多核苷酸及其用途
【专利摘要】本发明提供了包含与靶核酸3’端和5’端互补的互补区的多核苷酸、包含所述多核苷酸的组合物和试剂盒，以及产生与靶核酸互补的核苷酸序列的方法。相应地，与靶核酸3’端结合的区域被缩短，靶核酸被扩增以具有优良的特异性。
【专利说明】多核苷酸及其用途
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2012年11月19日提交至韩国知识产权局的韩国专利申请10-2012-0131026的权益，该专利申请的公开内容通过引用全部并入本文。
【技术领域】
[0003]本公开涉及多核苷酸及其用途，所述多核苷酸包含与靶核酸3’端和5’端互补的互补区。
【背景技术】
[0004]核酸的扩增方法包括在有核酸聚合酶的情况下从引物的3’端延伸核苷酸序列。引物包含与靶核酸互补的序列。为了延伸核苷酸序列，引物和靶核酸必须能够特异并稳定地相互杂交。对于短核酸，引物设计是困难的。已知核酸杂交产物的稳定性与互补序列的长度成比例。此外，如果增加引物的长度，需要扩增的靶核酸长度就会缩短。因此，仍有需要发展这样的多核苷酸，所述多核苷酸中引物能够特异并稳定地结合靶核酸，同时被扩增的靶核酸的特异性得以提高。
[0005]发明概述
[0006]本发明提供了包含与靶核酸3’端和5’端互补的互补区的多核苷酸。
[0007]本发明提供了用于靶核酸扩增的组合物，所述组合物包含含有与所述靶核酸3 ’端和5’端互补的互补区的多核苷酸。
[0008]本发明提供了用于靶核酸扩增的试剂盒，所述试剂盒包含含有与所述靶核酸3 ’端和5’端互补的互补区的多核苷酸。
[0009]本发明提供了产生与靶核酸互补的核苷酸序列的方法，所述方法使用包含与所述靶核酸3’端和5’端互补的互补区的多核苷酸。
【专利附图】
【附图说明】
[0010]由以下对实施方案的描述，结合附图，可以看出并且更容易理解这些和/或其他方面。
[0011]图1的示意图展示了本发明实施方案所述的多核苷酸，以及本发明实施方案所述的产生与靶核酸互补的核苷酸序列的方法；
[0012]图2的示意图展示了本发明实施方案所述的多核苷酸的引发效果；
[0013]图3的示意图展示了按照第一互补区和第二互补区长度的引发效果；
[0014]图4的示意图展示了使用本发明实施方案所述的多核苷酸的检测灵敏度；
[0015]图5A至5C的示意图展示了靶核酸(分别为miR-16、miR-21和miR-206)的检测灵敏度；
[0016]图6A和6B的示意图展示了靶核酸(分别为miR-16和miR-210)的特异性。
[0017]发明详述[0018]现详细参考实施方案，所述实施方案的例子在附图中进行了举例说明，附图中同样的编号在各附图中指代相同的部分。就这方面来说，这些实施方案可以具有不同的形式，不应当理解为仅限于本文给出的描述。相应地，通过参考图表，下文对实施方案的描述仅用于解释本说明书的各个方面。本文中，术语“和/或”包括一或多个相关列举项的任何和所有组合。诸如“至少一个”的表达方式，当位于元件列表之前时修饰的是整个元件列表，不是修饰列表中的个别元件。
[0019]根据本发明的实施方案，提供了多核苷酸，所述多核苷酸包含第一互补区和第二互补区，所述第一互补区与靶核酸3’端的至少两个连续核苷酸互补；所述第二互补区与靶核酸5’端的至少两个连续核苷酸互补；其中第一互补区位于第二互补区的3’端方向。[0020]所述多核苷酸的第一互补区可以与靶核酸3’端的至少两个连续核苷酸互补。例如，多核苷酸的第一互补区可以与靶核酸3’端的2个核苷酸(2nt)、3nt、4nt、5nt、6nt或7nt互补。例如，第一互补区的长度可以是2nt-7nt。第一互补区可以包含DNA、RNA、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)或核苷酸类似物。
[0021]所述多核苷酸的第二互补区可以与靶核酸5’端的至少两个连续核苷酸互补。例如，多核苷酸的第二互补区可以与祀核酸5’端的3nt、4nt、5nt、6nt、7nt、8nt、9nt、10nt、lint、12nt、13nt、14nt、15nt、16nt、17nt、18nt、19nt 或 20nt 互补。例如，第二互补区的长度可以是3nt-20nt。第二互补区可以包含DNA、RNA、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)或核苷酸类似物。
[0022]所述多核苷酸的第一互补区可以位于第二互补区的3’端方向。第一互补区和第二互补区可以没有隔开，或者可以相距至少一个核苷酸。
[0023]所述多核苷酸可以是DNA或RNA。此外，所述多核苷酸可以是核苷酸类似物，例如PNA和LNA。例如，所述多核苷酸的第二互补区可以包含核苷酸类似物，例如PNA和LNA。可以不仅在第二互补区而且在第一互补区中含有核苷酸类似物，例如PNA和LNA。多核苷酸可以是单链的。多核苷酸的长度可以是7nt-200nt、7nt-180nt、7nt-150nt、7nt-130nt、7nt-100nt、7nt-80nt、7nt-50nt、7nt-30nt、7nt-20nt、7nt_15nt 或 IOnt - 40nt。
[0024]靶核酸可以是DNA、RNA、或者DNA和RNA的嵌合体。靶核酸可以是单链或者双链的。祀核酸的长度可以是 15nt_200nt、15nt_180nt、15nt_150nt、15nt_130nt、15nt_100nt、15nt_80nt、15nt_50nt、15nt_40nt 或者 15nt_30nt。祀核酸可以是小 RNA。例如，小 RNA 可以是非编码RNA、micro RNA(miRNA)、小干扰RNA(siRNA)、tRNA或脱帽mRNA。真核细胞的天然mRNA带有5’ -帽子。但在保存或处理生物样品或从中分离的mRNA的过程中，mRNA可能发生降解。这种情况中，分离的产物可以没有天然RNA的5’帽子。5’-帽子是mRNA5’端核糖的5’ -OH与7-甲基鸟苷酸通过三磷酸键连接形成的结构，或者是所述连接的分解产物鸟苷酸与mRNA5’端核糖的5’ -OH连接形成的结构。此外，靶核酸可以是含有至少200个核苷酸的RNA，在这种情况下，所述RNA可以是，含有GC含量小于30%或者至少80%的30个连续核苷酸的区域的RNA ;包含具有互补序列的至少5个连续核苷酸从而能够形成分子内二级结构的RNA ;包含相互互补的至少5个连续核苷酸的RNA ;或者它们的组合。
[0025]所述多核苷酸可以还包含位于多核苷酸第二互补区5’端方向的不与靶核酸互补的第三区域。例如，所述第三区域可以位于第二互补区的5’端方向。例如，多核苷酸可以处于5’-第三区域-第二互补区-第一互补区-3’的形式。多核苷酸的第三区域的长度可以是 3nt_200nt。第三区域的例子可以包含 3nt-200nt、3nt-180nt、3nt-150nt、3nt-130nt、3nt-100nt、3nt-80nt、3nt-50nt、3nt-40nt或者3nt_30nt。所述第三区域可以包含引物序列、限制性酶识别位点、或者探针结合位点。第三区域可以包含DNA、RNA、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)或者核苷酸类似物。第三区域和第二互补区可以没有隔开或者相距至少lnt。这种情况中，连接分子可以包含引物结合位点、限制性酶识别位点或者探针结合位点。
[0026]多核苷酸可以作为模板依赖性核酸合成中的引物。因此，多核苷酸可以作为引物使用。多核苷酸还可以作为用于证实样品中靶核酸的存在的探针。
[0027]多核苷酸可以含有位于第一互补区和第三区域之间的第二互补区，以便缩短第一互补区的长度并且增加通过逆转录产生的DNA的长度。DNA长度的增加使得更容易设计RNA的特异引物。此外，第二互补区的存在可以提高靶核酸检测的灵敏度和特异性。
[0028]根据本发明的另一个实施方案，提供了用于靶核酸扩增的组合物，所述组合物包含含有第一互补区和第二互补区的多核苷酸，所述第一互补区与靶核酸3’端的至少两个连续核苷酸互补；所述第二互补区与靶核酸5’端的至少两个连续核苷酸互补；其中第一互补区位于第二互补区的3’端方向。
[0029]此处的多核苷酸和靶核酸在上文已有描述。
[0030]所述组合物是用于扩增靶核酸的组合物。扩增方法可以是已知的核酸扩增方法。靶核酸的扩增可以是DNA扩增或者RNA扩增。扩增方法可以在热循环或者等温条件下进行。扩增方法的例子包括聚合酶链式反应(PCR)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、连接酶链式反应(LCR)、链置换扩增(SDA)、滚环复制(RCA)等。而且，扩增方法可以包括扩增RNA的方法。例如扩增方法可以包括逆转 录(RT)或者RT-PCR。扩增过程可以是增加靶核酸序列或其互补序列的拷贝数的过程。术语“PCR”在本文是指，用聚合酶，从特异性结合靶核酸的引物对，来扩增靶核酸的方法。
[0031]因此，组合物可以还包含已知用于靶核酸扩增的物质。例如，组合物可以还包含核酸聚合酶、适合核酸聚合酶活性的缓冲液、辅因子和/或底物。所述核酸聚合酶可以是选自DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆转录酶中的一种或者是它们的组合。术语“逆转录”可以指，用RNA作为模板，合成与RNA序列互补的DNA链。核酸聚合酶可以具有链置换活性。例如，核酸聚合酶可以是来源于逆转录病毒(例如HIV、MMLV或AMV)的至少一种逆转录酶。核酸聚合酶可以不具有3’->5’核酸外切酶活性。组合物可以包含用于逆转录或者PCR扩增的物质。
[0032]根据本发明 的另一个实施方案，提供了用于扩增靶核酸的试剂盒，所述试剂盒包含含有第一互补区和第二互补区的多核苷酸，所述第一互补区与靶核酸3’端的至少两个连续核苷酸互补；所述第二互补区与靶核酸5’端的至少两个连续核苷酸互补；其中第一互补区位于第二互补区的3’端方向。
[0033]此处的多核苷酸和靶核酸在上文已有描述。
[0034]所述试剂盒是用于扩增靶核酸的试剂盒。扩增方法可以是已知的核酸扩增方法。靶核酸的扩增可以是DNA扩增或者RNA扩增。扩增方法可以在热循环或者等温条件下进行。扩增方法的例子包括PCR、NASBA、LCR、SDA、RCA等。而且，扩增方法可以包括扩增RNA的方法。例如扩增方法可以包括RT或者RT-PCR。扩增过程可以是增加靶核酸序列或其互补序列的拷贝数的过程。术语“PCR”在本文是指，用聚合酶，从特异性结合靶核酸的引物对，来扩增靶核酸的方法。
[0035]因此，试剂盒可以还包含已知用于靶核酸扩增的物质。例如，试剂盒可以还包含核酸聚合酶、适合核酸聚合酶活性的缓冲液、辅因子和/或底物。例如试剂盒可以包含更多的革巴核酸。所述核酸聚合酶可以是选自DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆转录酶中的一种或者是它们的组合。术语“逆转录”可以指，用RNA作为模板，合成与RNA序列互补的DNA链。核酸聚合酶可以具有链置换活性。例如，核酸聚合酶可以是来源于逆转录病毒(例如HIV、MMLV或AMV)的至少一种逆转录酶。核酸聚合酶可以不具有3’->5’核酸外切酶活性。试剂盒可以包含用于逆转录或者PCR扩增的物质。此外，试剂盒可以还包含如何扩增靶核酸的使用说明书。
[0036]根据本发明的另一个实施方案，提供了产生与祀核酸互补的核苷酸序列的方法，所述方法包括，将靶核酸与包含第一互补区和第二互补区的多核苷酸杂交，所述第一互补区与靶核酸3’端的至少两个连续核苷酸互补，所述第二互补区与靶核酸5’端的至少两个连续核苷酸互补，其中第一互补区位于第二互补区的3’端方向；并在有核酸聚合酶的情况下，对杂交的样品进行温育，从而由所述多核苷酸的3’端生成与靶核酸互补的核苷酸序列。
[0037]所述方法包括将靶核酸与包含第一互补区和第二互补区的多核苷酸杂交，所述第一互补区与靶核酸3’端的至少两个连续核苷酸互补，所述第二互补区与靶核酸5’端的至少两个连续核苷酸互补，其中第一互补区位于第二互补区的3’端方向。
[0038]此处的多核苷酸和靶核酸在上文已有描述。
[0039]杂交过程可以通过已知方法进行。例如，可以通过将所述多核苷酸与靶核酸在已知适合核酸杂交的缓冲液中温育来进行杂交过程。杂交过程可以在从大约o°c到大约250C (例如大约4°C)的合适温度进行。可以根据选中的多核苷酸和靶核酸的序列和长度适当地调节杂交温度。可以将杂交过程进行合适的时间段，例如大约I到大约12小时(过夜)。
[0040]所述方法包括在有核酸聚合酶的情况下，对杂交的样品进行温育，从而由多核苷酸的3’端生成与靶核酸互补的核苷酸序列。
[0041]核酸聚合酶可以是选自DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆转录酶中的一种或者是它们的组合。术语“逆转录”可以指，用RNA作为模板，合成与RNA序列互补的DNA链。核酸聚合酶可以具有链置换活性。例如，核酸聚合酶可以是来源于逆转录病毒(例如HIV、MMLV或AMV)的逆转录酶。核酸聚合酶可以不具有3’->5’核酸外切酶活性。
[0042]温育过程可以在适合核酸聚合酶活性的条件下进行。温育过程可以在有核酸聚合酶、适合核酸聚合酶活性的缓冲液、辅因子和酶底物的情况下将进行。例如，可以在有用于RT或PCR扩增的物质的情况下进行温育过程。
[0043]经过温育过程，可以从所述多核苷酸的3’端生成与靶核酸互补的核苷酸序列。该生成过程包括，从所述多核苷酸的3’端延伸，利用核酸聚合酶替换与靶核酸杂交的多核苷酸的5’端。
[0044]所述方法还可以包括确定是否存在生成的产物，即与靶核酸互补的核苷酸序列。作为确定的结果，如果存在产物，则样品中存在靶核酸。否则，如果产物不存在，则样品中不存在该靶核酸。
[0045]此外，所述方法还可以包括利用产物，即与靶核酸互补的核苷酸序列，作为模板来扩增核酸。扩增过程可以通过已知方法来进行。扩增方法在上文中已有描述。
[0046]现参考以下实施例，更详细地描述本发明的一或多个实施方案。但这些实施例仅供阐释目的，不是为了限制发明范围。
[0047]实施例1.双杂交逆转录引物的制备
[0048]由多核苷酸3’端制备与靶核酸互补的序列(以下称为“双杂交引物”或“双杂交逆转录引物”)，所述序列包含第一互补区和第二互补区，所述第一互补区与靶核酸3’端的至少两个连续核苷酸互补，所述第二互补区与靶核酸5’端的至少两个连续核苷酸互补，其中第一互补区位于第二互补区的3’端方向。作为对照，使用了不含有第二互补区的通用引物(以下称为“线性引物”或“3’引发RT引物”)。双杂交RT引物包含位于第二互补区5’端方向的不与靶核酸互补的区域。与靶核酸不互补的区域包含通用PCR引物序列。
[0049]在图1中，〃1〃代表靶核酸。〃la〃代表含有与2a互补的核酸序列的靶核酸3’端。"Ib〃代表含有与2b互补的核酸序列的靶核酸5’端。“2”代表RT引物。“2a”代表含有与Ia互补的核酸序列的RT引物3’端(第一互补区)。“2b”代表含有与Ib互补的核酸序列的RT引物的5’端(第二互补区)。“2c”包含PCR引物序列和不与靶核酸互补的区域(第三区域)。“3”代表由RT酶合成的DNA。“3b”是与Ib相同的核酸序列，其中RT酶将杂交的2b取代为lb。
[0050]实施例2.通过双杂交RT引物检测靶核酸的效果
[0051]对分别通过双杂交RT引物和3’引发RT引物进行的靶核酸检测的结果进行了比较。
`[0052]靶核酸miRNA、3’引发RT引物、双杂交RT弓丨物和miRNA特异性PCR弓丨物的序列如表1所示。
[0053]〈表1>
[0054]
【权利要求】
1.包含第一互补区和第二互补区的多核苷酸，所述第一互补区与靶核酸3’端的至少两个连续核苷酸互补，所述第二互补区与靶核酸5’端的至少两个连续核苷酸互补， 其中第一互补区位于第二互补区的3’端方向。
2.如权利要求1所述的多核苷酸，其中所述第一互补区包含与靶核酸3’端的约2-7个连续核苷酸互补的核苷酸。
3.如权利要求1所述的多核苷酸，其中所述第二互补区包含与靶核酸5’端的约3-20个连续核苷酸互补的核苷酸。
4.如权利要求1所述的多核苷酸，其中第一互补区的长度是大约2-大约7个核苷酸。
5.如权利要求1所述的多核苷酸，其中第二互补区的长度是大约3-20个核苷酸。
6.如权利要求1所述的多核苷酸，其中祀核酸的长度是大约15-大约200个核苷酸。
7.如权利要求1所述的多核苷酸，其中靶核酸是RNA。
8.如权利要求1所述的多核苷酸，其中靶核酸是非编码RNA、microRNA(miRNA)、小干扰 RNA (siRNA)、tRNA 或脱帽 mRNA。
9.如权利要求1所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸还包含位于第二互补区5’端方向的不与靶核酸互补的第三区域。
10.如权利要求9所述的多核苷酸，其中第三区域包含引物序列、限制酶识别位点、或者探针结合位点。
11.如权利要求1所述的多核苷酸，其中第一互补区和第二互补区有至少一个包含DNA、RNA、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)或核苷酸类似物。
12.如权利要求9所述的多核苷酸，其中第三区域包含DNA、RNA、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)或核苷酸类似物。
13.用于靶核酸扩增的组合物，所述组合物包含多核苷酸，该多核苷酸含有: 与靶核酸3’端的至少两个连续核苷酸互补的第一互补区；和 与靶核酸5’端的至少两个连续核苷酸互补的第二互补区， 其中第一互补区位于第二互补区的3’端方向。
14.用于靶核酸扩增的试剂盒，所述试剂盒包含多核苷酸，该多核苷酸含有: 与靶核酸3’端的至少两个连续核苷酸互补的第一互补区；和 与靶核酸5’端的至少两个连续核苷酸互补的第二互补区， 其中第一互补区位于第二互补区的3’端方向。
15.产生与祀核酸互补的核苷酸序列的方法,所述方法包括: 将靶核酸与包含第一互补区和第二互补区的多核苷酸杂交，所述第一互补区与靶核酸3’端的至少两个连续核苷酸互补，所述第二互补区与靶核酸5’端的至少两个连续核苷酸互补，其中第一互补区位于第二互补区的3’端方向；和 在有核酸聚合酶的情况下对杂交的样品进行温育，从而由所述多核苷酸的3’端生成与靶核酸互补的核苷酸序列。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述核酸聚合酶具有链置换活性。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述具有链置换活性的核酸聚合酶是逆转录酶。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述逆转录酶来源于HIV、MMLV或AMV。
19.如权利要求15所述的 方法，其中靶核酸是RNA。
20.如权利要求15所 述的方法，其中靶核酸是非编码RNA、micro RNA(miRNA)、小干扰RNA (siRNA)、tRNA 或脱帽 mRNA。
【文档编号】C12N15/10GK103820436SQ201310129764
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2013年4月15日 优先权日:2012年11月19日
【发明者】朴东贤, 洪性宇, 朴卿希, 李妙龙 申请人:三星电子株式会社