专利名称：生物人工肝用猪和人肝细胞的制备方法
技术领域：
本发明属于医学生物技术领域，涉及生物人工肝的制备技术，具体为一种生物人工肝所使用的猪肝和人肝细胞的制备方法。
背景技术：
随着肝细胞分离、高密度培养以及生物反应器等技术的日臻成熟，新一代以培养肝细胞为基础的现代生物人工肝(bioartificial liver，BAL)——体外人工肝支持系统(extracorporealbioartificial liver support system，EBLSS)被认为是治疗因各种原因所致暴发性肝衰竭(fulminant hepatic failure，FHF)最有前途的，并已在动物实验及临床应用中取得了确切疗效。BAL的基本原理结构是将培养的外源性肝细胞放置或继续培养于体外生物反应器中，当患者血液或血浆流经反应器时，通过半透膜或直接接触的方式与培养的肝细胞进行物质交换，其中的肝细胞发挥清除毒素和中间代谢产物、参与生物合成和生物转化及分泌具有促进肝细胞生长的活性物质等功能，从而达到暂时的支持作用。肝细胞作为BAL的主要生物成分，在该系统中扮演举足轻重的角色。
迄今国外多使用猪、狗等动物异种肝细胞及肿瘤来源的肝细胞进行BAL治疗研究。前者尤其是猪肝细胞被认为是BAL应用中最容易、价廉且能大量获得的肝细胞来源。近年来的实验证明猪肝细胞具有人肝细胞类似的P450活性和代谢功能，优于其他动物肝细胞。许多以猪肝细胞为基础构建BAL治疗急性肝功能衰竭(acute hepatic failure，AHF)已进入一/二期临床试验。为此制备大量、高活性的猪肝细胞成了发展BALS的关键技术，自Howard和Pesch等于30年前，首次分离到无损伤大鼠肝细胞并进行肝细胞生理学研究以来，肝细胞的分离技术不断改进，尤其是Seglen的二步灌流法，被证明对分离多种动物肝细胞均非常有效。近年来本发明人对大鼠和乳猪肝细胞进行了大量的分离实验研究，发现Seglen的二步灌流法对猪肝细胞消化分离不甚满意，为此对猪肝细胞的分离采用以胶原酶为主的有关试剂，如用含EDTA的D-hanks液和0.05％IV型胶原酶液，用自制的体外循环灌流装置，行两步灌流法分离猪肝细胞，获得高质量的猪肝细胞，但在分离过程中受胶原酶和其它因素影响，肝细胞膜受到不同程度破坏。本发明的目的在于进一步探求高质量的猪肝以及人肝细胞的分离技术，提供更为合理的猪肝和人肝细胞的制备方法。
发明内容
本发明的方案为一种生物人工肝用猪和人肝细胞的制备方法，该方法主要包括肝脏的体外灌流，肝细胞洗涤二个过程，所述肝脏的体外灌流采用下述(1)-(4)四步灌流过程(1)在常温条件下用含EDTA的灌流液PBE按所用肝脏重量的4-5倍量灌注，采用尖细滴管经蠕动泵灌流3-5分钟，然后用预先加热至39℃的含EDTA的灌流液PBE，采用按所用肝脏重量的8-10倍量继续灌流5-10分钟；(2)用不含EDTA的灌流液PB按所用肝脏重量的5-7倍量灌注3-5分钟，然后将肝脏转移至新的无菌盆中；(3)将预热至39℃的含Dispase的灌流液PBD，按按所用肝脏重量的5-7倍量继续灌流5-8分钟后，弃去半量的含Dispase的灌流液；(4)将预热至39℃的含胶原酶和氯化钙的灌流液PBC，按所用肝脏重量的5-7倍量继续灌流5-8分钟，然后继续用灌流液PBD与PBC混合重复循环灌流5-8分钟，直至肝包膜与肝细胞分离，用手术刀片切开肝包膜、分离未消化的肝组织和结缔组织，收集肝细胞悬液。
所述肝细胞洗涤的过程为(1)在低温条件下，用含氯化钙、Hepes和牛血清白蛋白的肝细胞洗涤缓冲液湿润150-200微米孔径的不锈钢筛网或二层脱脂纱布，用湿润的150-200微米孔径的不锈钢筛网或二层脱脂纱布过滤上述肝细胞悬液中的肝细胞，4℃条件下，用离心力50-60离心100-150秒；(2)弃去离心上清液，用含DNase的肝细胞洗涤缓冲液重悬沉淀肝细胞，经70-100微米孔径的不锈钢筛网或尼龙膜过滤，滤液在4℃条件下用离心力50-60离心100-120秒；(3)将过程(2)重复操作一次；(4)弃去离心上清夜，用肝细胞洗涤缓冲液重悬肝细胞，肝细胞悬液在4℃条件下用离心力50-60离心60秒；
(5)弃去离心上清夜，沉淀肝细胞用细胞培养基重悬、调节细胞浓度为1×106个每毫升、置冰浴中备用。
以上所述的灌流液PB每100毫升中含有0.9克氯化钠，0.042克氯化钾，0.21克碳酸氢纳，0.09克葡萄糖，0.3-0.6克Hepes，余量为去离子水；加入0.02-0.05克EDTA后配制成灌流液PBE；或加入0.5-1.0克Dispase后配制成灌流液PBD；或加入0.03-0.1克胶原酶和0.055克2水氯化钙后配制成灌流液PBC。
以上所述含氯化钙、Hepes和牛血清白蛋白的肝细胞洗涤缓冲液每100毫升中含有0.7克氯化钠，0.0461克氯化钾，0.013克2水氯化钙，0.3-0.6克Hepes，0.05-0.15克牛血清白蛋白，余量为去离子水。
以上所述含DNase的肝细胞洗涤缓冲液每100毫升中含有0.01克6水氯化镁，0.01克7水硫酸镁，0.01-0.03克DNase，余量为去离子水。
本发明在现有二步灌流分离肝细胞方法的基础上提出了四步灌流分离法，有效地提高了分离肝细胞的数量、活率和纯度。
具体实施例方式
为进一步说明本发明的内容，以下通过具体方案进一步描述。
本方案以外科方法获取正常猪、或狗、或成人肝移植供肝、或合法引产来源的人胚胎肝脏80克为例分离制备肝细胞。
首先在外科无菌条件下切取部分肝组织，置于预冷至4℃、含500ml灌流缓冲液PB的无菌容器中，称重为80克左右，切除多余肝组织。然后在常温条件下用含EDTA的灌流液PBE300ml，采用尖细滴管经蠕动泵灌流3分钟，然后用预先加热至39℃的700ml含EDTA的灌流缓冲液PBE继续灌流5分钟；接着用预先加热至39℃的500ml不含EDTA的灌流缓冲液PB灌注3分钟；之后弃去上述所有灌流缓冲液，将肝脏转移至新的无菌盆中；利用预热至39℃的500ml含Dispase的灌流缓冲液PBD继续灌流5分钟；弃去无菌盆中200ml含Dispase的灌流缓冲液，继续用预热至39℃的500ml含胶原酶的灌流缓冲液灌流5分钟；之后利用上述已灌流过的PBD和PBC再继续重复循环灌流10-15分钟，直至肝包膜与肝细胞分离，用无菌手术刀片切开肝包膜、分离未消化的肝组织和结缔组织，收集肝细胞悬液。在低温条件下，用含氯化钙、Hepes和牛血清白蛋白的肝细胞洗涤缓冲液WB 20ml先湿润150-200微米左右孔径的不锈钢筛网或二层脱脂纱布，过滤上述肝细胞悬液，收集肝细胞滤液分装于4个容积为250ml的无菌离心瓶，用50g离心力、4℃条件下，离心100秒；弃去离心上清液，用4℃预冷的600ml含DNase的肝细胞洗涤缓冲液WBD重悬沉淀肝细胞，经70-100微米孔径的不锈钢筛网或尼龙膜过滤，收集肝细胞滤液分装于4个容积为250ml的无菌离心瓶，用50g离心力、4℃条件下，离心110秒；弃去离心上清液，再重复用4℃预冷的600ml WBD重悬、洗涤、离心一次；弃去离心上清液，收集沉淀肝细胞，用4℃预冷的500ml肝细胞洗涤缓冲液WB重悬沉淀肝细胞，分装于4个容积为250ml的无菌离心瓶，用50g离心力、4℃、离心60秒；；弃去离心上清夜，沉淀肝细胞用50ml细胞培养液重悬、进行肝细胞活率、纯度和细胞总数测定，最后根据所需细胞的用途调节细胞浓度并置于冰浴中备用。
本发明制备的肝细胞与现有的二步灌流法制备的肝细胞相比较如下表所示
从上表可以看出，本发明的四步灌流法所获取的肝细胞在活率、数量、纯度方面显著优越于现有技术。本发明制备的肝细胞可广泛用于细胞移植、生物型人工肝和混合型人工肝治疗。
权利要求
1.生物人工肝用猪和人肝细胞的制备方法，主要包括肝脏的体外灌流，肝细胞洗涤二个过程，其特征在于所述肝脏的体外灌流采用下述(1)-(4)四步灌流过程(1)在常温条件下用含EDTA的灌流液PBE按所用肝脏重量的4-5倍量灌注，采用尖细滴管经蠕动泵灌流3-5分钟，然后用预先加热至39℃的含EDTA的灌流液PBE，采用按所用肝脏重量的8-10倍量继续灌流5-10分钟；(2)用不含EDTA的灌流液PB按所用肝脏重量的5-7倍量灌注3-5分钟，然后将肝脏转移至新的无菌盆中；(3)将预热至39℃的含Dispase的灌流液PBD，按按所用肝脏重量的5-7倍量继续灌流5-8分钟后，弃去半量的含Dispase的灌流液；(4)将预热至39℃的含胶原酶和氯化钙的灌流液PBC，按所用肝脏重量的5-7倍量继续灌流5-8分钟，然后继续用灌流液PBD与PBC混合重复循环灌流5-8分钟，直至肝包膜与肝细胞分离，用手术刀片切开肝包膜、分离未消化的肝组织和结缔组织，收集肝细胞悬液。
2.按权利要求1所述生物人工肝用猪和人肝细胞的制备方法，其特征在于所述肝细胞洗涤的过程为(1)在低温条件下，用含氯化钙、Hepes和牛血清白蛋白的肝细胞洗涤缓冲液湿润150-200微米孔径的不锈钢筛网或二层脱脂纱布，用湿润的150-200微米孔径的不锈钢筛网或二层脱脂纱布过滤上述肝细胞悬液中的肝细胞，4℃条件下，用离心力50-60离心100-150秒；(2)弃去离心上清液，用含DNase的肝细胞洗涤缓冲液重悬沉淀肝细胞，经70-100微米孔径的不锈钢筛网或尼龙膜过滤，滤液在4℃条件下用离心力50-60离心100-120秒；(3)将过程(2)重复操作一次；(4)弃去离心上清夜，用肝细胞洗涤缓冲液重悬肝细胞，肝细胞悬液在4℃条件下用离心力50-60离心60秒；(5)弃去离心上清夜，沉淀肝细胞用细胞培养基重悬、调节细胞浓度为1×106个每毫升、置冰浴中备用。
3.按权利要求1所述生物人工肝用猪和人肝细胞的制备方法，其特征在于所述灌流液PB每100毫升中含有0.9克氯化钠，0.042克氯化钾，0.21克碳酸氢纳，0.09克葡萄糖，0.3-0.6克Hepes，余量为去离子水；加入0.02-0.05克EDTA后配制成灌流液PBE；或加入0.5-1.0克Dispase后配制成灌流液PBD；或加入0.03-0.1克胶原酶和0.055克2水氯化钙后配制成灌流液PBC。
4.按权利要求1或2所述生物人工肝用猪和人肝细胞的制备方法，其特征在于每100毫升含氯化钙、Hepes和牛血清白蛋白的肝细胞洗涤缓冲液中含有0.7克氯化钠，0.0461克氯化钾，0.013克2水氯化钙，0.3-0.6克Hepes，0.05-0.15克牛血清白蛋白，余量为去离子水。
5.按权利要求1或2所述生物人工肝用猪和人肝细胞的制备方法，其特征在于每100毫升含DNase的肝细胞洗涤缓冲液中含有0.01克6水氯化镁，0.01克7水硫酸镁，0.01-0.03克DNase，余量为去离子水。
全文摘要
生物人工肝用猪和人肝细胞的制备方法，该方法包括了分离肝细胞的体外灌流和肝细胞洗涤两个过程，在现有二步灌流法的基础上采用了四步灌流的方法，并设计了四步灌流的有关试剂，该发明有效提高了分离肝细胞的数量、活率和纯度，方法适用于以外科方法获取的正常猪、或狗、或成人肝移植供肝、或合法引产来源人胚胎肝脏的肝细胞分离，制备的肝细胞可广泛用于肝细胞研究、肝细胞移植、生物型人工肝和混合型人工肝等。
文档编号C12N5/08GK1632107SQ20041008462
公开日2005年6月29日 申请日期2004年11月26日 优先权日2004年11月26日
发明者李兰娟, 李君 申请人:浙江大学