专利名称：酶法测定钠离子含量的方法及钠离子诊断试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及酶法测定血清、血浆等样品中钠离子含量的方法，以及应用该方法配制而成的钠离子诊断试剂盒，属于医学检验测定技术领域。
背景技术：
血清中钠离子含量(简称“血钠”)在临床上有着非常重要的意义，医学上有三个决定水平，依次为水平1——115mmol/l，水平2——135mmol/l，水平3——150mmol/l。当患者血钠浓度等于或低于水平1时，可出现神志不清、疲劳、恶心、头痛、呕吐和厌食等症状，表明机体内水的比例大于钠，应采用相应治疗措施；当血钠浓度低于水平2时，应查找低钠血症的原因，进一步测定血清渗透压、血钾并进行尿液分析，以确定诊断；当血钠浓度高于水平3时，应检查其它试验项目，寻找导致高钠血症的原因。
现有技术中测定钠离子含量的常用方法有火焰光度计法、离子选择电极法、化学测定法、原子分光光度法、酶动力学法等。
火焰光度计法——1950年开始使用并一直沿用至今，可检测血清、尿液、脑脊液及胸腹水中的Na+和K+，是一种发射光谱分析法，其结果准确可靠，广为临床采用。该方法分为内标准法和外标准法两种。外标准法操作误差较大，一般不采用。现在主要使用内部标准法，即向标本及标准液中加进相同浓度的内部标准元素锂或铯进行测定，操作时，将含锂的溶液作为稀释液，同时测定K+、Na+和Li+的浓度，以标本与标准液的Na+/Li+与K+/Li+比值，计算Na+、K+浓度。由于血清稀释倍数大，血清蛋白质粘性的影响几乎可以忽略不计。
离子选择电极法——简称ISE法，是采用灵敏的特定专用电极，在专用仪器上进行血清和尿等体液中的K+、Na+的测定，因标本用量少，快速准确，几乎有取代其它方法的趋势。其测定原理是，用离子选择电极与参比电极组合起来，浸泡在待测标本溶液中进行检测。目前已有的电极种类有□玻璃膜电极，感应材料为玻璃薄膜，有PH电极、K+电极和Na+电极；□固相膜电极，由难溶性金属物质加压成型，以固体膜或单日膜作为感应膜，有Cl-电极和F-电极；□液态膜电极，将环氧树脂或内装聚氯乙稀作为感应膜，有Ca2+电极；□用缬氨霉素膜制成的K+电极。上述电极均有一定的使用寿命，因为电极使用一段时间后就会自动老化，有效期长短不一。目前离子选择电极法应用也较为普遍，但是电极成本昂贵。
此外，化学测定法主要利用复环王冠化合物如穴冠醚或球冠醚，作为离子载体进行测定。由于大环结构内有空穴，分子内部的氧原子有未共用电子对可与金属离子结合，根据空穴大小，可选择性结合不同直径的金属离子，从而达到测出离子浓度的目的；原子分光光度法也可用于检测血清中K+、Na+，但操作繁杂，误差较大，不及火焰光度法简便。
酶法测定钠离子含量的方法，与火焰光度计法或离子选择电极法都有较好的一致性，这种方法抗干扰性强、稳定性好，但用生化分析仪不能同时测定钠离子和钾离子各自的含量，导致这种方法不能得到推广应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种可以克服现有技术缺陷的酶法测定钠离子含量的方法，以及应用该方法配制而成的钠离子诊断试剂盒。采用该试剂盒中的试剂，能够利用紫外/可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪测定出血清、血浆等样品中钠离子含量，测定过程不受钾离子的影响，测定速度快、准确度高，为临床及化学分析中推广酶法检测钠离子含量提供技术支撑。
为实现本发明的目的之一，一种酶法测定钠离子含量的方法，采用以下步骤进行
首先，将需要测定的样品与含有o-硝基酚基-β-D-吡喃糖苷半乳糖和β-半乳糖苷酶的试剂混匀，使之发生以下反应，
然后，将反应混合物置于紫外/可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪下，检测主波长405nm的吸光度的上升速度，进而测算出样品中钠离子的含量。
测定过程中，被测样品与试剂的使用比例按体积控制在1∶10～1∶500，反应温度控制在20℃～50℃，反应时间控制在2～30分钟，检测时设定副波长在505nm以上。
实现本发明另外一个目的——钠离子诊断试剂盒，可以是由以下成分组成的单剂缓冲液40～200mmol/l，o-硝基酚基-β-D-吡喃糖苷半乳糖1～10mmol/l，β-半乳糖苷酶 4000～60000U/l，稳定剂/试剂总体积 10～80％。
也可以将以上单剂中的成分进行组合配制成双剂，使试剂更为稳定，比如
双剂配方不仅仅限于上述表中所列，其中试剂I和试剂II中成分可以互换，从而形成多种配方。
以上配制钠离子诊断试剂盒时，选择缓冲液的基本要求是PH值在6.0～11.0范围之内，可以是“三羟甲基氨基甲烷～盐酸(Tris-HCl)缓冲液”、“三乙醇胺(Triethanolamine)缓冲液”、“2-氨基-2-甲基-1-丙醇(2-Amino-2-methyl-1-propanol)缓冲液”、“咪唑～盐酸(Imidazole-HCl)缓冲液”、“双甘氨肽(Glycylglycine)缓冲液”、“柠檬酸～柠檬酸钾缓冲液”、“巴比妥钠～盐酸缓冲液”、“碳酸钾～碳酸氢钾缓冲液”、“硼酸～硼砂缓冲液”、“甘氨酸～氢氧化钾缓冲液”、“硼砂～氢氧化钾缓冲液”或者“磷酸钾(Potassium Phosphate)缓冲液”中的至少一种，但缓冲液的选择范围并不受这些列举所限制。
此外，为减少各试剂成分之间的交叉影响、保持试剂的稳定性，以便长期储存，以上单剂、双剂的试剂I/试剂II当中通常加入稳定剂，其用量约占所在试剂总体积的10～80％(或者浓度在10～50mmol/l范围之内)。用作稳定剂的物质可以是乙二醇、丙二醇、甘油、硫酸铵、硫基乙醇、葡萄糖、腺苷二磷酸、牛血清白蛋白、碳酸盐、胆酸盐、葡聚糖、乙二胺四乙酸、黄素腺嘌呤二核苷酸、黄素单核苷酸、谷氨酸盐、还原型谷胱甘肽、乳糖、甘露醇或者丁二酸盐中的至少一种，但选择范围同样不受这些列举所限制。
研究表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂还是双剂，如下配方成分关系的诊断试剂盒较为理想，也是本发明的优选方案缓冲液80～120mmol/l，o-硝基酚基-β-D-吡喃糖苷半乳糖2～8mmol/l，β-半乳糖酶 10000～30000U/l，
稳定剂/试剂总体积20～50％。
本发明应用半乳糖苷酶反应比色法，在钠离子的激活下，β-半乳糖苷酶酶解o-硝基酚基-β-D-吡喃糖苷半乳糖成为o-硝基酚和半乳糖，使得405nm处的吸光度上升，反应所引起的吸光度变化与样品中钠离子的含量成正比。这样，通过在固定时间间隔内测定主波长405nm处吸光度的上升速度，便能定量反映出样品中钠离子的含量。
本发明技术方案的突出的实质性特点和显著的进步主要表现在(1)本发明完全利用酶学方法，酶解反应具有特异性高的特点，通过钠离子激活β-半乳糖苷酶的特性，定量反映出被测样品中钠离子的含量，测试结果准确，不受样品中是否存在钾离子的影响；(2)参与酶反应的成分都是外加的，不受内、外源物质的污染，测试过程精确度高；(3)该方法简便、易操作，可快速得到检测结果，而且反应是在缓冲液条件下进行，不会污染环境；(4)该方法在普通紫外/可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪上便可快速检测，不需要特殊或额外仪器，测试成本低廉，便于行业内推广应用，可望在临床和化学分析中取代火焰光度计法，使钠离子含量成为常规分析项目；(5)应用本发明提供的测定方法可以制成液态试剂、干粉试剂、干试剂等多种形式的试剂，主要用于测定人体和其它动物体内钠离子的含量，也可以结合稀释、浓缩等辅助手段来测定其它样品中的钠离子；(6)本发明提供的液态钠离子诊断试剂盒，稳定性好，存在于其中的各种成分的三维空间结构保持完整，很好地保证了应用测试效果。配成双剂以后，能够进一步降低各成分之间的交叉影响，检测结果更加可信，试剂更为稳定，可以长时间储存。
具体实施例方式
下面结合具体实施例对本发明技术方案作进一步说明。这些例子仅是一些应用范例，不能理解为对本发明权利要求保护范围的一种限制。
实施例一(单剂)按以下成分和用量配制钠离子诊断试剂盒双甘氨肽缓冲液 80mmol/l，o-硝基酚基-β-D-吡喃糖苷半乳糖 2mmol/l，β-半乳糖苷酶10000U/l，乙二醇 50％(占试剂总体积)。
在全自动生化分析仪(日立-7080)上设定温度37℃、反应时间10分钟、测试主波长405nm、测试副波长505nm以上，被测钠离子样品与试剂的体积比例为1∶25，反应方向为正反应(吸光度上升，下同)。
加入样品和配成的单剂，两者在分析仪内部自动混匀，检测、记录405nm吸光度的上升情况。根据速率法、终点法等方法，对照相应的标准曲线测算出样品中钠离子的含量。对同一批样品多次重复以上过程，测试结果重复性好、精确度高。
实施例二(双剂例之一)按以下成分和用量配制钠离子诊断试剂盒试剂I——咪唑～盐酸缓冲液 100mmol/l，o-硝基酚基-β-D-吡喃糖苷半乳糖5mmol/l，甘油 20mmol/l；试剂II——咪唑～盐酸缓冲液 100mmol/l，β-半乳糖苷酶 20000U/l，乙二醇50％(占试剂II总体积)。
在全自动生化分析仪(日立-7080)上设定温度30℃、反应时间15分钟、测试主波长405nm、测试副波长505nm以上，被测钠离子样品与试剂I和试剂II的总体积之比为1∶25，试剂I与试剂II的用量之比为4∶1，反应方向为正反应。
先加入样品和试剂I，5分钟之后加入试剂II，三者在分析仪内部自动混匀，检测、记录405nm吸光度的上升情况。根据速率法、终点法等方法，对照相应的标准曲线测算出样品中钠离子的含量。对同一批样品多次重复以上过程，测试结果重复性好、精确度高。
实施例三(双剂例之二)按以下成分和用量配制钠离子诊断试剂盒试剂I——Tris-HCl缓冲液 120mmol/l，β-半乳糖苷酶 30000U/l，甘油 50％(占试剂I总体积)；试剂II——Tris-HCl缓冲液 120mmol/l，o-硝基酚基-β-D-吡喃糖苷半乳糖8mmol/l，丙二醇50％(占试剂II总体积)。
在全自动生化分析仪(日立-7080)上设定温度37℃、反应时间10分钟、测试主波长405nm、测试副波长505nm以上，被测钠离子样品与试剂I和试剂II的总体积之比为1∶25，试剂I与试剂II的用量之比为4∶1，反应方向为正反应。
先加入样品和试剂I，5分钟之后加入试剂II，三者在分析仪内部自动混匀，发生以下原理性反应
检测、记录405nm主波长吸光度的上升情况。根据速率法、终点法等方法，对照相应的标准曲线测算出样品中钠离子的含量。对同一批样品多次重复以上过程，测试结果重复性好、精确度高。
总之，实验证明采用本发明的测定方法，完全可以通过紫外/可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪器，测定出样品的中钠离子的含量，测试灵敏度高、精确度好，不受样品中是否存在钾离子的影响，也不受内、外源物质的污染。而且，本发明提供的钠离子诊断试剂盒，稳定性好，长时间存放之后仍然能够准确检测各种类型样品中钠离子的含量。
权利要求
1.一种酶法测定钠离子含量的方法，包括以下步骤①将待测样品与含有o-硝基酚基-β-D-吡喃糖苷半乳糖和β-半乳糖苷酶的试剂混匀，使之发生以下反应，②将反应混合物置于紫外/可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪下，检测主波长405nm的吸光度的上升速度，测算出样品中钠离子的含量。
2.根据权利要求1所述的酶法测定钠离子含量的方法，其特征在于待测样品与试剂的使用比例按体积控制在1∶10～1∶500。
3.根据权利要求1或2所述的酶法测定钠离子含量的方法，其特征在于反应温度控制在20℃～50℃，反应时间控制在2～30分钟，检测时设定副波长在505nm以上。
4.一种钠离子诊断试剂盒，盒中试剂由以下成分组成缓冲液 40～200mmol/l，o-硝基酚基-β-D-吡喃糖苷半乳糖 1～10mmol/l，β-半乳糖苷酶4000～60000U/l，稳定剂/试剂总体积10～80％。
5.根据权利要求4所述的钠离子诊断试剂盒，其特征在于所述缓冲液的PH范围是6.0～11.0。
6.根据权利要求5所述的钠离子诊断试剂盒，其特征在于所述缓冲液是“三羟甲基氨基甲烷～盐酸缓冲液”、“三乙醇胺缓冲液”、“2-氨基-2-甲基-1-丙醇缓冲液”、“咪唑～盐酸缓冲液”、“双甘氨肽缓冲液”、“柠檬酸～柠檬酸钾缓冲液”、“巴比妥钠～盐酸缓冲液”、“碳酸钾～碳酸氢钾缓冲液”、“硼酸～硼砂缓冲液”、“甘氨酸～氢氧化钾缓冲液”、“硼砂～氢氧化钾缓冲液”或者“磷酸钾缓冲液”中的至少一种。
7.根据权利要求4所述的钠离子诊断试剂盒，其特征在于所述稳定剂为乙二醇、丙二醇、甘油、硫酸铵、硫基乙醇、葡萄糖、腺苷二磷酸、牛血清白蛋白、碳酸盐、胆酸盐、葡聚糖、乙二胺四乙酸、黄素腺嘌呤二核苷酸、黄素单核苷酸、谷氨酸盐、还原型谷胱甘肽、乳糖、甘露醇或者丁二酸盐中的至少一种。
8.权利要求4～7中任意一种钠离子诊断试剂盒，其特征在于所述试剂配成单剂或双剂。
全文摘要
本发明涉及酶法测定钠离子含量的方法及钠离子诊断试剂盒。发明应用半乳糖苷酶反应比色法，在钠离子的激活下β－半乳糖苷酶酶解o－硝基酚基－β－D－吡喃糖苷半乳糖，使得405nm主波长的吸光度上升，其吸光度变化幅度与样品中钠离子的含量成正比，从而定量反映出样品中钠离子的含量。该方法特异性高，不受样品中钾离子的影响，也不受内、外源物质的污染，测试结果精确、准确性好。将诊断试剂盒制成双剂可减少各成分的交叉影响，保持试剂的稳定性，便于长期储存。该方法在普通紫外/可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪上便可快速检测，不需要特殊或额外仪器，测试成本低廉，便于行业内推广应用。
文档编号C12Q1/34GK1786186SQ200410066188
公开日2006年6月14日 申请日期2004年12月10日 优先权日2004年12月10日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司