一种重组表达木聚糖酶基因的毕赤酵母工程菌及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种重组表达木聚糖酶基因的毕赤酵母工程菌，所述工程菌携带有能表达斜卧青霉（Penicillium?decumbens）的木聚糖酶基因的表达载体。利用本发明的毕赤酵母工程菌高效表达的木聚糖酶，在酸性条件下具有很高的活性，且对底物专一性高。所述木聚糖酶可被广泛用于低聚木糖的生产。
【专利说明】一种重组表达木聚糖酶基因的毕赤酵母工程菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程【技术领域】，具体涉及一种重组表达木聚糖酶基因的毕赤酵母 工程菌及其应用。 技术背景
[0002] 低聚木糖亦称木寡糖（xylooligosaccharides)，是由2?10个D-木糖以 β-1，4-木糖苷键结合而成的非均一性多糖，是功能性低聚糖家族中的一个重要成员。低聚 木糖有明显的双歧杆菌增殖作用，而且除青春双歧杆菌、婴儿双歧杆菌和长双歧杆菌外，大 多数肠道菌对低聚木糖的利用都比较差，能抑制肠道有害菌的生长发育；低聚木糖不被消 化，与其他的低聚糖相比，木二糖在消化系统中最稳定，不被消化酶水解，可满足患有诸如 糖尿病、肥胖病和高血脂症等特殊人群的需要；低聚木糖有抗龋齿，有利于口腔健康；低聚 木糖促进人体对钙的吸收，防止老化和骨质疏松症。低聚木糖已经广泛应用于医药保健品、 乳品饮料、食品和词料等。
[0003] 低聚木糖的生产通常是采用物理、化学及酶解等方法水解富含木聚糖的原料，然 后对产物进行提取精制。制备低聚木糖的原料是木聚糖，它在玉米芯、甘蔗渣、棉籽壳和燕 麦、桦木等农林产品中含量相对较高，平均可达30%左右。目前生产低聚木糖的主要方法是 酶法水解木聚糖。利用内切木聚糖酶水解木聚糖底物得到的以木二糖、木三糖为主要成分 的混合物。而酶解法的关键在于木聚糖酶对应底物的适应性，即选择合适的木聚糖酶。
[0004] 很多微生物如细菌、霉菌和放线菌等均能产生木聚糖酶。木聚糖酶来源不同，结构 和性质也不尽相同，其酶解木聚糖后释放出的寡糖链长也不相同。而木二糖、木三糖和木四 糖是低聚木糖中功效较好的组分，因此这几种组分在酶解产物中含量越高越好。目前人们 研究和应用最多的是细菌和霉菌来源的木聚糖酶，其酶解木聚糖的产物中木二糖?木四糖 的含量比较低，而木糖及其他链长度组分含量较高。因此，现在急需开发出性能更好、专一 性更强的木聚糖酶，更广泛的应用于低聚木糖的生产。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种重组表达木聚糖酶的毕赤酵母工程菌，即利用基因工程 技术手段，将斜卧青霉（Penicillium decumbens)的木聚糖酶基因转化入毕赤酵母中，构建 毕赤酵母工程菌株。该菌株能高效表达木聚糖酶，且生产的木聚糖酶在酸性条件下具有较 高的活性。该酶对底物的专一性强，利用其酶解作用生产的低聚木糖中二糖、三糖和四糖的 含量高，适用于高效生产低聚木糖。
[0006] 申请人:经过大量的筛选后，发现将克隆自斜卧青霉的木聚糖酶基因转化入毕赤酵 母中，毕赤酵母表达的木聚糖酶对底物的专一性很强，从而促成本发明。
[0007] -方面，本发明提供了一种克隆自斜卧青霉的木聚糖酶，该木聚糖酶的最适pH 值为5.0,在pH4. 0-7.0的范围内能保持80%以上的活性；最适反应温度为60°C，在温度 40-70°C的范围内，能保持50%以上的活性。
[0008] 本发明所述的斜卧青霉的木聚糖酶，其具有
[0009] 1) SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列；或者
[0010] 2)在SEQ ID NO: 1中取代、缺失或添加一个或几个氨基酸得到的具有斜卧青霉的 木聚糖酶活性的氨基酸序列。
[0011] 本发明所述的斜卧青霉的木聚糖酶的编码基因为
[0012] 1)核苷酸序列SEQ ID N0:2所示的DNA分子；
[0013] 2)在严格条件下与SEQ ID N0:2所示核苷酸序列杂交且编码具有木聚糖酶活性的 蛋白质的DNA分子。
[0014] 在本发明的一个优选实施方案中，上述的斜卧青霉的木聚糖酶的编码基因具有 SEQ IDN0:2所示的核苷酸序列。
[0015] 本发明所述木聚糖酶能针对性的酶解木聚糖。酶解产物中低聚木二糖?低聚木七 糖的含量高于70%，低聚木二糖?低聚木四糖含量高于50%，单糖含量低于30%。
[0016] 因此，本发明另一方面提供了上述木聚糖酶在生产低聚木糖中的用途。
[0017] 另一方面，本发明提供了一种重组毕赤酵母工程菌，该工程菌携带有能表达所述 斜卧青霉木聚糖酶基因的表达载体。
[0018] 在本发明的一个实施方案中，所述的表达载体为pPIC9K，筛选标记为遗传霉素。
[0019] 在本发明的一个实施方案中，其中所述的毕赤酵母工程菌为毕赤酵母菌株GS115。
[0020] 另一方面，本发明提供了上述毕赤酵母工程菌在生产木聚糖酶中的用途。
[0021] 另一方面，本发明还提供了用于克隆木聚糖酶编码基因的引物对，其核苷酸序列 为
[0022] 引物 F :5' -GCGCGAATTCGCAGGTTTGAACGACGCAGCTAAG-3' (SEQ ID N0:3)
[0023] 引物 R :5' -TAAAGCGGCCGCTTACAAGCATTGAGAATACCA-3' (SEQ ID NO:4)
[0024] 另一方面，本发明提供了一种生产低聚木糖的方法，该方法包括：
[0025] (1)发酵培养本发明所述的毕赤酵母工程菌，获得本发明所述的木聚糖酶；
[0026] (2)用所述木聚糖酶酶解含木聚糖的原料，得到低聚木糖产物。
[0027] 本发明所述的含木聚糖的原料包括但不限于玉米芯、甘蔗渣、棉籽壳和燕麦、桦木 等。
[0028] 在本发明的低聚木糖产物中，低聚木二糖?低聚木七糖的含量高于70%，低聚木二 糖?低聚木四糖含量高于50%，单糖含量低于30%。
[0029] 发明优点
[0030] 本发明构建了高效表达斜卧青霉木聚糖酶基因的毕赤酵母工程菌，其生产的木聚 糖酶在酸性范围内具有较高的酶活性，最适pH值为5. 0,在PH4. 0-7. 0的范围内能保持80% 以上的活性；最适反应温度为60°C，在温度40-70°C的范围内，能保持50%以上的活性。该 木聚糖酶具有很强的底物专一性，能针对性的酶解木聚糖。本发明的木聚糖酶可应用于低 聚木糖的生产，产物中低聚木二糖?低聚木七糖的含量高于70%，低聚木二糖?低聚木四糖 含量高于50%，单糖含量低于30%，应用前景广泛。
【专利附图】
【附图说明】
[0031] 图1、木聚糖酶基因XynQl的PCR扩增琼脂糖凝胶电泳图。
[0032] 图2、构建的重组表达载体pPIC9K_XynQl示意图。
[0033] 图3、毕赤酵母工程菌发酵上清液SDS-PAGE电泳图，箭头所示为重组木聚糖酶 XYNQ1。
[0034] 图4、重组木聚糖酶XYNQ1的发酵曲线。
[0035] 图5、重组木聚糖酶XYNQ1的pH特性分析。
[0036] 图6、重组木聚糖酶XYNQ1的反应温度分析。
【具体实施方式】
[0037] 下面结合实例对本发明的方法做进一步说明。但实例仅限于说明，并不限于此。下 列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克（Sambrook) 等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。本领域 相关的技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本发明。但是，本发明的保护和权利要 求范围不限于所提供的案例。
[0038] 实施例
[0039] 实施例1斜卧青霉木聚糖酶基因的克隆
[0040] 查阅GenBank中的基因序列，找到糖苷水解酶10家族中的一个木聚糖酶基因，该 基因来源于斜卧青霉（Penicillium decumbens)，GenBank号为HQ286638. 1。通过上海捷瑞 生物工程有限公司合成该木聚糖酶基因，命名为XynQl，并对合成基因进行了密码子优化， 优化后的基因序列为SEQ ID N0. 2,其编码的氨基酸序列为SEQ ID N0. 1。
[0041] 采用PCR反应克隆木聚糖酶基因 XynQl片段，引物和反应条件如下：
[0042] 引物 1(F) :5' -GCGCGAATTCGCAGGTTTGAACGACGCAGCTAAG-3,
[0043] 引物 2 (R) : 5 ' -TAAAGCGGCCGCTTACAAGCATTGAGAATACCA-3 '
[0044] 反应条件为：94°C变性5min ;然后94°C变性30s，56°C复性30s，72°C延伸90s，30 个循环后，72°C保温lOmin。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，琼脂糖电泳结果如图1所 示，XynQl基因为大小1167bp的片段。
[0045] 实施例2重组表达木聚糖酶基因的毕赤酵母工程菌的构建
[0046] 2. 1、表达载体的构建
[0047] 将克隆得到的木聚糖酶基因 XynQl片段，用限制性内切酶EcoR I和Not I进行 双酶切，1〇〇μ 1酶切体系如下：木聚糖酶基因 XynQIPCR产物40μ 1、10XH bufferlOy 1、 10XBSA10yl、EcoR I5yl、Not Ι5μ1、(ΜΗ2030 μ1。37°C酶切 4h 后，琼脂糖凝胶电泳回 收。
[0048] 将表达载体pPIC9K先用限制性内切酶EcoR I进行单酶切，100 μ 1酶切体系如下： 表达载体pPIC9K20y 1、10XH bufferlOy l、EcoR Ι5μ 1、(ΜΗ2065 μ 1。371：酶切4h后，琼脂 糖凝胶电泳回收。将回收片段再用限制性内切酶Not I进行单酶切，100 μ 1酶切体系如下： PPIC9K回收片段20μ 1、10XH bufferlOy l、10XBSA10y l、10XTritonl0y l、Not Ι5μ 1、 ddH2045 μ 1。37 °C酶切4h后，琼脂糖凝胶电泳回收。
[0049] 将经EcoR I和Not I双酶切的XynQl片段与表达载体pPIC9K相连接，构建表达 载体？？扣91(17成1，如图2所示。连接体系如下：表达载体？？扣91(5以137成1片段3 4 1、 10XT4ligase bufferly 1、T4ligasely 1。22°C 连接过夜，转化到大肠杆菌 DH5a，挑取转 化子测序验证。测序验证正确的转化子转接到LB液体培养基中，37°C过夜培养，提质粒，即 为重组酵母表达质粒pPIC9K-XynQl。
[0050] 2. 2、转化与筛选
[0051] 将重组酵母表达质粒pPIC9K-XynQl用Sal I进行线性化，线性化片段用柱纯化 试剂盒纯化后，通过电穿孔法转化毕赤酵母GS115,涂布MD平板。在MD平板上生长出的菌 落即为毕赤酵母工程菌株，然后涂布含不同浓度遗传霉素的YH)平板上筛选多拷贝的转化 子。
[0052] 2. 3、发酵验证
[0053] 挑取单个阳性转化子转接于BMGY培养基中，30°C，250rpm振荡培养Id后，再转入 BMM培养基中，30°C，250rpm振荡培养，每天添加0. 5%的甲醇。诱导表达4d后，离心去除 菌体，将上清液进行SDS-PAGE电泳检测（图3)。如图3所示，箭头所指处即为本发明的重 组表达木聚糖酶XYNQ1，分子量为40kDa左右。上清液中木聚糖酶活力测定结果显示，摇瓶 水平下木聚糖酶XYNQ1的表达量达到160U/ml。将上述阳性转化子命名为巴斯德毕赤酵母 XYN-Q1 (Pichia pastoris XYN-Ql)〇
[0054] 木聚糖酶酶活力检测方法如下：
[0055] 取2ml浓度为1%的木聚糖底物（pH5. 5乙酸-乙酸钠缓冲液配制)，加入到比色管 中，37°C平衡lOmin，再加入2ml经pH5. 5乙酸-乙酸钠缓冲液适当稀释并经37°C平衡好的 酸性木聚糖酶酶液，混匀于37°C精确保温反应30min。反应结束后，加入5ml DNS试剂，混匀 以终止反应。然后沸水浴煮沸5min，用自来水冷却至室温，加蒸馏水定容至25ml，混匀后， 以标准空白样为空白对照，在540nm处测定吸光值AE。
[0056] 酶活单位定义：在37°C、pH值为5. 5的条件下，每分钟从浓度为5mg/ml的木聚糖 溶液中释放1 μ mol还原糖所需要的酶量即为一个酶活力单位U。
[0057] 酶活计算公式：
[0058]
【权利要求】
1. 一种木聚糖酶，其具有： 1. SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列；或者 2) 在SEQ ID NO: 1中取代、缺失或添加一个或几个氨基酸得到的具有斜卧青霉的木聚 糖酶活性的氨基酸序列。
2. 权利要求1所述的木聚糖酶，其编码基因为 1) 核苷酸序列SEQ ID NO:2所示的DNA分子；或者 2) 在严格条件下与SEQ ID N0:2所示核苷酸序列杂交且编码具有木聚糖酶活性的蛋白 质的DNA分子。
3. -种木聚糖酶，其在pH4. 0-7. 0的范围内能保持80%以上的活性，在温度40-70°C的 范围内，能保持50%以上的活性，最适pH值为5. 0,最适反应温度为60°C。
4. 权利要求1至3中任一项所述的木聚糖酶在生产低聚木糖中的用途。
5. -种重组毕赤酵母工程菌，其携带有含权利要求1至3中任一项所述木聚糖酶的编 码基因的表达载体。
6. 权利要求5所述的重组毕赤酵母工程菌，其中所述的表达载体为pPIC9K。
7. 权利要求5或6所述的重组毕赤酵母工程菌，其中所述的毕赤酵母工程菌为毕赤酵 母菌株GS115。
8. 权利要求5至7中任一项所述的重组毕赤酵母工程菌在在生产低聚木糖中的用途。
9. 一种生产低聚木糖的方法，该方法包括： (1) 发酵培养权利要求5至7中任一项所述的重组毕赤酵母工程菌，获得木聚糖酶； (2) 用获得的木聚糖酶酶解含木聚糖的原料，得到低聚木糖产物。
10. 权利要求9所述的生产低聚木糖的方法，其中所述的低聚木糖产物中低聚木二 糖?低聚木七糖的含量高于70%，低聚木二糖?低聚木四糖含量高于50%，单糖含量低于 30%。
【文档编号】C12N1/19GK104099311SQ201310129942
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2013年4月15日 优先权日:2013年4月15日
【发明者】肖志壮, 徐晓东, 付娟, 王霁昀, 刘安邦, 王海, 刘鲁民, 刘国栋, 陈梅, 曲音波 申请人:青岛蔚蓝生物集团有限公司