含有肽载体和表皮生长因子的融合蛋白和核酸及其用途的制作方法

专利名称：含有肽载体和表皮生长因子的融合蛋白和核酸及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及表皮生长因子的修饰。具体地，本发明涉及具有强穿透能力的经修饰表皮生长因子、其编码核酸、含有它们的组合物和它们的用途。
背景技术：
表皮生长因子是1962年Cohen(Life Sci.1965，4(17)1625-33)在小鼠颌下腺中发现、提取和分离出来的，由53个氨基酸残基组成的单链多肽，多肽中没有丙氨酸，苯丙氨酸和赖氨酸。它有三个二硫键，这些二硫键是它具有生物活性所必需的。EGF通过传导信号，引起细胞内一系列生化变化，启动与细胞分裂有关的基因，使静止细胞进入细胞分裂周期，从而使细胞增殖。极微量即能强烈促进细胞的分裂和生长。EGF不易穿透皮肤，也不易穿透粘膜，故只适合创口及粘膜表面，限制了其深层组织及全身用药的可能性。本发明将具有极强穿透能力的肽载体与之结合，克隆表达出人EGF融合蛋白，巧妙地解决了这一问题。
肽载体是人们近年来发现的一种蛋白质功能域，它能够引领其所承载的蛋白质穿过浆膜，并在细胞内积累，所以把它们称为蛋白质转导域(protein transduction domain，PTD)(Schwarze SR，DowdySF，Trends Pharmacol Sci.2000，21(2)45-8，Fawell，Proc NatlAcad Sci USA.1994 Jan 18；91(2)664-8.)。现在已经发现多种PTD，分别来自果蝇的同源异型转录蛋白Antp(Derossi D，et al.TheJournal of Biological chemistry.1996，27(30)18188-18193.)、单纯疱疹病毒的结构蛋白VP22(Elliott C，Ohare P.Cell.1997，88223-233)和人类I型免疫缺陷病毒的转录激活蛋白(Trans-activator transcription，TAT)(Fawell S.，Proc Natl AcadSci USA.1994 Jan 18；91(2)664-8.)及谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione-S-transferase，GST)(Shigeyuki Namiki etc，Biochemical and Biophysical Research Communication 2003，305592-7)。人类免疫缺陷病毒编码的反式激活蛋白TAT(86个氨基酸残基组成)在结构上可被划分为五个功能区(1)N端区域(氨基酸1-21)；(2)富含半胱氨酸的区域(氨基酸22-37)；(3)核心区域(氨基酸38-48)；(4)基础区域(氨基酸48-57)；(5)可变长度的C端。对TAT通过细胞膜的转导作用研究发现，TAT分子中一个富含碱性氨基酸，有较多正电荷的多肽片段与跨膜转导有关，因而被称为PTD，即蛋白转导结构域。
目的蛋白与PTD融合后，就可以很容易地将目的蛋白带入细胞中去。PTD的作用有以下特点(1)速度快；(2)温度适应性广；(3)目的蛋白进入细胞的数量依赖于培养液中融合蛋白的浓度；(4)融合蛋白几乎能够进入所有的培养细胞；(5)将融合蛋白注射入动物的腹腔，可以在很短时间内，到达所有的组织和器官；(6)能够被PTD带入细胞和机体的物质品种繁多，小分子化学物质、多肽、分子量从几千的多肽到几十万的蛋白质和核酸等都可被其引导进入细胞，甚至直径40纳米的铁珠和直径200纳米的脂质体等也能被带进细胞(Steven RS，Alan Ho，Adamina V et al.Science，1999，2851569-1572)。
PTD介导穿越细胞膜的机制与受体、转运蛋白都没有关系。PTD首先通过其自身的正电荷与细胞膜表面的负电荷相互作用，使融合蛋白依附在细胞膜上，然后通过α-螺旋的穿越作用使融合蛋白进入细胞。被PTD带入细胞的分子仍保留其原有的性质。PTD融合分子可以穿越皮肤、粘膜、甚至血脑屏障。

发明内容
本发明一方面涉及包含肽载体序列和表皮生长因子(EGF)的融合蛋白。优选地，肽载体序列是蛋白质转导域(PTD)或谷胱甘肽-S-转移酶(GST)。
在本发明中，表皮生长因子(EGF)可以是天然存在的，也可以是重组产生的或者合成产生的。在一个实施方案中，EGF是人EGF，例如重组人EGF。在一个具体实施方案中，表皮生长因子具有SEQ ID NO2所示的序列。
本发明的EGF包含等位基因变体和物种同系物，还包括突变体和变异体，它们保持EGF活性。
本领域技术人员能够理解，可以对EGF序列和肽载体序列例如本文公开的序列进行适当修饰，例如增加、替换、缺失一个或多个(如不超过20个，优选不超过15个，更优选不超过10个，8个，5个，甚至更优选不超过4个、3个、2个、1个)氨基酸，而仍然保留其活性。因此，本发明包括这些修饰的变异体在内。例如，本发明的EGF和肽载体包括具有与SEQ ID NO2或4或6具有至少70％的同一性(identity)并保留其活性的氨基酸序列的变异体。优选地，所示氨基酸序列与SEQ ID NO2或者4或者6具有至少80％的同一性，更优选至少90％的同一性，至少95％甚至98％、99％的同一性。更优选地，本发明EGF具有SEQ ID NO2的序列。同样，优选地，本发明肽载体序列具有SEQ ID NO4或6的序列。
在本发明融合蛋白中，肽载体序列优选位于EGF的N-端，也可以位于EGF的C-端或蛋白分子的其它位置。肽载体序列优选紧邻EGF，也可以通过间隔氨基酸序列和EGF相连。在优选的实施方案中，肽载体序列和EGF的前后顺序和连接方式(直接相连或者通过间隔氨基酸序列相连)分别使得肽载体序列能够有效地促进EGF穿越细胞膜。间隔氨基酸序列的选择以不损坏或降低肽载体序列和EGF的功能为准，因此是本领域技术人员已知的。例如，间隔氨基酸序列通常用于将融合蛋白两个成分分开，使它们在空间上不相互干扰。间隔氨基酸序列的长度可以是1-20个氨基酸或者更长，例如1-10个。
本发明的肽载体包括能够引领其所承载的蛋白质穿过浆膜的任何氨基酸序列，它可以天然的，也可以是人工合成的。
在一个实施方案中，肽载体序列选自果蝇的同源异型转录蛋白Antp、单纯疱疹病毒的结构蛋白VP22、人类I型免疫缺陷病毒的转录激活蛋白(TAT)的PTD或者谷胱甘-S-转移酶；优选人类I型免疫缺陷病毒的转录激活蛋白(TAT)及GST的PTD，特别地，具有SEQ ID NO4所示的序列。
在一个实施方案中，EGF是人EGF，例如重组人EGF。
本发明的融合蛋白还可以含有其它序列，例如间隔序列，有利于纯化的附加序列，例如在N端或C端含有6个组氨酸的标签。
在一个具体实施方案中，本发明的融合蛋白具有SEQ ID NO8所示的序列。
在另一方面，本发明涉及核酸分子，其具有选自以下核苷酸序列的序列(1)编码上述融合蛋白的核苷酸序列；(2)与(1)的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
本发明的核酸分子包含编码肽载体和表皮生长因子的核苷酸序列。还可以包含编码间隔序列、附加序列等氨基酸序列的核苷酸序列。
本发明编码肽载体和表皮生长因子的核苷酸序列可以是任何能够编码具有活性的肽载体和表皮生长因子的核苷酸序列，包括天然序列和合成序列。包括等位基因变体和物种同系物，还包括突变体和变异体。本领域技术人员能够理解，可以对EGF和肽载体的编码序列例如本文公开的序列进行适当修饰，例如增加、替换、缺失一个或多个(如不超过60个，优选不超过45个，更优选不超过30个，10个，5个，4个、3个、2个、1个)核苷酸，而仍然保留其编码能力。因此，本发明包括这些修饰的变异体在内。例如，本发明的编码序列包括具有与SEQ ID NO1或者3或者5有至少70％的同一性(identity)并编码EGF或肽载体的核苷酸序列的变异体。优选地，所示核苷酸序列与SEQ ID NO1或3或5具有至少80％的同一性，更优选至少90％的同一性，至少95％甚至98％、99％的同一性。在一个实施方案中，本发明的EGF编码序列具有SEQ ID NO1的序列。在另一个实施方案中，本发明的肽载体编码序列具有SEQ ID NO3或5的序列。
优选地，所述核酸分子包含根据宿主细胞偏爱的密码子设计的编码EGF的核苷酸序列或其互补序列。更优选地，所述核酸分子包含根据原核生物例如大肠杆菌偏爱的密码子设计的编码EGF的核苷酸序列或其互补序列，或者根据植物例如番茄偏爱的密码子设计的编码EGF的核苷酸序列或其互补序列。
本发明的核酸分子可以是DNA或者RNA，例如合成DNA，包括DNA类似物。
在一个具体实施方案中，本发明核酸分子选自具有SEQ ID NO7所示序列的编码所述融合蛋白的核酸分子，在SEQ ID NO7中增加、替换、缺失一个或多个(如不超过60个，优选不超过45个，更优选不超过30个，10个，5个，4个、3个、2个、1个)核苷酸而仍然保留其编码能力的核酸分子，与SEQ ID NO7有至少70％的同一性(identity)而仍然保留其编码能力的变异体，和它们的互补序列。优选地，所述核酸分子与SEQ ID NO1或3或5具有至少80％的同一性，更优选至少90％的同一性，至少95％甚至98％、99％的同一性。
在另一方面，本发明还涉及含有上述的核酸分子的载体。该载体可以是克隆载体，也可以是表达载体，或者穿梭载体。
优选地，本发明的载体含有适于所述融合蛋白目的宿主细胞中表达的、与所述核酸分子可操作地连接的调控元件。
在另一方面，本发明还涉及含有上述载体的宿主细胞，例如真核宿主细胞如动物细胞(优选哺乳动物例如人细胞)或者昆虫细胞或者真菌细胞，或者原核宿主细胞如大肠杆菌细胞。本发明还涉及含有该细胞的生物体。
在另一方面，本发明还涉及组合物，其含有本发明的融合蛋白或者核酸分子或者载体或者其一个或多个的任何组合。任选地，所述组合物还含有赋形剂、稀释剂、或者辅助物质。优选地，所述组合物是药物组合物(用于预防或者治疗EGF相关疾病)，保健品组合物，或者化妆品组合物。
在另一方面，本发明还涉及肽载体序列(优选蛋白质转导域(PTD))在制备本发明融合蛋白或者核酸分子中的用途。
在另一方面，本发明还涉及本发明的融合蛋白或者核酸分子或者载体在制备药物、保健品或者化妆品中的用途。
在另一方面，本发明还涉及本发明的融合蛋白或者核酸分子或者载体在EGF的任何用途中的用途。本发明的融合蛋白或者核酸分子或者载体可以用来在EGF的任何用途中适当地替代EGF。
本发明还涉及核酸分子，其具有根据宿主细胞偏爱的密码子设计的编码EGF的核苷酸序列或其互补序列。在一个优选实施方案中，所述核酸分子具有根据植物例如番茄偏爱的密码子设计的编码EGF的核苷酸序列，或其互补序列，例如SEQ ID NO1所示的序列，或者根据原核生物例如大肠杆菌偏爱的密码子设计的编码EGF的核苷酸序列。
本发明还提供了核酸分子，其核苷酸序列与SEQ ID NO1或3或5或7具有至少80％的同一性，更优选至少90％的同一性，最优选至少95％甚至98％、99％的同一性。优选地，所述核酸分子具有SEQ IDNO1或3或5或7的序列。
本发明另一方面还提供了多肽，其氨基酸序列与SEQ ID NO2或者4或者6或者8具有至少80％的同一性，更优选至少90％的同一性，最优选至少95％甚至98％、99％的同一性。优选地，所述多肽具有SEQ ID NO2或者4或者6或者8的氨基酸序列。
附图简述

图1表达载体pPTD-hEGF结构示意图。
T7PT7启动子PTD蛋白质转导域EGF表皮生长因子Term终止子图2SDS-PAGE分析PTD-hEGF表达M为低分子量蛋白标准，Control对照质粒表达，PTD-hEGF重组质粒融合表达。
图3SDS-PAGE确定表达蛋白的存在形式M蛋白分子质量标准，1菌体裂解液的上清液，2-5菌体裂解液的沉淀分别以2，4，6和8M尿素处理后上清，6裂解液沉淀的清洗液，7裂解液沉淀物。
图4SDS-PAGE分析纯化的PTD-hEGF融合蛋白M为蛋白分子质量标准，1为以150mM咪唑洗脱液纯化的融合蛋白。
图5重组质粒pGEX-hEGF的酶切鉴定MDNA分子质量标准；1.重组质粒。
图6SDS-PAGE分析GST融合蛋白的表达M蛋白分子质量标准(97.4，66，42，31，14.4)kD；1.pGEX-hEGF全菌裂解液；2.对照菌pGEX-4T-1全菌裂解液。
图7表达产物的Western blot分析1.BL21/pGEX-4T-1裂解液；2.BL21/pGEX-hEGF裂解液上清；3.BL21/pGEX-hEGF裂解液沉淀。
图8GST-hEGF表达形式的确定及在不同浓度尿素中的溶解度1.菌体裂解液沉淀；2.菌体裂解液上清液；3-6.菌体裂解液的沉淀分别以2，4，6和8M尿素处理后上清；M.蛋白分子质量标准(97.4，66，42，31，14.4)kD。
图9SDS-PAGE分析纯化的GST-hEGF融合蛋白M蛋白分子质量标准(97.4，66，42，31，14.4)kD；1.纯化的GST-hEGF蛋白图10MTS法测定标准hEGF和重组PTD-hEGF的生物活性图11MTS法测定标准hEGF和重组GST-hEGF的生物活性具体实施方式
本发明在一个具体方面涉及一种依赖植物偏爱的密码子设计的编码人重组表皮生长因子(EGF)的核酸分子；该分子的核苷酸序列结构与人EGF核苷酸的结构不完全相同，但所编码的蛋白质序列却是完全相同的。
本发明还涉及肽载体核苷酸序列的应用。可将肽载体核苷酸序列置于人表皮生长因子核酸序列的5’端，构成一融合表达的基因结构序列。
本发明还涉及含有所述核酸分子的表达载体pPTD-hEGF和pGEX-hEGF；在大肠杆菌BL21中表达出了含有肽载体序列的人表皮生长因子，融合蛋白的表达不仅限于BL21，还应扩展到一切有利于融合蛋白表达的其他一切生物反应器，如原核的枯草杆菌、短肽杆菌以及其他的原核生物；真核生物如酵母菌(酿酒酵母、毕赤酵母及汉森酵母等)，动植物细胞等。
本发明还涉及重组人EGF融合蛋白的应用。肽载体人EGF融合蛋白有广泛的应用，在疾病预防和治疗方面用作药物，如预防和治疗口腔及消化道溃疡、医治皮肤物理性、化学性及炎性损伤、喷雾或吸入防治呼吸道损伤等；在保健方面可活化糖酵解作用以增加呼吸代谢，增强体力，提高免疫功能及抗衰老等；在化妆品应用上可深入皮肤深层，改善皮肤细胞的营养，使衰老的皮肤及时脱落，祛除色斑，持久保持皮肤红润、光滑、细腻有弹性，同时能够去除绉纹，达到护肤养颜的目的，并且可以增强皮肤抵御能力，防止外来刺激，修复受损皮肤，加速伤口愈合。
肽载体人EGF融合蛋白可以多种剂型进行应用，如含片、贴片、喷剂、滴剂及液体注射剂等。总之，除上述剂型外，EGF融合蛋白还可以各种方便的其他制剂形式应用于临床、保健和化妆品行业。
本发明的融合蛋白可以以类似于EGF蛋白的剂量施用。由于本发明融合蛋白的生物活性高于EGF，因此，优选地，本发明融合蛋白的施用剂量低于常规EGF的施用剂量。例如，本发明融合蛋白的施用剂量不超过常规EGF的施用剂量的80％，优选不超过70％、60％、或50％，更优选不超过常规EGF的施用剂量的40％、30％、20％、甚至10％。
本发明应用的肽载体为人类免疫缺陷病毒编码的反式激活蛋白TAT的PTD序列或GST序列。EGF的引导将不仅限于上述的PTD序列，还应扩展到一切具备此功能的肽载体序列，其中包括人工合成的肽载体结构。
在一个具体实施方案中，本发明涉及一种依据植物偏爱的密码子设计的编码人表皮生长因子的核酸分子。发明人人工合成了该核酸的全部核苷酸序列，该序列与天然的人表皮生长因子核苷酸序列并不完全相同，但所编码的蛋白质序列却完全相同。上述编码人表皮生长因子的核酸的核苷酸序列和对应的人表皮生长因子氨基酸序列如下atg aat agc gat tct gaa tgt cca ctt tcc cac gac gga tac tgcM N S D S E C P L S H D G Y Cttg cat gat ggt gtt tgc atg tac att gag gct ttg gac aag tatL H D G V C M Y I E A L D K Ygca tgc aac tgt gtt gtg ggt tac atc gga gag aga tgt caa tacA C N C V V G Y I G E R C Q Ycgt gac ctt aaa tgg tgg gaa ctt cgt taa tag (SEQ ID NO1)R D L K W W E L R * * (SEQID NO2)本发明的另一个方面涉及PTD的运用。优先涉及HIV-ITAT蛋白PTD和GST。HIV-ITAT蛋白PTD的核心序列由11个氨基酸组成，其序列为YGRKKRRQRRR。我们利用大肠杆菌偏爱的密码子设计出这一氨基酸序列的核苷酸序列并进行人工全合成。HIV-ITAT蛋白PTD的一个示例性编码核苷酸序列和对应的氨基酸序列如下5’tac ggc cgc aag aaa cgc cgc cag cgc cgc cgc3’(SEQ ID NO3)Y G R K K R R Q R R R (SEQ ID NO4)一个示例性的编码GST的核苷酸序列和对应的氨基酸序列如下1atg tcc cct ata cta ggt tat tgg aaa att aag ggc ctt gtg caa451Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln15
46 ccc act cga ctt ctt ttg gaa tat ctt gaa gaa aaa tat gaa gag 9016 Pro Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu 3091 cat ttg tat gag cgc gat gaa ggt gat aaa tgg cga aac aaa aag 13531 His Leu Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys 45136 ttt gaa ttg ggt ttg gag ttt ccc aat ctt cct tat tat att gat 8046 Phe Glu Leu Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp 60181 ggt gat gtt aaa tta aca cag tct atg gcc atc ata cgt tat ata 22561 Gly Asp Val Lys Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile 75226 gct gac aag cac aac atg ttg ggt ggt tgt cca aaa gag cgt gca 27076 Ala Asp Lys His Asn Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala 90271 gag att tea atg ctt gaa gga gcg gtt ttg gat att aga tac ggt 31591 Glu Ile Ser Met Leu Glu Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly 105316 gtt tcg aga att gca tat agt aaa gac ttt gaa act ctc aaa gtt 360106 Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val 120361 gat ttt ctt agc aag cta cct gaa atg ctg aaa atg ttc gaa gat 405121 Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu Met Leu Lys Met Phe Glu Asp 135406 cgt tta tgt cat aaa aca tat tta aat ggt gat cat gta acc cat 450136 Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn Gly Asp His Val Thr His 150451 cct gac ttc atg ttg tat gac gct ctt gat gtt gtt tta tac atg 495151 Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp Val Val Leu Tyr Met 165496 gac cca atg tgc ctg gat gcg ttc cca aaa tta gtt tgt ttt aaa 540166 Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu Val Cys Phe Lys 180541 aaa cgt att gaa gct atc cca caa att gat aag tac ttg aaa tcc 585181 Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr Leu Lys Ser 195586 agc aag tat ata gca tgg cct ttg cag ggc tgg caa gcc acg ttt 630196 Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala Thr Phe 210
将PTD的核苷酸序列置于人EGF基因的5’端，构建了能在大肠杆菌BL21中高效表达的表达载体pPTD-hEGF和pGEX-hEGF。pPTD-hEGF载体是由pET系列构建而来，含有T7启动子启动融合基因的表达，在融合蛋白的5’端含有6个组氨酸标签，以及有利于亲和层析纯化的一些附加结构。
一个示例性融合蛋白的全长氨基酸和核苷酸序列如下CAT CAT CAT CAT CAT CATGGT ATG GCT AGC ATG ACT GGT GGA CAGHis His His His His HisGly Met Ala Ser Met Thr Gly Gly GlnCAA ATG GGT CGG GAT CTG TAC GAC GAT GAC GAT AAG GAT CGA TGGGln Met Gly Arg Asp Leu Tyr Asp Asp Asp Asp Lys Asp Arg TrpGGA TCC AAG CTT GGC TAC GGC CGC AAG AAA CGC CGC CAG CGC CGCGly Ser Lys Leu Gly Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg ArgCGC GGT GGA TCC ACC ATG TCC GGC TAT CCA TAT GAC GTC CCA GACArg Gly Gly Ser Thr Met Ser Gly Tyr Pro Tyr Asp Val Pro AspTAT GCT GGC TCC ATG GCC GGT ACC ATG AAT AGC GAT TCT GAA TGTTyr Ala Gly Ser Met Ala Gly Thr Met Asn Ser Asp Ser Glu CysCCA CTT TCC CAC GAC GGA TAC TGC TTG CAT GAT GGT GTT TGC ATGPro Leu Ser His Asp Gly Tyr Gys Leu His Asp Gly Val Cys MetTAC ATT GAG GCT TTG GAC AAG TAT GCA TGC AAC TGT GTT GTG GGTTyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys Asn Cys Val Val GlyTAC ATC GGA GAG AGA TGT CAA TAC CGT GAC CTT AAA TGG TGG GAATyr Ile Gly Glu Arg Cys Gln Tyr Arg Asp Leu Lys Trp Trp GluCTT CGT TAA TGA (SEQ ID NO7)Leu Arg End End (SEQ ID NO8)划线处为6个His序列，黑体为PTD序列，斜体为依据番茄偏好的密码子设计的EGF编码序列和所表达的氨基酸序列。其余部分为间隔序列或修饰序列。
pGEX-hEGF来源于pGEX-4T-1载体(购自北京天为时代公司)，在融合蛋白的5’端含有GST蛋白序列。
该载体通过化学转化法导入到大肠杆菌BL21中，于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中培养至一定浓度，加入IPTG诱导可得到高表达量的融合蛋白PTD-hEGF和GST-hEGF。
利用本发明的重组菌株BL21/pPTD-hEGF和BL21/pGEX-hEGF生产重组人表皮生长因子的方法具体如下1.种子液制备将10ul菌种接种于盛有3ml LB培养液的试管中，37℃培养过夜(一般为16小时左右)，当OD600达到0.6左右时即可进行发酵，上述所用种子液培养基加入100mg/L氨苄青霉素。
2.发酵在无菌条件下将上述培养好的种子液按30ml/L的接种量接种于发酵培养基上；发酵培养基的成分组成为(g/L)Trypt one(蛋白胨)10g，Yeast extract(酵母提取物)5g，NaCl 5g，氨苄青霉素0.1g；用去离子水溶解定容，高压灭菌。发酵条件为温度28-37℃，pH7.0，发酵至OD600达到1.0左右时加入IPTG(异丙硫代-β-D-半乳糖苷)100mM进行诱导，3-4个小时后离心收集菌体，收取的菌体可放于-20℃冰箱中，待分离纯化。
3.重组人表皮生长因子的分离纯化(1)PTD-hEGF的纯化将上述收集的菌体细胞用磷酸缓冲液PBS(pH7.6)洗涤1-2次；每100ml细菌培养液用50ul细菌裂解液(pH7.6)悬浮，加入溶菌酶1mg/ml，RNase 20ug/ml，超声破碎，10000rpm离心10分钟，弃上清液，用8M的尿素溶解沉淀得粗提液；经SDS-PAGE电泳检测表明，用本法得到的融合蛋白绝大部分为包函体，可得到表达量达40％以上的融合蛋白。大部分溶解于8M的尿素中。本法粗提rhEGF简单易行，规模可随意扩大，可变因素少，重复性很好。
表达的融合蛋白可通过Ni2+柱一步纯化，最后用含有150mM的咪唑洗脱液洗脱。
(2)GST-hEGF的纯化每mL细菌裂解上清加100μl Glutathione Sepharose 4B，室温30min，500g离心5min，弃上清，用PBS洗3次，沉淀中加入1倍体积的谷胱甘肽缓冲液，室温轻轻搅动10min，离心后收集上清。Lowrry法测定收集液中蛋白的含量。
4.促细胞生长活性鉴定在96孔板培养的人胚肾HEK-293细胞中加入纯化的PTD-hEGF和GST-hEGF，分为0.1，0.2，0.4，0.8，1.6，3.2ng/ml不同的浓度，48小时后加入MTS继续培养1-4小时，于酶联仪上492nm处测定光密度值。与标准EGF相比有很好的生物活性。
5.应用可作为化妆品的原料添加到普通化妆品中；防治口腔及消化道溃疡；促进各种皮肤创伤的愈合；防治呼吸道损伤等多种用途。
实施例实施例1表达载体pPTD-hEGF的构建与鉴定将合成的EGF基因(SEQ ID NO1)连接于pBS-T载体(购于北京天为时代公司)上，用Kpn I+EcoR I从T载体上切下目的基因，回收纯化；同时用Kpn I+EcoR I双酶切表达载体pPTD(将合成的PTD的核苷酸序列(SEQ ID NO3)连接到载体pRSET(购于Invitrogen，San Diego，CA)上构建成的)，回收纯化载体片段；将回收的目的基因片段与目的载体片段取适当比例，在T4DNA连接酶的作用下，16℃连接过夜，取适当连接液转化感受态细胞TOP10(购于北京天为时代公司)，从筛选培养基上长出的克隆菌斑中挑选几个进行培养鉴定。
提取重组菌落的质粒，在Kpn I+EcoR I双酶切作用下，电泳图谱中出现了预期的目的片段，即目的基因片段和载体片段，将这些重组质粒测序证明构建的表达载体是正确的。表达载体pPTD-hEGF结构示意图见图1。
实施例2PTD-hEGF融合蛋白的表达提取上述构建正确的表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)，挑取多个克隆进行诱导表达，图2是其中一个典型克隆的表达情况，从图中可以看出，该质粒进行了有效的表达。经生物软件分析，表达量占细菌总蛋白的40％。
实施例3重组蛋白表达形式的确定经诱导表达的菌体离心收集后，用PBS缓冲液清洗，再将清洗后的菌体溶解于适当的裂解液中，超声波破碎菌体，离心分离上清液与沉淀，SDS-PAGE分析结果表明，上清液中目标蛋白含量很少，大部分都以不溶形式的包涵体存在。分别取等量的裂解物沉淀溶于2，4，6，8M尿素中，电泳分析可知，该包涵体在8M尿素中溶解度最大(图3)。
实施例4PTD-hEGF融合蛋白的纯化以PTD-hEGF融合基因进行的表达，可溶性的蛋白很少，绝大多数是以不溶性的包函体形式存在，因此我们将表达产物溶解在8M的尿素中，然后进行Ni2+-NTA亲和层析。分别以10-150mM的咪唑洗脱液洗脱，在较低浓度的咪唑洗脱液中杂质较多，目的蛋白的含量很少，浓度升高到150mM时出现了较明显的目的蛋白条带。用含咪唑150mM的洗脱液洗脱结合了融合蛋白的介质，回收洗脱液(图4)。Ni2+-NTA亲和层析纯化得到的融合蛋白纯度达99.5％以上实施例5pGEX-hEGF表达载体的构建和鉴定合成hEGF基因(SEQ NO1)，在其5’端添加了限制性内切酶BamH I酶切位点和ATG启始密码子；在其3’端添加了终止密码子TAA和TGA，紧接着与NOS终止子序列和EcoR I酶切位点相连。BamH I和EcoR I双酶切hEGF和pGEX-4T-1(购自天为时代公司，该载体在多克隆位点上游包含GST编码区，用于表达N端融合了GST的融合蛋白)，回收目的基因片段和载体片段，取适当比例混合，在T4DNA连接酶的作用下16℃连接，转化感受态细胞TOP10，提取阳性克隆质粒后以BamH I和EcoR I双酶切鉴定，结果切出了500bp的目的基因片段和4900bp的载体片段(图5)。将重组载体送交博亚生物公司测序，结果证明所构建的表达载体基因的核苷酸序列完全正确。
实施例6pGEX-hEGF表达载体在大肠杆菌BL21中的表达重组质粒pGEX-hEGF转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)，在Ampr琼脂平板上挑选单菌落接种于3ml LB/amp培养液中，33℃培养到OD600＝0.5左右时，加入IPTG至终浓度0.5mmol/L，继续培养2h，收集菌体，PBS洗涤2次，按每mL细菌培养液加50μl细胞裂解液重悬菌体，超声裂解，离心后收集上清和菌体碎片。SDS-PAGE检测，于33kD处出现了一条明显的蛋白条带，而对照菌(含空质粒pEGX-4T-1)在27kD处出现了一条蛋白条带。合成的人表皮生长因子含有54个氨基酸，分子量大小为6kD，GST大小为27kD，因此33kD处的蛋白应是GST-hEGF的融合蛋白。证明GST-hEGF融合蛋白在大肠杆菌中得到了表达，经生物软件分析表达量占总蛋白含量的34％。SDS-PAGE分析融合蛋白的表达情况见图6。
菌株经IPTG诱导表达后，分别对其裂解液的上清和沉淀进行SDS-PAGE分析，然后转至尼龙膜上，以兔抗hEGF为一抗，羊抗兔抗体为二抗进行Western印迹检测，结果见图7所示。该菌的裂解液上清和沉淀泳道都显示出了特异的条带，其位置与考马斯亮蓝染色的蛋白表达条带位置一致，而对照菌的泳道却未显示任何条带，说明表达产物为GST-hEGF的融合蛋白。
实施例7GST-hEGF表达形式的确定为确定hEGF在E.coli中的表达形式，将离心收集的菌体用PBS充分洗涤后，超声波破碎(或液氮冷冻破碎)离心分离上清与沉淀。沉淀分别用含有2M，4M，6M，8M尿素的PBS缓冲液溶解，离心后取10μl与等体积的上样缓冲液混匀，95℃变性5min，SDS-PAGE电泳可以看出，沉淀和上清液中均含有融合蛋白，说明表达的蛋白既有可溶性的形式，也有不溶性的包涵体，包涵体中含有的量更多一些。尿素溶解证明在8M的尿素中GST-hEGF溶解度最大(图8)。
实施例8GST-hEGF融合蛋白的纯化每mL细菌裂解上清加100μl Glutathione Sepharose 4B，室温30min，500g离心5min，弃上清，用PBS洗3次，沉淀中加入1倍体积的谷胱甘肽缓冲液，室温轻轻搅动10min，离心后收集上清。对纯化后的蛋白上清经Lowry法测蛋白浓度。每100ml菌液最终可获得6.3mg的GST-hEGF融合蛋白。SDS-PAGE电泳观察仅留下大小为33kD的一条带(图9)。
实施例9促细胞增殖活性分析将标准rhEGF和纯化后的融合蛋白(根据hEGF在融合蛋白中所占的比例换算成hEGF的实际含量)，经过滤除菌，用含0.5％FBS的RPMI 1640稀释至0.1，0.2，0.4，0.8，1.6，3.2，6.4ng/ml。取无菌96孔板一块，以1号孔为空白，2号孔为对照，加入含0.5％FBS的RPMI 1640培养基50ul。从3号开始向右依次加入上述对半稀释的培养液各50ul，每一样品设3个平行组。选对数生长期细胞一瓶，胰酶消化，细胞收集后用含0.5％FBS的培养基调整细胞数到所需浓度(每孔加5000个左右细胞)，每孔加入细胞悬液50ul。37℃，5％CO2培养箱培养48小时。每空加入20ul MTS溶液，37℃，5％CO2培养箱继续培养1-4小时，用酶联免疫检测仪测OD值，λ＝492nm。
(1)重组PTD-hEGF融合蛋白的促细胞增殖活性以人胚肾293细胞做实验，标准品rhEGF和PTD-hEGF都显示了对培养细胞有明显的生物活性，在0.1-0.4ng/ml范围内随浓度的升高而增强，但PTD-hEGF又表现出与标准不同的性质，达到最大活性值用量更小(图10)。
原核表达的融合蛋白PTD-hEGF主要形成了包涵体，包涵体是变性蛋白质的聚集体，没有生物活性，而培养细胞中添加后表现出了明显的促细胞生长活性，这一现象说明包涵体进行了活性恢复。虽然本发明不限于具体的理论，但是，其机制应该是PTD-hEGF进入了细胞内部，在细胞内发生了重新折叠，由无活性的形式变为有生理活性的形式。在细胞培养中hEGF的浓度在0.1-0.4ng/ml时，其促细胞生长作用有明显的量效关系，但PTD-hEGF的促细胞生长活性又明显比标准hEGF的活性高，其原因可能是hEGF在PTD的牵引下进入了细胞核内，由于PTD序列中带有核定位信号肽(GRKKR)，其跨膜转运后主要积聚于细胞，尤其是胞核内，Schwarze等(Schwarze SR，Ho A.Vocero-AkbamA，Dowdy SF.Science，1999；285(5433)1569-1572)证明PTD转导的外源性蛋白质具有细胞核聚集的特点。hEGF在核内聚集，直接调控了DNA，RNA和蛋白质的合成。
(2)重组GST-hEGF融合蛋白的促细胞增殖活性用MTS法对GST-hEGF融合蛋白的生物活性进行了检测。表明GST-hEGF样品与标准品rhEGF具有相似ED50(Effective dose 50使细胞生长量达到最大植一半时EGF的浓度)值。且重组GST-hEGF样品比标准品hEGF具有更高的生物活性(图11)。
GST-hEGF融合蛋白能明显促进HEK-293细胞的分裂和生长。在0.1-0.8ng/mL浓度范围内融合蛋白的活性高于标准rhEGF，这一奇特现象提示hEGF的作用机理除和其细胞膜上的受体结合引起一系列反应外，还可能被GST带入细胞内部起作用(Namiki S，Tomida T，Tanabe M，IinoM，Hirose K.Biochemical and Biophysical Research Communications，2003，305592 597.)，或者到达细胞核内与染色体相连，直接促使DNA、RNA和蛋白质的合成。
GST-hEGF融合蛋白所显示的生物活性提示hEGF的利用可以不需要去除融合蛋白的GST部分，这样给表达和纯化带来了极大的方便，可降低生产成本，使hEGF得到更加广泛的利用。
序列表<110>中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所<120>含有肽载体和表皮生长因子的融合蛋白和核酸及其用途<130>IDC040097<160>8<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>168<212>DNA<213>人工<220>
<223>依据植物偏爱的密码子设计的编码人表皮生长因子的核酸分子<220>
<221>CDS<222>(1)..(168)<400>1atg aat agc gat tct gaa tgt cca ctt tcc cac gac gga tac tgc ttg48Met Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu1 5 10 15cat gat ggt gtt tgc atg tac att gag gct ttg gac aag tat gca tgc96His Asp Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys20 25 30aac tgt gtt gtg ggt tac atc gga gag aga tgt caa tac cgt gac ctt144Asn Cys Val Val Gly Tyr Ile Gly Glu Arg Cys Gln Tyr Arg Asp Leu35 40 45aaa tgg tgg gaa ctt cgt taa tag168Lys Trp Trp Glu Leu Arg50<210>2<211>54
<212>PRT<213>人工<220>
<223>合成结构<400>2Met Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu1 5 10 15His Asp Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys20 25 30Asn Cys Val Val Gly Tyr Ile Gly Glu Arg Cys Gln Tyr Arg Asp Leu35 40 45Lys Trp Trp Glu Leu Arg50<210>3<211>33<212>DNA<213>人工<220>
<223>人工合成的HIV-I TAT蛋白PTD编码核苷酸序列<220>
<221>CDS<222>(1)..(33)<400>3tac ggc cgc aag aaa cgc cgc cag cgc cgc cgc 33Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg1 5 10<210>4<211>11<212>PRT
<213>人工<220>
<223>合成结构<400>4Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg1 5 10<210>5<211>678<212>DNA<213>人工<220>
<223>编码GST的核苷酸序列<220>
<221>CDS<222>(1)..(678)<400>5atg tcc cct ata cta ggt tat tgg aaa att aag ggc ctt gtg caa ccc48Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro1 5 10 15act cga ctt ctt ttg gaa tat ctt gaa gaa aaa tat gaa gag cat ttg96Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu20 25 30tat gag cgc gat gaa ggt gat aaa tgg cga aac aaa aag ttt gaa ttg144Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu35 40 45ggt ttg gag ttt ccc aat ctt cct tat tat att gat ggt gat gtt aaa192Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys50 55 60tta aca cag tct atg gcc atc ata cgt tat ata gct gac aag cac aac240Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn65 70 75 80atg ttg ggt ggt tgt cca aaa gag cgt gca gag att tca atg ctt gaa288
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<223>一个示例性融合蛋白的核苷酸序列<220>
<221>CDS<222>(1)..(372)<400>7cat cat cat cat cat cat ggt atg gct agc atg act ggt gga cag caa48His His His His His His Gly Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln1 5 10 15atg ggt cgg gat ctg tac gac gat gac gat aag gat cga tgg gga tcc96Met Gly Arg Asp Leu Tyr Asp Asp Asp Asp Lys Asp Arg Trp Gly Ser20 25 30aag ctt ggc tac ggc cgc aag aaa cgc cgc cag cgc cgc cgc ggt gga144Lys Leu Gly Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Gly35 40 45tcc acc atg tcc ggc tat cca tat gac gtc cca gac tat gct ggc tcc192Ser Thr Met Ser Gly Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Gly Ser
50 55 60atg gcc ggt acc atg aat agc gat tct gaa tgt cca ctt tcc cac gac240Met Ala Gly Thr Met Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp65 70 75 80gga tac tgc ttg cat gat ggt gtt tgc atg tac att gag gct ttg gac288Gly Tyr Cys Leu His Asp Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp85 90 95aag tat gca tgc aac tgt gtt gtg ggt tac atc gga gag aga tgt caa336Lys Tyr Ala Cys Asn Cys Val Val Gly Tyr Ile Gly Glu Arg Cys Gln100 105 110tac cgt gac ctt aaa tgg tgg gaa ctt cgt taa tga372Tyr Arg Asp Leu Lys Trp Trp Glu Leu Arg115 120<210>8<211>122<212>PRT<213>人工<220>
<223>合成结构<400>8His His His His His His Gly Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln1 5 10 15Met Gly Arg Asp Leu Tyr Asp Asp Asp Asp Lys Asp Arg Trp Gly Ser20 25 30Lys Leu Gly Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Gly35 40 45Ser Thr Met Ser Gly Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Gly Ser50 55 60Met Ala Gly Thr Met Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp
65 70 75 80Gly Tyr Cys Leu His Asp Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp85 90 95Lys Tyr Ala Cys Asn Cys Val Val Gly Tyr Ile Gly Glu Arg Cys Gln100 105 110Tyr Arg Asp Leu Lys Trp Trp Glu Leu Arg115 120
权利要求
1.包含肽载体序列(优选蛋白质转导域(PTD)或谷胱甘肽-S-转移酶(GST))和表皮生长因子(EGF)的融合蛋白；优选地，其中肽载体序列位于EGF的N-端，优选紧邻EGF，也可以通过间隔序列和EGF相连；优选地，其中肽载体序列选自果蝇的同源异型转录蛋白Antp、单纯疱疹病毒的结构蛋白VP22或者人类I型免疫缺陷病毒的转录激活蛋白(TAT)的PTD或谷胱甘肽-S-转移酶(GST)；优选人类I型免疫缺陷病毒的转录激活蛋白(TAT)的PTD，特别地，具有SEQ ID NO4所示的序列、优选地，其中EGF是人EGF，优选重组人EGF；优选地，其中所述融合蛋白还含有有利于纯化的附加序列，例如在N端或C端含有6个组氨酸的标签；优选地，所述融合蛋白具有SEQ ID NO8所示的序列。
2.核酸分子，其具有选自以下核苷酸序列的序列(1)编码权利要求1-6任一项的融合蛋白的核苷酸序列；(2)与(1)的核苷酸序列互补的核苷酸序列；优选地，所述核酸分子包含根据植物例如番茄偏爱的密码子设计的编码EGF的核苷酸序列或其互补序列(如SEQ ID NO1所示序列)，或者根据原核生物例如大肠杆菌偏爱的密码子设计的编码EGF的核苷酸序列或其互补序列。特别地，所述核酸分子是DNA，例如具有SEQ ID NO7所示的序列。
3.含有权利要求2的核酸分子的载体；优选地，其含有适于所述融合蛋白在目的宿主细胞中表达的、与所述核酸分子可操作地连接的调控元件。
4.含有权利要求9或者10的载体的宿主细胞，例如真核宿主细胞如动物细胞、植物细胞、昆虫细胞或者真菌细胞，或者原核宿主细胞如大肠杆菌细胞。
5.组合物，其含有权利要求1-6任一项的融合蛋白或者权利要求7或8的核酸分子或者权利要求9或10的载体或者其一个或多个的任何组合；任选地，所述组合物还含有赋形剂、稀释剂、或者辅助物质；优选地，所述组合物是药物组合物(用于预防或者治疗EGF相关疾病)，保健品组合物，或者化妆品组合物。
6.肽载体序列(优选蛋白质转导域(PTD))在制备权利要求1-6任一项的融合蛋白或者权利要求7或8的核酸分子中的用途。
7.权利要求1-6任一项的融合蛋白或者权利要求7或8的核酸分子或者权利要求9或10的载体在制备药物、保健品或者化妆品中的用途。
8.核酸分子，其具有根据植物例如番茄偏爱的密码子设计的编码EGF的核苷酸序列，或其互补序列，例如SEQ ID NO1所示的序列，或者根据原核生物例如大肠杆菌偏爱的密码子设计的编码EGF的核苷酸序列。
9.核酸分子，其具有如下核苷酸序列所述核苷酸序列与SEQ IDNO1或3或5或7具有至少80％的同一性，更优选至少90％的同一性，最优选至少95％甚至98％、99％的同一性；优选地，所述核酸分子具有SEQ ID NOI或3或5或7的序列。
10.多肽，其具有如下氨基酸序列所述氨基酸序列与SEQ IDNO2或者4或者6或者8具有至少80％的同一性，更优选至少90％的同一性，最优选至少95％甚至98％、99％的同一性；优选地，所述多肽具有SEQ ID NO2或者4或者6或者8的氨基酸序列。
全文摘要
本发明涉及人表皮生长因子的修饰。本发明公开了包含肽载体序列(优选蛋白质转导域(PTD))和表皮生长因子(EGF)的融合蛋白、其编码核酸、含有它们的组合物和它们的用途。本发明的化合物和组合物可以用作药物、保健品和化妆品的活性成分或添加剂。
文档编号C12N15/63GK1765929SQ200410090159
公开日2006年5月3日 申请日期2004年10月29日 优先权日2004年10月29日
发明者智庆文, 李前, 王玉霞, 李仕贵, 孙曼霁 申请人:中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所