专利名称：海岛棉花粉管通道法转基因技术的制作方法
技术领域：
本申请涉及一种海岛棉品质改良技术，属于植物基因工程和农业生物技术领域。更具体地，本申请涉及海岛棉花粉管通道转基因方法，及用此方法得到的转移外源目的基因的海岛棉。
背景技术：
棉花在分类上属于双子叶植物纲，锦葵科，棉属(Gossypium L.)，是世界上最重要的栽培农作物之一。原产于高温、干旱、短日照的热带和亚热带的荒漠草原，多年生。经过人类长期栽培驯化，才逐步成为一年生的栽培作物。棉花是唯一由种子生产纤维的农作物。棉纤维是纺织工业的主要原料；棉子含油分、蛋白质，是食品工业的原料；棉短绒也是化学工业和国防工业的重要物资。
棉属中包括许多棉种，其中有4个栽培种草棉、亚洲棉、陆地棉和海岛棉。栽培最广泛的是陆地棉，其产量约占世界棉花总产量的90％；海岛棉约占5～8％；亚洲棉约占2～5％；草棉已很少栽培。
海岛棉(G.barbadens L)起源于南美洲西北部秘鲁等地区。18世纪中叶引进西印度群岛种植，称海岛棉。经过栽培驯化，出现一年生类型。海岛棉因其优异的纤维品质，使其经济价值远远高于其它栽培种，是特纺工业和高档织物不可缺少的原料。海岛棉在全世界仅有埃及、美国、中国、中亚地区、秘鲁等少数国家可以种植。在中国，也仅有新疆有较大面积栽培。海岛棉是常异花授粉作物，长期的人工驯化和杂交，使其遗传背景越来越狭窄，已很难找到抗逆基因和品质改良基因。近缘野生种虽具有一些抗逆基因和品质改良基因，但栽培价值低，并且通过人工杂交实现基因转移，使双亲的遗传组成在染色体水平上进行交换和重组，效率低，育种周期长，因此传统的棉花育种面临着种质资源匮乏，远缘杂交困难等难以克服的问题。而利用转基因技术，将目的基因转入海岛棉，是在DNA分子水平上进行重组和交换，可提高效率，缩短育种周期，无疑将在发展海岛棉生产上和对海岛棉品种进行遗传改良具有重要意义。
通过植物遗传转化技术，将目的基因导入棉花是棉花基因工程研究的基本环节，在棉花基因转移研究实践中应用较广的方法是花粉管通道法、农杆菌介导法和基因枪轰击法。后两种方法的主要不足是必须建立一个良好的体细胞再生体系，但棉花是相对难以进行植物体细胞组织培养的作物，胚胎发生具有明显的基因型限制，体细胞再生系统在一般品种中难以建立；并且体细胞组织培养过程中容易发生基因型变异；转化成本相对较高。花粉管通道法是一种借助于植物自身的种质细胞卵细胞或受精卵为转化对象的直接转化技术，通过花粉管通道将外源总体DNA或外源基因在自花授粉前后的适当时期导入胚囊，转化尚不具备正常细胞的卵、合子或早期胚胎细胞。此技术最早由我国学者周光宇提出(周光宇，龚蓁蓁，王自芬，远源杂交的分子基础——DNA片段杂交假设的一个论证。遗传学报，1979，6(4)405-412)，并在长期科学研究中不断发展。周光宇等在充分调查国内外植物远缘杂交的变异后，针对那些远缘杂交所产生的、而在染色体水平上观察不到的表型变异，认为这些表型变异是染色体水平以下的DNA片段杂交产生的结果，即DNA片段杂交假说。该假说认为，尽管远源杂交亲本间的染色体结构从整体上来看是不能亲和的，但从进化的角度来分析，其部分基因间的结构有可能保持一定的亲和性。并结合植物开花受精过程的解剖学特征，认为外源基因或DNA可以通过花粉管通道进入受精胚囊，称为″花粉管通道法(途径)″(pollen-tube pathway)。已有的实验证明，远缘杂交后代基因组中确有DNA片段杂交现象存在，该技术的建立为花粉管导入外源基因的整合奠定了基础，开创了整株植物活体基因转化的新途径。其优点是不受基因型限制、易操作且成本较低。现今利用此方法，已将外源基因导入受体植物，经Southern等分子检测获得了外源基因稳定表达的转基因植物，陆地棉是此技术首先成功的受体植物(Zhou G.Y.，Wengj.，Zheng Y.，et al，Introduction of exogenous DNAinto cotton embryos.Methods in Enzymolofy，1983，101433-448.)。我国于1993年开始，已成功地将主要作用于鳞翅目类害虫的Bt基因、Bt+CPT1(豇豆胰蛋白酶抑制剂基因)双价基因、对蚜虫有控制作用的雪花莲凝集素基因(sGNA)、抗真菌病害的几丁质酶基因、葡聚糖酶基因、葡萄氧化酶基因等数种功能基因，及其各种基因的组合，陆续导入我国棉花主栽陆地棉品种之中，如泗棉3号、中棉所12号、中棉所19号、中植372、苏棉8号、苏棉12号、泗棉167、泗阳168、石远321、新陆早4号、新陆早7号、新陆早8号、辽棉15和3517、541、916、C6524、Q0101、苏引A等多个优良品种(系)，获得了目标性状稳定表达的转基因植株，通过选育形成了不同类型的转基因抗虫、抗病陆地棉品系和品种。参见下表1。
表1.花粉管通道途径转化获得的转基因陆地棉
花粉管通道法在陆地棉上一般的操作方法为首先选择次日将开放的花蕾进行自交，在开花后12-24小时左右即开花次日，选择果枝和花位较好的幼子房作为转化对象。用50μl微量进样器作为注射的工具，注射时摘除或剥去花瓣，抹平花柱，右手持微量进样器，左手轻扶摘除花瓣后的幼子房，从抹平花柱处沿子房的纵轴方向进针至子房长度的约2/3处，并后退至1/3处，轻缓操作注射器，将DNA溶液推入受精子房中。若将这种操作应用在生理特性更加敏感的海岛棉上，会对幼嫩子房造成极大伤害，导致座铃率几乎为零。
由于海岛棉与陆地棉相比，其生理特性更加敏感，自然落铃率较高，并且子房较小(海岛棉子房直径为1-2cm，陆地棉子房直径为2-3cm)，若受到外力作用，则更易脱落。再则一般陆地棉花粉管在授粉后16小时左右到达胚囊，而海岛棉在授粉后12小时左右已伸入胚珠。因此，利用现有的花粉管通道转基因技术，如文献CN1229141A及CN1251862A所述，其转化率远远低于陆地棉，几乎为零。因此，此技术需针对不同的作物采用不同方法细则操作。
发明内容
本发明的目的在于提供一种海岛棉花粉管通道转基因方法，其特征在于包含以下步骤1)去除变成紫红色的花冠，2)用微量注射器从断面沿花柱中轴插入子房长度的约1/4处，再退回2毫米左右，3)注入含外源目的基因的缓冲液，4)进行培养，获得转基因植株。
本发明提供的方法，其特征在于，另外包含在去除变成紫红色的花冠后，剪去2/3柱头的步骤。
本发明提供的方法，其特征在于，另外包含在注入含外源基因的缓冲液后，去处未处理的花的步骤。
本发明提供的方法，其中所述花冠位于海岛棉中上部果枝第一或第二个果节位的花上。
本发明所提供的方法中，其中所述含外源基因的缓冲液在注入前于-20℃-0℃预冷却，和所述注入是在开花授粉后8-16小时内，于15-30℃的温度下进行。
本发明所提供的方法中，其中所述含外源基因的缓冲液中含有10PPM赤霉素。
本发明的目的在于提供一种用上述方法获得的转化了外源目的基因的海岛棉。
用于本发明方法的外源基因可以为棉花或非棉花基因，来源可为种间，属间，科间以至微生物。外源基因可以为各种品质、抗性及其它有益性状基因。例如蜘蛛丝基因，运转蛋白基因，伸展蛋白基因等。
用于转基因的受体为海岛棉品种、品系或者中间材料。如海岛棉品种新海5号，新海14号，新海15号，新海16号，新海17号，新海18号，新海19号，新海20号和新海21号等。
由于海岛棉下部果枝的自然脱落率较高，故在进行海岛棉花粉管通道转化时，选择海岛棉中上部果枝第一或第二个果节位的花，在开花授粉后8-16小时内，天气晴朗且气温在15-30℃时导入外源目的基因，以避开不利生理条件和环境条件的影响。
对受体进行转基因的生理时间为其自花授粉后8-16小时。
抗性检测的选择剂根据载体上所具有的标记基因而定。如对于Npt II基因选用卡那霉素，对于Bar基因选用Basta除草剂，浓度为50-1000PPM，处理时间为3-5天。将经选择剂选择后的抗选择剂单株在幼苗期取叶片提取DNA做PCR等分子标记检测分析。对转化植株进行农艺性状鉴定筛选，株系、品系培育，获得含目标性状的优良种质、品系或品种，实现创新和改良。
由于海岛棉生理特性更加敏感，用于陆地棉的花粉管通道法会对幼嫩子房造成极大伤害，导致座铃率几乎为零。而本发明的方法涉及去除变成紫红色的花冠，注意不损伤幼嫩子房的表皮层，露出柱头，用小剪剪去2/3柱头，用微量注射器(10或50μl)从断面沿花柱中轴轻柔插入子房长度的约1/4处，再退回2毫米左右，小心注入在-20℃--0℃下预冷的10微升含外源目的基因的缓冲液，该操作有别于陆地棉现有应用技术，是适应海岛棉本身的生理特性，并最大程度上减轻了对子房的机械伤害、渗透以及膨胀的伤害，尽可能地提高了成铃率和转基因种子的转化效率。完成该操作后，挂牌标记已转基因的棉花幼铃，并在牌子上记载编号或基因供体和时间。另外，在含外源目的基因缓冲液中加入10PPM的赤霉素，以防止和减少幼铃的脱落。同时去除所作标记果枝上其余未作处理和下部果枝的花，以保证所做处理的花有足够的养分供给，进一步提高座铃率。
因此，本发明的方法具有以下优势1、具有独创性。目前海岛棉转基因未见有任何方法转化成功的报道，本发明是在大量实验的基础上，得到了花粉管通道转化技术应用于海岛棉的适宜条件，首次实现海岛棉品种的转化改良。
2、座铃率和转化率高。通过各种改良措施使座铃率高达10-15％，转化率达1--5％。
3、可操作性强。可在田间直接进行，不需要特殊的设备，且无基因型依赖。
4、育种效率高。要获得一个纯系或品种，常规方法至少需要6-8年，本方法仅需要3-5年。可大大缩短育种周期。
5、成本低。与基因枪轰击法和农杆菌介导法相比，不需要使用昂贵的设备和耗费大量的组织培养化学药品。
本发明的方法简便、经济、有效，改变了现有花粉管通道技术在海岛棉上转化率低的现状。用此方法向海岛棉转移各种来源的DNA分子，以达到有效改变海岛棉遗传组成，创造海岛棉新种质、改良海岛棉品种的目的。相对于现有技术，本发明的方法具有转化效率高、改良时间短、便于推广等优点。
图1为转入运转蛋白基因(GhABC1)的海岛棉品种新海16号的照片，其中如图中箭头所示，抗性植株不出现黄斑，而非抗性植株出现黄斑。
图2为转化转运蛋白基因的转基因植株的PCR鉴定照片，其中(M)代表PCR的MARKER，(+)为以含目的基因GH的质粒载体为模板的阳性对照，(-)代表阴性对照，4911-4、4911-5、4911-9、4911-12、4911-13、4911-17、4911-21均为检测出的阳性株。
图3为转入伸展蛋白基因(Expansin gene)的海岛棉品种新海17号的照片，其中如图中箭头所示，抗性植株不出现黄斑，而非抗性植株出现黄斑。
图4为转化伸展蛋白基因的转基因植株的PCR鉴定照片，图中(M)代表PCR的MARKER，(+)为以含目的基因E的质粒载体为模板的阳性对照，(-)代表阴性对照，(BLK)代表空白对照3284-1、3284-2、3284-5均为检测出的阳性株。
具体实施例方式
以下根据实施例详细描述本发明。所述实施例仅是用于解释本发明的目的，而不能以任何方式解释为对本发明的限制。
实施例1.将运转蛋白基因(GhABC1)转入海岛棉品种新海16号，培育纤维品质改良的海岛棉新品种将新海16号(新疆农业科学院经济作物研究所提供)种植至开花，按照《分子克隆实验指南》(金冬雁，黎孟枫等译，J.萨姆布鲁克，E.F.弗里奇，T.曼尼阿蒂斯著。科学出版社，1992)提取含运转蛋白基因的质粒DNA。具体如下进行。
含运转蛋白基因的大肠杆菌菌株由中国科学院植物生理生化研究所提供，将该菌株接种到30ml含相应抗生素的LB液体培养基中(Luria-Bertani)，配制每升培养基，应在950ml蒸馏水中加入胰蛋白胨10克，酵母提取物5克，NaCl10克，摇动容器直至溶质完全溶解，用5M NaOH调节PH7.0，加入蒸馏水至总体积1升，在1.034×105Pa高压灭菌20分钟)，37℃，300rpm培养8hr；取25ml加入含相同抗生素的500mlLB液体培养基中，于37℃，300rpm培养16hr；培养好的菌液于4℃以4000rpm离心15min，弃上清，加入100ml冰预冷的STE液(含0.1M NaCl，1mM EDTA，PH8.0；10mM Tric·HCl，PH8.0)洗涤沉淀；4000rpm，4℃离心15min，弃上清；加入18ml溶液I(50mM葡萄糖；25mM Tric·HCl，PH8.0；10mM EDTA PH8.0；配好后高压灭菌)，在涡旋震荡器上涡旋，使细菌沉淀充分散开；加40ml新配制的溶液II(0.2MNaOH，1％SDS)，盖紧瓶盖，缓慢颠倒离心瓶数次，以充分混匀内容物，室温放置6min；加20ml冰预冷的溶液III(5M乙酸钾60ml，冰乙酸11.5ml，水28.5ml)，封住瓶口，摇动离心瓶数次以混匀内容物，置冰上放置30min，形成白色絮状沉淀；4℃，4000rpm离心15min，用四层灭菌纱布把上清过滤至另一离心瓶中，加0.6倍体积异丙醇，充分混匀，于室温放置10min；室温，5000rpm离心15min，回收核酸；小心倒掉上清，敞开瓶口倒置使残余上清液流尽，于室温用70％乙醇洗涤沉淀和管壁，倒出乙醇，将瓶倒置放在纸巾上控干，在超净工作台上将瓶内乙醇吹干。
用3ml TE(PH8.0)溶解核酸沉淀，转入一个15ml离心管内，加3ml冰预冷的5M Licl溶液，充分混匀；4℃，1000rpm离心10min，将上清转至另一个30ml离心管内，加等量异丙醇，充分混匀，室温下以10000rpm离心10min，回收沉淀的核酸；小心倒掉上清，控干，用70％乙醇洗涤沉淀及管壁，流尽乙醇，敞开管口并将管倒置于纸巾上，在超净工作台上将管内乙醇吹干。
用500ul含无DNA酶的胰RNA酶(20ul/ml)的TE(PH8.0)溶解沉淀，将溶液转至一微量离心管中，室温放置30min；用酚、酚氯仿、氯仿各抽投一次，离心时间分别为12000rpm，6min，6min，10min；将水相转到另一个1.5ml离心管中，加100ul 10M乙酸铵，充分混匀，加2倍体积(约1ml)乙醇，-20℃放置30min；4℃，12000rpm离心10min，回收沉淀的质粒DNA；吸去上清，加200ul 4℃的70％乙醇，4℃ 12000rpm离心2min；吸去上清，在超净工作台上将管内乙醇吹干；取其中1次的质粒DNA用TE(PH8.0)稀释后测量OD260，计算质粒DNA的浓度，然后将质粒DNA贮存于-20℃。经电泳和紫外分光光度计测定质粒的浓度、纯度(浓度为0.02μg/μl，纯度为OD260/OD280在1.8-2.0之间)。保存于0℃--20℃。于盛花期，在6:00--10:00的时间，选择授粉后8-16小时，变成紫红色的花，去除整个花冠，剪下2/3柱头，用微量注射器从断面沿花柱中轴轻柔插入子房长度的约1/4处，再退回2mm左右，小心注入10微升加有10PPM赤霉素的在-20℃--0℃下预冷的含上述外源目的基因的缓冲液。去除所作标记果枝上其余未作处理和下部果枝的花，以保证所做处理的花有足够的养分供给。做好标记和记载。
按常规方法进行培养，在棉纤维成熟时，按标记进行收获、人工剥籽，得到转化棉籽。
将收获后的种子种植在海南，从幼苗展开第3片真叶时，根据目的基因所携带的选择标记基因，使用卡那霉素作为选择剂，浓度0.005-0.01g/ml，在叶片上用脱脂棉球棒进行涂抹，五天后观察变色情况。不抗者出现黄斑，抗者不出现黄斑。第四、第五片真叶依此操作，选择出抗性植株(参见图1)。
按常规方法，取抗性植株叶片提取DNA，进行PCR分析。
棉叶总DNA提取采用CTAB法。称取7-10mg棉花鲜叶片，液氮研磨至粉末状，加入1mlBuffer I(50mM Tris-HCl pH8.0，5mMEDTA pH8.0，350mM山梨醇，0.1％β-巯基乙醇，10％PEG6000)，混匀后转入2ml离心管中，4℃，12000rpm离心5分钟。去掉上清后用500μl的Buffer II(50mMTris-HCl pH8.0，5mM EDTA pH8.0，350mM山梨醇，0.1％β-巯基乙醇，1％SDS，710mM NaCl，0.1％CTAB)重悬沉淀，60℃保温10分钟。分别用等体积的苯酚和氯仿各抽提一次。将上清滴入等体积的异丙醇中进行沉淀。4℃，12000rpm离心去除异丙醇。DNA沉淀用70％乙醇洗后，干燥待用。
PCR特异引物由上海生工生物工程有限公司合成，其引物序列为第一轮上游P正(E6-81) 5`--CAC CAT TCA CCA CTT GCTC--3` 19bp(SEQ IDNO1)下游NOS1(AS1) 5`--CGA ATT CCC GAT CTA GTA AC-3` 20bp(SEQ IDNO2)第二轮上游P3(E6-S2) 5`--GCT CCT AAT TGA GTT GAA ATC TTT-3`24bp(SEQID NO3)下游93400(AS) 5`--TTC CCA ATA ACA GTA TCA GCG C-3` 22bp(SEQID NO4)PCR反应条件为
10×PCR Buffer2μl4×dNTP(2mM) 2μlTaq DNA(5u/μl) 0.4μl模板 100ng加水至20μl反应程序为第一轮1 94℃5m 1个循环 3 72℃10m 1个循环第二轮1 94℃2m 1个循环 3 72℃10m1个循环在进行完PCR反应之后，取反应混合物产物，通过1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及特异性(参见图2)。转运蛋白基因(GHABC)片段大小约650bp。经上述试验证实获得了转基因植株(参见图1)。
将转化植株进行农艺性状和纤维品质鉴定筛选(通过田间观察记载，收获考种鉴定株型，株高，铃数，单铃重，籽棉产量，衣分等农艺性状。同时利用HVI检测皮棉纤维品质)，获得了纤维品质(强度、长度)发生改变的转基因株系，经株系品系培育，获得含目标性状的优良种质、品系或品种，实现海岛棉的创新和改良。
实施例2.将伸展蛋白基因(Expansin gene)转入海岛棉品种新海17号，培育纤维品质改良海岛棉新品种将新海17号(新疆农一师阿拉尔农科所提供，)种植至开花，按照《分子克隆实验指南》提取含伸展蛋白基因的质粒DNA。具体如下。
含伸展蛋白基因的大肠杆菌由中国科学院微生物研究所提供，将该菌株接种到30ml含相应抗生素的LB液体培养基中(Luria-Bertani)，配制每升培养基，应在950ml蒸馏水中加入胰蛋白胨10克，酵母提取物5克，NaCl10克，摇动容器直至溶质完全溶解，用5MnaOH调节PH7.0，加入蒸馏水至总体积1升，在1.034×105Pa高压灭菌20分钟)，37℃，300rpm培养8hr；取25ml加入含相同抗生素的500mlLB液体培养基中，于37℃，300rpm培养16hr；培养好的菌液于4℃以4000rpm离心15min，弃上清，加入100ml冰预冷的STE液(含0.1M NaCl，1mM EDTA，PH8.0；10mM Tric·HCl，PH8.0)洗涤沉淀；4000rpm，4℃离心15min，弃上清；加入18ml溶液I(50mM葡萄糖；25mM Tric·HCl，PH8.0；10mM EDTA PH8.0；配好后高压灭菌)，在涡旋震荡器上涡旋，使细菌沉淀充分散开；加40ml新配制的溶液II(0.2MNaOH，1％SDS)，盖紧瓶盖，缓慢颠倒离心瓶数次，以充分混匀内容物，室温放置6min；加20ml冰预冷的溶液III(5M乙酸钾60ml，冰乙酸11.5ml，水28.5ml)，封住瓶口，摇动离心瓶数次以混匀内容物，置冰上放置30min，形成白色絮状沉淀；4℃，4000rpm离心15min，用四层灭菌纱布把上清过滤至另一离心瓶中，加0.6倍体积异丙醇，充分混匀，于室温放置10min；室温，5000rpm离心15min，回收核酸；小心倒掉上清，敞开瓶口倒置使残余上清液流尽，于室温用70％乙醇洗涤沉淀和管壁，倒出乙醇，将瓶倒置放在纸巾上控干，在超净工作台上将瓶内乙醇吹干。
用3ml TE(PH8.0)溶解核酸沉淀，转入一个15ml离心管内，加3ml冰预冷的5M Licl溶液，充分混匀；4℃，1000rpm离心10min，将上清转至另一个30ml离心管内，加等量异丙醇，充分混匀，室温下以10000rpm离心10min，回收沉淀的核酸；小心倒掉上清，控干，用70％乙醇洗涤沉淀及管壁，流尽乙醇，敞开管口并将管倒置于纸巾上，在超净工作台上将管内乙醇吹干。
用500ul含无DNA酶的胰RNA酶(20ul/m1)的TE(PH8.0)溶解沉淀，将溶液转至一微量离心管中，室温放置30min；用酚、酚氯仿、氯仿各抽投一次，离心时间分别为12000rpm，6min，6min，10min；将水相转到另一洐个1.5ml离心管中，加100ul 10M乙酸铵，充分混匀，加2倍体积(约1ml)乙醇，-20℃放置30min；4℃，12000rpm离心10min，回收沉淀的质粒DNA；吸去上清，加200ul 4℃的70％乙醇，4℃12000rpm离心2min；吸去上清，在超净工作台上将管内乙醇吹干；取其中1次的质粒DNA用TE(PH8.0)稀释后测量OD260，计算质粒DNA的浓度，然后将质粒DNA贮存于-20℃。，经电泳和紫外分光光度计测定质粒的浓度、纯度(浓度为0.02μg/μl，纯度为OD260/OD280在1.8-2.0之间)，保存于0℃--20℃。
于盛花期，在6:00--11:00的时间，选择授粉后8-16小时，变成紫红色的花，去除整个花冠，剪下2/3柱头，用微量注射器从断面沿花柱中轴轻柔插入子房长度的约1/4处，再退回2mm左右，小心注入10微升加有10PPM赤霉素的在-20℃--0℃下预冷的含外源目的基因的缓冲液。去除所作标记果枝上其余未作处理和下部果枝的花，以保证所做处理的花有足够的养分供给。做好标记和记载。
按常规方法进行培养，在棉纤维成熟时，按标记进行收获、人工剥籽，得到转化棉籽。
将收获后的种子种植在海南，从幼苗展开第3片真叶时，根据目的基因所携带的选择标记基因，使用卡那霉素作为选择剂，浓度0.005-0.01g/ml，在叶片上用脱脂棉球棒进行涂抹，五天后观察变色情况。不抗者出现黄斑，抗者不出现黄斑。第四、第五片真叶依此操作，选择出抗性植株(参见图3)。
按常规方法，将抗性植株取叶片提取DNA，进行PCR分析，从而获得转基因植株(参见图3)。
PCR特异引物由上海生工生物工程有限公司合成，其引物序列为exn55`--GCT AGC TCT TAC TCA AAT-3` 18bp(SEQ ID NO5)exn35`--GTC TTA AAA CTG GCC TCC-3` 18bp(SEQ ID NO6)PCR反应条件为10×PCR Buffer 2μl4×dNTP(2mM)2μlTaq DNA(5u/μl) 0.4μl模板100ng加水至 20μl反应程序为1 94℃3m 1个循环 3 72℃10m1个循环在进行完PCR反应之后，取反应混合物产物，通过1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及特异性(参见图4)。伸展蛋白基因(E)片段大小约814bp。
将转化植株进行农艺性状和纤维品质鉴定筛选(通过田间观察记载，收获考种鉴定株型，株高，铃数，单铃重，籽棉产量，衣分等农艺性状。同时利用HVI检测皮棉纤维品质。)，获得了纤维品质(强度、长度)发生改变的转基因株系，经株系品系培育，获得含目标性状的优良种质、品系或品种，实现海岛棉的创新和改良。
比较例花粉管通道法在陆地棉上一般的操作方法为首先选择次日将开放的花蕾进行自交，在开花后12-24小时左右即开花次日，选择果枝和花位较好的幼子房作为转化对象。用50μl微量进样器作为注射的工具，注射时摘除或剥去花瓣，抹平花柱，右手持微量进样器，左手轻扶摘除花瓣后的幼子房，从抹平花柱处沿子房的纵轴方向进针至子房长度的约2/3处，并后退至1/3处，轻缓操作注射器，将DNA溶液推入受精子房中。若将这种操作应用在生理特性更加敏感的海岛棉上，会对幼嫩子房造成极大伤害，导致座铃率几乎为零。
由于海岛棉下部果枝的自然脱落率较高，故在进行海岛棉花粉管通道转化时，选择海岛棉中上部果枝第一或第二个果节位的花，在开花授粉后8-16小时内，天气晴朗且气温在15-30℃时导入外源目的基因，以避开不利生理条件和环境条件的影响。首先，将变成紫红色的花，去除整个花冠，剪下2/3柱头，用微量注射器从断面沿花柱中轴轻柔插入子房长度的约1/4处，再退回2mm左右，然后小心注入10微升加有10PPM赤霉素的在-20℃--0℃下预冷的含外源目的基因的缓冲液。最后去除所作标记果枝上其余未作处理和下部果枝的花，以保证所做处理的花有足够的养分供给。做好标记和记载。
2002年分别用陆地棉所采用的花粉管通道法技术和本发明方法对海岛棉受体材料新海5号、19号、16号和17号进行了座铃率和转化效率的比较。具体结果见下表2。
表2.现有技术与本方法转化效率的对比
从上述结果可以看出，本发明的优点及积极效果是显著改变了海岛棉的转化率，原有的转化方法转化率为零，而本发明的转化率在3％左右，有时可达5％。
IN043754-序列表SEQUENCE LISTING<110>新疆溢达农业科技有限公司<120>海岛棉花粉管通道法转基因技术<130>IN043754<160>6<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>19<212>DNA<213>人工合成<400>1caccattcac cacttgctc 19<210>2<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>2cgaattcccg atctagtaac 20<210>3<211>24<212>DNA<213>人工合成<400>3gctcctaatt gagttgaaat cttt 24<210>4<211>22<212>DNA<213>人工合成
<400>4ttcccaataa cagtatcagc gc 22<210>5<211>18<212>DNA<213>人工合成<400>5gctagctctt actcaaat18<210>6<211>18<212>DNA<213>人工合成<400>6gtcttaaaac tggcctcc18
权利要求
1.一种海岛棉花粉管通道转基因方法，其特征在于包含以下步骤1)去除变成紫红色的花冠，2)用微量注射器从断面沿花柱中轴插入子房长度的约1/4处，再退回2毫米左右，3)注入含外源目的基因的缓冲液，4)进行培养，获得转基因植株。
2.权利要求1的方法，其特征在于，另外包含在去除变成紫红色的花冠后，剪去2/3柱头的步骤。
3.权利要求1的方法，其特征在于，另外包含在注入含外源基因的缓冲液后，去处未处理的花的步骤。
4.权利要求1的方法，其中所述花冠位于海岛棉中上部果枝第一或第二个果节位的花上。
5.权利要求1的方法，其中所述含外源基因的缓冲液在注入前于-20℃-0℃预冷却，和所述注入是在开花授粉后8-16小时内，于15-30℃的温度下进行。
6.权利要求5的方法，其中所述含外源基因的缓冲液中含有10PPM赤霉素。
7.权利要求1的方法，其中所述外源基因是棉花或非棉花基因，和来源于种间，属间，科间或微生物。
8.权利要求7的方法，其中所述外源基因是品质、抗性或其他有益性状基因。
9.权利要求8的方法，其中所述外源品质基因包括但不仅限于蜘蛛丝基因，运转蛋白基因或伸展蛋白基因。
10.一种用权利要求1的方法转化现有海岛棉品种所产生的新的海岛棉新品系和新品种。
11.权利要求10的现有海岛棉品种，包括但不仅限于海岛棉品种新海5号，新海14号，新海15号，新海16号，新海17号，新海18号，新海19号，新海20号和新海21号。
全文摘要
本发明涉及一种海岛棉品质改良技术。更具体地，本发明涉及一种海岛棉花粉管通道转基因方法，该方法简便、经济、有效，改变了现有花粉管通道技术在海岛棉上转化率低的现状。另外，本发明涉及用此方法获得的转化了外源目的基因的海岛棉。
文档编号C12N15/89GK1769466SQ20041009010
公开日2006年5月10日 申请日期2004年11月2日 优先权日2004年11月2日
发明者张玉高, 万旭中, 刘霞, 杨克锐, 黄全生, 王冬梅, 黄乐平, 李建平 申请人:新疆溢达农业科技有限公司