz P.-A.(1996)University Ziirich，Zürich，Switzerland.Binz P.-A.& Kgi J.H.R.(1996)poster presentation，Protein Science 6，suppl.1，p68)。金属硫蛋白能为生物体提供多种生命活动中必需的微量元素(如锌、铜、钴等)，并具有拮抗重金属(隔、汞和铝)，抗辐射(包括紫外线)和修复受损组织等功效(Carrasco，J.，Penkowa，M.，Giralt，M.，Camats，J.，Molinero，A.，Campbell，I.L.，Palmiter，R.D.，Hidalgo，J.Role of metallothionein-III following central nervous system damage.Neurobiol.Dis.13(1)22-36.(2003)。除了可以开发各种治疗药物外，金属硫蛋白还可以作为多功能食品的添加剂、必需微量元素补充液、功能性口服液、和其它多种保健化妆品等。
植物金属硫蛋白基因到目前为止发现存在三种主要类型。用于此设计的为II型(plant metallothioneintype II)，发现于芥菜属，其cDNA克隆基因序列如图(见附图1)和氨基酸序列(见附图2)。在植物金属硫蛋白分子中，根据半胱氨酸的常见分布规律可划分为三个序列区域区域(1)中半胱氨的序列分布为SCCGGnCGCGsgCkCgnGCgGCkmy；区域(2)序列中没有发现半胱氨酸的分布；区域(3)中半胱氨的序列分布为gCKCGsxC[kt]C[dn]PCxC。半胱氨酸的重复分布规律序列为；CC，CXC和CXXXC，两个保守序列区域(1)和(3)分布于分子两端，形成哑铃状，富含巯基(-SH)，与哺乳动物金属硫蛋白分子中半胱氨酸的重复分布规律一致。植物金属硫蛋白II型有十四个半胱氨酸(Cys)，是目前发现在植物蛋白中含有巯基数目最多的类型。
发明内容
本发明利用植物金属硫蛋白基因通过构建基因载体技术在大肠杆菌中得到高效表达。其特点是1)可制备成本低廉、高纯度的植物金属硫蛋白；2)具备哺乳动物金属硫蛋白的基本功能；3)没有哺乳动物的异种蛋白；4)生产周期短。基因的构建整合利用了开发型质粒(pETM20)载体系统。用这个载体表达系统可以高效率表达植物金属硫蛋白与硫氧还蛋白的融合体，然后利用特异性酶裂解融合体来制取高纯度的植物金属硫蛋白。技术路线和方法包括植物金属硫蛋白基因的选择；PCR引物的设计；质粒选择；菌种的选择；植物金属硫蛋白与硫氧还蛋白融合体的表达以及植物金属硫蛋白的分离纯化。
图1植物金属硫蛋白(II)的cDNA克隆基因序列图2植物金属硫蛋白(II)氨基酸序列具体实施方式
所述的一种植物金属硫蛋白的制备方法，其特征包括利用基因工程技术构建植物金属硫蛋白与硫氧还蛋白基因的融合序列，选择开发性质粒pETM20，其中的六个连续的组氨酸基因序列与硫氧还蛋白基因序列相融合，硫氧还蛋白基因序列与植物金属硫蛋白基因序列相融合，并在特选大肠杆菌(Rosetta gami)中来表达植物金属硫蛋白与硫氧还蛋白的融合体。
1、植物金属硫蛋白与硫氧还蛋白融合基因序列的构建植物金属硫蛋白与硫氧还蛋白融合基因序列的构建是将pETM20质粒内原有的RAGE和TixA(硫氧还蛋白)融合基因中用限制性内切酶KpnI和NcoI移去RAGE基因并形成相应粘端，所用植物金属硫蛋白基因序列在引物设计中具备KpnI和NcoI序列，酶解后可形成相应序列粘端。经DNA聚合酶作用下形成植物金属硫蛋白与硫氧还蛋白融合基因序列。
所述构建植物金属硫蛋白基因序列，其特征是可利用下列PCR引物来得到。
意义链引物GAccATGgCTTGCTGTGGAGGAAACTGTGG 3′反意义链引物GGGGTaccGTGGTTATCTATTTGCAGG2、质粒的选择pETM20质粒是为克隆和表达带有组氨酸的融合蛋白设计的，共有6124对碱基的环状DNA，具有胺汴青霉素抗性基因。在此设计中质粒的重要编译密码依次是；由N段开始的启动子基因(T7)，TixA序列，六个连续的组氨酸序列，TEV酶切序列，NcoI和KpnI酶切序列。由于pETM20质粒有六个连续的组氨酸序列，可以用其与镍琼脂糖专一亲和能力来分离所诱导的植物金属硫蛋白与硫氧还蛋白的融合体。
3、菌种的选择大肠杆菌(Rosetta gami)为上述植物金属硫蛋白基因载体质粒的特选宿主菌株，其特点是能同时提供六种稀有tRNA，具备氯霉素抗性基因。
4、植物金属硫蛋白与硫氧还蛋白融合体的分离纯化植物金属硫蛋白与硫氧还蛋白融合体的工程菌在诱导培养后离心收集菌体，用缓冲液悬浮菌体，破碎菌体，再离心，上清液与镍琼脂糖在4℃中进行亲和吸附一小时，然后上柱洗脱、收集馏分、透析脱盐后即可得到植物金属硫蛋白与硫氧还蛋白的融合蛋白。
5、用特异性酶(TEV protease)裂解植物金属硫蛋白与硫氧还蛋白的融合体经纯化后的植物金属硫蛋白与硫氧还蛋白融合体可用特异性酶裂解制取植物金属硫蛋白。带有6xHis的硫氧还蛋白亲和吸附在镍琼脂糖，洗脱液馏分中含经裂解后的高纯度植物金属硫蛋白。
实例说明一、植物金属硫蛋白与硫氧还蛋白的融合体工程菌的构建与蛋白的制取实例1)植物金属硫蛋白与硫氧还蛋白融合体的构建过程使用的是Invitrogen试剂盒。质粒pETM20中有NcoI和KpnI限制性内切酶的基因序列位点，酶解形成两端带有NcoI和KpnI基因序列粘端的线型质粒。植物金属硫蛋白的PCR产物其两端引物设计中分别有NcoI和KpnI基因序列，经限制性内切酶KpnI和NcoI酶解后形成带有KpnI和NcoI基因序列的粘端。由T4DNA聚合酶的作用下，带有KpnI和NcoI基因序列粘端的线型质粒与有NcoI和KpnI粘端的植物金属硫蛋白基因序列结合形成带有植物金属硫蛋白与硫氧还蛋白融合体基因序列的环状质粒。质粒用电击法转入50μl感受态大肠杆菌(Rosetta gami)中并在LB固体培养基上37℃培养过夜。为了确定植物金属硫蛋白基因的存在，制备质粒，并用带有KpnI和NcoI酶切序列的引物进行PCR。植物金属硫蛋白基因具备240个碱基对。
2)菌种培养与植物金属硫蛋白和硫氧还蛋白融合体的分离实例从培养皿菌落中选择菌种培养于含有抗生素胺汴青霉素(100μg/ml)和氯霉素(34μg/ml)的50ml LB培养液在温度37℃摇床中(180-200rpm)培养18-20小时，然后移入在上述含有同样抗生素剂量的950ml LB培养液中进行稀释培养，在温度37℃摇床(180rpm)中培养至OD达到0.6-1.2。菌液迅速冷却至17-28℃，加入IPTG进行诱导培养18-22小时。菌液离心15分钟(15,000rpm)，可得到菌体约4-5g。菌体进行悬浮，然后超声波破碎菌体，离心(15,000rpm)15分钟得到上清液，上清液移入50ml试管中并加入5ml镍琼脂糖摇匀并置于4℃摇床(50rpm)中约一小时，具有6x组氨酸的可溶性蛋白(植物金属硫蛋白和硫氧还蛋白的融合体)与镍琼脂糖发生亲合反应，用含不同浓度的咪唑缓冲液进行洗脱，收集250mM咪唑缓冲液的洗脱馏分再进一步用透析膜进行脱咪唑、脱盐即可得到植物金属硫蛋白与硫氧还蛋白的融合体。
3)植物金属硫蛋白的分离纯化实例植物金属硫蛋白和硫氧还蛋白的融合体与TEV酶经2小时，34℃裂解反应后即可与镍琼脂糖再次进行亲合反应1小时，然后上柱收集馏分，馏分经过透析既可得到高纯度植物金属硫蛋白。
二、植物金属硫蛋白与硫氧还蛋白的融合体诱导表达温度实例1)一升菌种培养液在诱导表达温度17-28℃时可制取可溶性融合体～200mg/升，纯度可达95％以上。在诱导表达温度为17-28℃时可制取可溶性融合体的含量较高。
2)一升菌种培养液在诱导表达温度37℃时可制取可溶性融合体约～120mg/升，纯度可达95％以上。在诱导表达温度为37℃时可制取的可溶性融合体的含量相对低。
三、金属硫蛋白融合体诱导表达时间实例1)一升菌种培养液当诱导表达时间为22小时，诱导表达温度17-28℃时可制取可溶性融合体～200mg/升，纯度可达95％以上。诱导时间为22小时时可制取的可溶性融合体的含量相对高。
2)一升菌种培养液当诱导时间为24小时以上，诱导表达温度17-28℃时可制取可溶性植物金属硫蛋白融合体约130mg/升，纯度可达95％以上。诱导时间在24小时以上时可制取的可溶性植物金属硫蛋白融合体的含量相对低。
四、植物金属硫蛋白融合体诱导表达的温度域与时间域较佳组合实例当一升菌种培养液诱导表达温度在17℃-28℃，时间域在18-24小时的范围内时可制取可溶性植物金属硫蛋白融合体150～200mg/升，纯度可达95％以上。在诱导表达温度在17℃-28℃范围内，诱导表达时间域在18-24小时内时可制取的可溶性融合体的总量较高，表达稳定。
权利要求
1.植物金属硫蛋白融合体工程菌设计，其特征包括(1)开发性质粒pETM20中六个组氨酸连续基因序列(6xHis)融合于硫氧还蛋白和植物金属硫蛋白基因序列之间；(2)用植物金属硫蛋白(II)基因与硫氧还蛋白基因构建形成融合基因序列，其基因之间的连接处含特定内切酶(TEV)靶基因序列；
2.植物金属硫蛋白制备方法，其特征包括(1)蛋白质工程技术诱导表达植物金属硫蛋白；(2)植物金属硫蛋白工程菌接种于LB培养液，37℃培养18-20小时，用LB稀释20倍在37℃培养4-5小时，OD至0.6-1.2，然后冷却至17-28℃后加入诱导物IPTG最终浓度为1mM继续在17-28℃中培养18-22小时。(3)菌体超声波、酶解或冷冻破碎，离心，上清液与镍琼脂糖在4℃中进行亲和吸附一小时，上柱，再用不同浓度咪唑洗脱、脱盐、然后酶切。
3.依据权利要求1(1)选择pETM20系统其特征是所表达的植物金属硫蛋白融合体具备组氨酸连续序列。
4.依据权利要求1(2)所述植物金属硫蛋白(II)基因构建形成融合体序列，其特征是在表达的融合蛋白与靶蛋白之间形成特定酶切点。
5.依据权利要求2(2)所述的植物金属硫蛋白融合体制备方法，其特征是诱导培养阶段的温度为17-28C。
6.依据权利要求2(3)所述的植物金属硫蛋白制备方法，其特征是脱咪唑、盐后酶切。
全文摘要
一种植物金属硫蛋白的制备方法其特征包括利用基因工程技术构建植物金属硫蛋白与硫氧还蛋白融合基因序列，选择开发性质粒pEMT20，并在特选大肠杆菌中来表达植物金属硫蛋白与硫氧还蛋白融合体。将植物金属硫蛋白与硫氧还蛋白融合体工程菌在LB培养液中进行培养。然后离心收集菌体，用缓冲液悬浮菌体，破碎菌体，再离心，上清液与镍琼脂糖在4℃中进行亲和吸附一小时，上柱洗脱、收集馏分、脱盐、酶切后即可得到植物金属硫蛋白。本发明提供一种制备低成本、高产量、高纯度的植物金属硫蛋白的方法。
文档编号C12N15/62GK1644699SQ200410044118
公开日2005年7月27日 申请日期2004年12月13日 优先权日2004年12月13日
发明者安志刚, 祖元刚 申请人:东北林业大学, 安志刚, 祖元刚