专利名称：海水养殖真鲷的hepcidin抗菌肽基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种从海水养殖真鲷(Pagrus major)中克隆的hepcidin抗菌肽基因。
背景技术：
海水养殖真鲷，英文名Red Seabream，拉丁名Pagrus major，属于辐鳍亚纲，鲈形目，鲷科，真鲷属，俗称红鳞加吉鱼；近年来在我国广东、福建等沿海省份对真鲷的人工养殖面积增大，已成为主要的海水养殖经济鱼类，是出口日本、韩国及东南亚国家主要的名贵食用经济鱼类之一。近20年来，随着真鲷养殖业发展迅猛，高密度集约化养殖带来了多种负因子影响，其病害种类、发病频率及其危害性亦逐年增加，特别是细菌性疾病不断发生，给整个真鲷养殖业造成了巨大的经济损失。尤其是海水养殖业大量应用抗生素，造成水产品中含有过量违禁的抗生素药物，使产品质量下降，养殖环境恶化，出口受阻，已严重影响到水产业的健康发展。
抗菌肽(Antibacterial Peptides，ABP)是一类具有很强的广谱抗细菌活性的天然小肽类物质，被认为是鱼、虾、贝类等动物非特异性免疫防御系统的主要成分之一，当鱼体受到损伤或病原微生物侵袭时，能迅速产生抗菌肽以预防和杀伤病原微生物的入侵，其合成速度快、在体内扩散迅速、灵活的特点是其他大分子蛋白质(如抗体等)和免疫细胞所不具备的，在防御海水性细菌和病毒入侵方面起着重要作用。Hepcidin抗菌肽是近年来发现的另一类具有独特性质的抗菌肽，2000年Krause A等(Krause A，et al.，FEBS Lett.，2000，480(2-3)147-150)从人的血液滤液分离到LEAP-1(liver-expressed antimicrobial peptide，肝脏表达的抗菌肽)、2001年Park等从人尿液中分离出一个富含半胱氨酸的肽，因为它来源于肝且有抗菌特性，所以首先命名为hepcidin(Park CH，et al.，Biol，Chem.，2001，276(11)7806-7810)，继之从鼠(Mus musculus)分离到同家族的2个hepcidin前体肽(PigeonC，et al.，J.Biol.Chem，2767811-7819；IlyinG，et al.，FEBS Lett.，2003，54222-26)。Shiker等于2002年首次报道从杂交斑纹鲈鱼(Morone chrysops×M.saxatilis)分离到一个hepcidin成熟肽(Shike H，et al.，Eur.J.Biochem.，2002，2692232-2237)，初步研究发现hepcidin抗菌肽与其它报道的抗菌肽一样，具有抗菌作用。研究证明，不同种属来源的hepcidin抗菌肽基因家族在成熟肽同一位点上含有典型特征的八个半胱氨酸残基的保守序列，有抗各种真菌和革兰氏阳性、阴性菌的活性。在鱼类，除已报道从杂交斑纹鲈鱼、斑马鱼(zebrafish)、美洲拟鲽(winter flounder)、鲑鱼(salmon)等分离出hepcidin基因片断外(Shike H，et al.，Dvelopment and Comparatvive Immunology.，2004，28747-745；Douglas SE，et al.，Dvelopment and Comparatvive Immunology.，2001，25137-147；Douglas SE，et al.，Dvelopment and Comparatvive Immunology.，2003，27587-601)，还报道从其他鱼类如日本比目鱼(Paralichthys olivaceus)、大西洋鲑(Salmo salar)和虾虎鱼(Gillichthys mirabilis)等的基因文库中通过表达序列标签(EST)分析发现具有hepcidin基因序列。
抗菌肽基本的抗菌机理是抗菌肽分子破坏细菌的细胞膜结构，引起胞内水溶性物质大量渗出，导致细菌停止生长或死亡。其抗菌机理不同于传统抗生素，由于分子量小，极易扩散到感染部位，使用后不存在产生耐药性问题，且进入机体后无有害残留。因此，抗菌肽在海水养殖鱼类的疾病防治上将是一种应用前景广阔的抗菌药物；但通过鱼类直接提取或利用化学方法人工合成天然的抗菌肽，受动物来源和化学合成方法的局限，很难获得足够量的抗菌肽，且费用昂贵，因而分离克隆抗菌肽基因，利用基因工程方法体外大量生产抗菌肽，是获得高产量的抗菌肽并保证其在水产养殖业大面积推广应用的前提。
发明内容
本发明的目的旨在提供一种从海水养殖真鲷(Pagrus major)中克隆的hepcidin抗菌肽基因。该基因可与毕赤酵母等构建真核表达载体建立高效表达hepcidin的基因工程菌株，体外大量生产真鲷hepcidin抗菌肽，作为饲料免疫添加剂可替代传统饲料中的某些抗生素；还可以作为替代某些耐药性抗生素的有效抗菌药物。
本发明所说的海水养殖真鲷hepcidin抗菌肽基因cDNA共有586nt(不包括poly(A))，其中含有5’端非编码区长94nt(5’UTR)，1个阅读框长264nt，3’非编码翻译区长243nt(3’UTR)。其GenBank系列号为AY557619。其序列如下序列表一海水养殖真鲷(Pagrus major)的hepcidin抗菌肽全长cDNA序列10 20 30 40 50 60aaccatcaga caggagaaga agtgaaagga gctgacgaga gtcaccaaaa gaatcaaagg70 80 90100110120actgaacaag ttaaagcagt caaagcctcc taagatgaag acattcagtg ttgcagttgc130140150160170180agtggccgtc gtgctcacct ttatttgcct tcaggagagc tctgctgcct cagttactga190200210220230240ggtgcaagag ctggaggagc caatgagcaa tggcagtcca gttgctgcac atgaagagat250260270280290300gccagaggag tcctggaaga tgccgtataa caacagacac aagcgcagcc ctgctggctg310320330340350360
tcgcttttgc tgcggttgct gtcctaacat gattggatgt ggtgtctgct gcaggttc 370 380390400410 420 tgattcctg ctgcagcctg ggatttacac aacaaccact aaatatatct ttgtcaagat430440450460470480ttttacttta aaagcagttt tacgtctttc agttgtggct gttaatatct gaggatgttt490500510520530540ttgaatttgg taatgctgca gagaatgtgt gctcactgat gtgactgtat catctacaca550560570580590600cactactaca gtgtattgtc acaataaact ttaggtttac tcatgcaaaa aaaaaaaaaa601a序列表二海水养殖真鲷的hepcidin抗菌肽cDNA预测编码蛋白氨基酸序列10 20 30 40 50 60MKTFSVAVAV AVVLTFICLQ ESSAASVTEV QELEEPMSNG SPVAAHEEMP EESWKMPYNN7080 88RHKRSPAGCR FCCGCCPNMI GCGVCCRF*序列表三 海水养殖真鲷的hepcidin抗菌cDNA读码框及预测蛋白氨基酸序列1A ACC ATC AGA CAG GAG AAG AAG TGA AAG GAG CTG ACG AGA GTC ACC AAA AGA ATC AAA 5859 GGA CTG AAC AAG TTA AAG CAG TCA AAG CCT CCT AAGATGAAG ACA TTC AGT GTT GCA GTT 1181Met Lys Thr Phe Ser Val Ala Val 8119 GCA GTG GCC GTC GTG CTC ACC TTT ATT TGC CTT CAG GAG AGC TCT GCT GCC TCA GTT ACT1789 Ala Val Ala Val Val Leu Thr Phe Ile Cys Leu Gln Glu Ser Ser Ala Ala Ser Val Thr 28179 GAG GTG CAA GAG CTG GAG GAG CCA ATG AGC AAT GGC AGT CCA GTT GCT GCA CAT GAA GAG23829 Glu Val Gln Glu Leu Glu Glu Pro Met Ser Asn Gly Ser Pro Val Ala Ala His Glu Glu 48239 ATG CCA GAG GAG TCC TGG AAG ATG CCG TAT AAC AAC AGA CAC AAG CGC AGC CCT GCT GGC29849 Met Pro Glu Glu Ser Trp Lys Met Pro Tyr Asn Asn Arg His Lys Arg Ser Pro Ala Gly 68299 TGT CGC TTT TGC TGC GGT TGC TGT CCT AAC ATG ATT GGA TGT GGT GTC TGC TGC AGG TTC35869 Cys Arg Phe Cys Cys Gly Cys Cys Pro Asn Met Ile Gly Cys Gly Val Cys Cys Arg Phe 88359 TGA TTC CTG CTG CAG CCT GGG ATT TAC ACA ACA ACC ACT AAA TAT ATC TTT GTC AAG 41889 *** ---89419 ATT TTT ACT TTA AAA GCA GTT TTA CGT CTT TCA GTT GTG GCT GTT AAT ATC TGA GGA TGT478479 TTT TGA ATT TGG TAA TGC TGC AGA GAA TGT GTG CTC ACT GAT GTG ACT GTA TCA TCT ACA538
539 CAC ACT ACT ACA GTG TAT TGT CACAAT AAACTT TAG GTT TAC TCA TGC AAA AAA AAA AAA598599 AAA海水养殖真鲷hepcidin cDNA基因克隆过程如下1)参考杂交斑纹鲈鱼hepcidin的基因序列(Shike H，et al.，Eur.J.Biochem.，2002，2692232-2237)，通过优化选择设计合成特异引物S1(上游引物起始密码子ATG前段序列24个bp(含ATG)+2个修饰碱基CG)CGA AGC AGT CAA ACC CTC CTA AGA TG，Al(下游引物终止密码子TGA前段序列25个bp)GAA CCT GCA GCA GAC ACC ACA TCC G，以细菌感染后海水养殖真鲷肝脏总RNA为模板进行RT-PCR扩增，得到约300bp特异扩增cDNA条带，经测序得到287bp的基因片段hepc；在NCBI网站(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)通过Blast分析证实得到的287bp基因hepc具有包括起始密码子在内的编码区，与杂交斑纹鲈鱼的抗菌肽hepcidin有较高的同源性(＞85％)，并且该基因推导的氨基酸序列C末端也富含hepcidin基因家族特有的八个半胱氨酸的保守序列。
2)根据获得的hepc片段设计合成特异引物A2(密码子ATG下游105bp-82bp)作为下游引物TGG CTC CTC CAG CTC TTG CAC CTC，利用5′-CDS引物(Clontech.)5′-(T25)N-1N-3′，N＝A、C、G或T；N-1＝A、G或C和SMART II A oligo(SMARTTMRACE cDNA AmplificationKit，Clontech.)(5′)AAG CAG TGG TAT CAA CGC AGA GTA CGC GGG做为上游引物，以细菌感染后真鲷肝脏总RNA为模板，进行5`race；从真鲷肝组织中扩增出一条约200bp cDNA条带，测序得到一条包含5’UTR和一部分编码区在内的202bp的hepc5`端cDNA片段。
3)利用特异性上游引物S1和Oligo dT-3sites Adaptor Primer(3’-Full RACE CoreSet，TaKaRa Bio)，以细菌感染后真鲷肝脏总RNA为模板，进行3`race及PCR扩增出约500bp大小的cDNA条带，测序得到肝hepcidin序列为530bp 3`端cDNA片段，包含起始密码子在内的完整的hepcidin编码区及3’UTR。将5’race和3’race的测序结果经过序列拼接和碱基校对，最终得到601bp的真鲷全长hepcidin cDNA。
本发明以攻毒真鲷肝脏总RNA为模板，参考杂交斑纹鲈鱼hepcidin的基因序列，通过优化选择设计的特异性引物，利用RT-PCR、5`race和3`race等分子生物学技术手段，成功地克隆到海水养殖真鲷hapcidin cDNA全长序列，该基因属于hepcidin基因家族的新组员。该基因其前体序列与Shike H等发表的杂交斑纹鲈鱼的hepcidin基因序列同源性高于85％，且推导的氨基酸序列在C末端成熟肽同一位置上都富含八个半胱氨酸的保守序列，两者预测的氨基酸序列信号肽切点、结构域切点都一致，分别在“SSA”、“RHKR”序列处。但从推导的氨基酸序列(如下Hepc为海水养殖真鲷，Bass为杂交斑纹鲈鱼)
HepcMKTFSVAVAVAVVLTFICLQESSAASVTEVQELEEPMSNGSPVAAHEEMPEESWKMPYNN 60BassMKTFSVAVAVAVVLAFICLQESSAVPVTEVQELEEPMSNEYQEMPVE-----SWKMPYNN 55Hepc61 RHKRSPAG--CRFCCGCCPNMIGCGVCCRF 88Bass56 RHKRHSSPGGCRFCCNCCPNMSGCGVCCRF 85与国外报道的杂交斑纹鲈鱼氨基酸序列比较发现，本发明克隆的真鲷前体蛋白序列含有88个氨基酸，杂交斑纹鲈鱼85个氨基酸，两者氨基酸差异主要表现在成熟肽序列，共有8个氨基酸差异；与其它种类的抗菌肽相比，Hepc序列区别于以前发现的所有其他种类抗菌肽，具有独特的结构，该抗菌肽不仅具有抗真菌和革兰氏阳性、阴性菌的活性，而且还是一种与铁代谢密切相关的重要的铁调节激素，可与毕赤酵母等构建真核表达载体建立高效表达hepcidin的基因工程菌株，体外大量生产真鲷hepcidin抗菌肽，作为饲料免疫添加剂可替代传统饲料中的某些抗生素，用于海水养殖业，实现绿色养殖，减少乃至消除抗生素在水产品中的蓄积，提高水产品质量；也可以作为某些耐药性抗生素的有效替代品，用于水产养殖业中耐药性细菌的防治药物。另外，该基因还可以用于转基因鱼的育种研究。
图1为提取攻毒真鲷的肝总RNA电泳图。
图2为RT-PCR电泳图。
图3为5`race电泳图。
图4为3`race电泳图。
具体实施例方式
实施例1.攻毒真鲷肝RNA的提取真鲷肝组织总RNA的提取取50mg的真鲷肝组织分别放入研钵，加液氮研磨成粉，转至1.5mL无核酸酶(DEPC处理)的eppendorf管中，加入1mLTrizol，充分混匀，室温静置5min；4℃12000g离心10min，弃去不溶团块；加入0.2mL氯仿，震荡混匀，室温静止2min；4℃12000g离心15min，取上层水相于新的eppendorf管中；加入0.5mL异丙醇，混匀后室温静置10min；4℃12000g离心10min，弃上清；加入1mL 75％乙醇洗涤沉淀，4℃7500g离心10min；弃清液，室温干燥10min；用无核酸酶水(DEPC处理水)溶解沉淀即得总RNA提取液。测OD260nm/OD280nm和OD260nm/OD230nm，于1％琼脂糖凝胶电泳上分析(见图1)。
2.RT-PCR扩增目的片段hepc2.1 cDNA第一链合成RT-PCR参考杂交斑纹鲈鱼hepcidin的基因序列(Shike H，et al.，Eur.J.Biochem.，2002，2692232-2237)，通过优化选择设计合成特异引物S1(上游引物起始密码子ATG前段序列24个bp(含ATG)+2个修饰碱基CG)CGA AGC AGT CAA ACC CTC CTA AGA TG，A1(下游引物终止密码子TGA前段序列25个bp)GAA CCT GCA GCA GAC ACC ACA TCC G，取总RNA 1～3μg，加入下游引物A1 10pmol，加DEPC水至10μL，70℃孵育5min，立即置于冰上5min；加入下列试剂5×AMV buffer5.0μL，_，10mM each dNTPs 1μL，RNasin(40U/μL)0.5μL，AMV反转录酶(10U/μL)3.0μL，加DEPC处理水至总反应体积为25μL；42℃孵育60min反转录；95℃孵育5min，灭活AMV反转录酶，置于冰上。
2.2 PCR反应取2.1反应的1μL RT-PCR反应液作为模板，分别加入10×Mg2+free buffer2.5μL、MgCl2(25mM)2.0μL、10mM each dNTPs 0.25μL、上下游引物(S1、A1)各10pmol、Taq DNA聚合酶0.7U，用无核酸酶水补齐至总体积25μL。94℃预变性2min；94℃变性30sec，60℃复性30sec，72℃延伸60sec，30个循环；72℃继续延伸5min结束反应。得到约300bp特异扩增cDNA条带(见图2)，经测序得到287bp的基因片段hepc；在NCBI网站(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)通过Blast分析证实得到的287bp基因hepc可连续编码，与杂交斑纹鲈鱼的抗菌肽hepcidin同源性高于85％，并且该基因推导的氨基酸序列C末端也富含hepcidin基因家族特有的八个半胱氨酸的保守序列；为获得该基因全长cDNA序列，进行3’、5’race。
3.5′RACE3.1反转录反应根据获得的hepc片段设计合成特异引物A2(密码子ATG下游105bp-82bp)作为下游引物TGG CTC CTC CAG CTC TTG CAC CTC，利用5’-CDS引物((Clontech.))5′-(T25)N-1N-3′，N＝A、C、G或T；N-1＝A、G或C和SMART II A oligo(SMART RACE cDNA AmplificationKit，Clontech.)(5′)AAG CAG TGG TAT CAA CGC AGA GTA CGC GGG做为上游引物，取总RNA～1μg，1.0μL5′-CDS引物和1.0μL SMART II A oligo，加DEPC处理水至终体积25μL，70℃孵育2min，立即置于冰上；再依次加入下列试剂5×First-StrandBuffer2.0μL、DTT(20mM)1.0μL、dNTP(10mM)1.0μL、PowerScript ReverseTranscriptasel.0μL至总体积10μL。42℃孵育1.5hr进行反转录反应，再加入Tricine-EDTA Buffer 20μL稀释第一链反应产物，72℃孵育7min灭活酶，5℃，5min，冰上放置。
3.2 PCR反应利用UPM(Clontech.)(5′)CTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG CAA CGC AGA GT和A2进PCR。取3.1反应产物2.5μL第一链反应产物作为模板，加入10×Advantage PCR 5.0μL、dNTP(10mM)1.0μL、50×Advantage Polymerase mix 1.0μL、UMP(2.0μM)1.0μL、A2 10pmol，用无核酸酶水补齐至50μL。94℃预变性3min；94℃变性30sec，72℃2min，5个循环；94℃30s，70℃30s，72℃2min，5个循环；94℃30s，68℃30s，72℃2min，25个循环；72℃继续延伸5min。扩增得到大约200bp cDNA条带(见图3)，测序得202bp的hepc5`端cDNA片段。
4.3′-RACE4.1反转录反应取总RNA 1～3μg，加入0.2mL的离心管中，70℃温育10min，立即置于冰上。在上管中加入10×RNA PCR Buffer2.0μL、MgCl2(25mM)4.0μL、dNTPs(10mM)2.0μL、RNasin(40U/μL)0.5μL、Oligo dT-3sites Adaptor Primer(2.5μM)1.5μL、AMV反转录酶(10U/μL)1.0μL，用无核酸酶的水补齐至总体积为20μL。30℃退火10min；42℃延伸50min；95℃，5min灭活酶；5℃，5min，冰上放置。
4.2 PCR反应取上步反应产物1μL第一链反应液作为模板，分别加入10×Mg2+free buffer2.5μL、MgCl2(25mmol/L)2μL，10mM each dNTPs 0.25μL，3sites Adaptor Primer 5pmol、S1(CGA AGC AGT CAA ACC CTC CTA AGA TG)5pmol，Taq DNA聚合酶(1.0U/μL)0.7U，用无核酸酶的水补齐至25μL。94℃预变性2min；94℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸1min，30个循环；72℃继续延伸5min。扩增得到500bp左右的cDNA条带(见图4)；测序得到肝hepcidin序列为530bp 3`端cDNA片段。
5.序列分析与基因确定扩增获得的cDNA产物由上海博亚生物技术有限公司进行DNA核苷酸序列测定。序列同源性比对和相似性搜索用NCBI(http//www.ncbi.nlm.nih.gov)BLAST在线软件进行；多序列比较用DNAssist2.0软件；以BLAST2软件辅助进行序列拼接；信号肽预测用SIGNALP在线查找(http//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)。
权利要求
1.海水养殖真鲷的hepcidin抗菌肽基因，其特征在于所说的海水养殖真鲷hepcidin抗菌肽基因cDNA共有586nt(不包括poly(A))，其中含有5’端非编码区长94nt(5’UTR)，1个阅读框长264nt，3’非编码翻译区长243nt(3’UTR)，其GenBank系列号为AY557619，全长cDNA序列如下10 20 30 40 50 60aaccatcaga caggagaaga agtgaaagga gctgacgaga gtcaccaaaa gaatcaaagg70 80 90100110120actgaacaag ttaaagcagt caaagcctcc taagatgaag acattcagtg ttgcagttgc130140150 160170180agtggccgtc gtgctcacct ttatttgcct tcaggagagc tctgctgcct cagttactga190200210220230240ggtgcaagag ctggaggagc caatgagcaa tggcagtcca gttgctgcac atgaagagat250260270280290300gccagaggag tcctggaaga tgccgtataa caacagacac aagcgcagcc ctgctggctg310320330340350360tcgcttttgc tgcggttgct gtcctaacat gattggatgt ggtgtctgct 370380390400410 420 ctgcagcctg ggatttacac aacaaccact aaatatatct ttgtcaagat430 440450460470480ttttacttta aaagcagttt tacgtctttc agttgtggct gttaatatct gaggatgttt490500510520530540ttgaatttgg taatgctgca gagaatgtgt gctcactgat gtgactgtat catctacaca550560570580590600cactactaca gtgtattgtc acaataaact ttaggtttac tcatgcaaaa aaaaaaaaaa601a
2.如权利要求1所述的海水养殖真鲷的hepcidin抗菌肽基因，其特征在于所说的海水养殖真鲷的hepcidin抗菌肽cDNA预测编码蛋白氨基酸序列如下10 20 30 40 50 60MKTFSVAVAV AVVLTFICLQ ESSAASVTEV QELEEPMSNG SPVAAHEEMP EESWKMPYNN70 80 88RHKRSPAGCR FCCGCCPNMI GCGVCCRF*
3.如权利要求1所述的海水养殖真鲷的hepcidin抗菌肽基因，其特征在于所说的海水养殖真鲷的hepcidin抗菌cDNA读码框及预测蛋白氨基酸序列如下1 A ACC ATC AGA CAG GAG AAG AAG TGA AAG GAG CTG ACG AGA GTC ACC AAA AGA ATC AAA 5859 GGA CTG AAC AAG TTA AAG CAG TCA AAG CCT CCT AAGATGAAG ACA TTC AGT GTT GCA GTT 1181 Met Lys Thr Phe Ser Val Ala Val 8119 GCA GTG GCC GTC GTG CTC ACC TTT ATT TGC CTT CAG GAG AGC TCT GCT GCC TCA GTT ACT1789 Ala Val Ala Val Val Leu Thr Phe Ile Cys Leu Gln Glu Ser Ser Ala Ala Ser Val Thr 28179 GAG GTG CAA GAG CTG GAG GAG CCA ATG AGC AAT GGC AGT CCA GTT GCT GCA CAT GAA GAG23829 Glu Val Gln Glu Leu Glu Glu Pro Met Ser Asn Gly Ser Pro Val Ala Ala His Glu Glu 48239 ATG CCA GAG GAG TCC TGG AAG ATG CCG TAT AAC AAC AGA CAC AAG CGC AGC CCT GCT GGC29849 Met Pro Glu Glu Ser Trp Lys Met Pro Tyr Asn Asn Arg His Lys Arg Ser Pro Ala Gly 68299 TGT CGC TTT TGC TGC GGT TGC TGT CCT AAC ATG ATT GGA TGT GGT GTC TGC TGC AGG TTC35869 Cys Arg Phe Cys Cys Gly Cys Cys Pro Asn Met Ile Gly Cys Gly Val Cys Cys Arg Phe 88359 TGA TTC CTG CTG CAG CCT GGG ATT TAC ACA ACA ACC ACT AAA TAT ATC TTT GTC AAG41889 *** 89419 ATT TTT ACT TTA AAA GCA GTT TTA CGT CTT TCA GTT GTG GCT GTT AAT ATC TGA GGA TGT478479 TTT TGA ATT TGG TAA TGC TGC AGA GAA TGT GTG CTC ACT GAT GTG ACT GTA TCA TCT ACA538539 CAC ACT ACT ACA GTG TAT TGT CACAAT AAACTT TAG GTT TAC TCA TGC AAA AAA AAA AAA 598599 AAA
4.如权利要求1所述的海水养殖真鲷的hepcidin抗菌肽基因，其特征在于所说的特异上游引物S1为起始密码子ATG前段序列24个bp(含ATG)+2个修饰碱基CG。
5.如权利要求1所述的海水养殖真鲷的hepcidin抗菌肽基因，其特征在于所说的特异下游引物A1为终止密码子TGA前段序列25个bp。
6.如权利要求1所述的海水养殖真鲷的hepcidin抗菌肽基因，其特征在于所说的特异引物A2为密码子ATG下游105bp-82bp。
7.海水养殖真鲷的hepcidin抗菌肽基因的克隆方法，其特征在于其步骤为1)通过优化选择设计合成特异引物S1(上游引物)CGA AGC AGT CAA ACC CTC CTA AGATG，A1(下游引物)GAA CCT GCA GCA GAC ACC ACA TCC G，以细菌感染后海水养殖真鲷肝脏总RNA为模板进行RT-PCR扩增，得到287bp的特异扩增cDNA条带hepc；2)根据获得的hepc片段设计合成特异引物A2作为下游引物TGG CTC CTC CAG CTC TTGCAC CTC，利用5′-CDS引物(Clontech.)5′-(T25)N-1N-3′，N＝A、C、G或T；N-1＝A、G或C和SMART II A oligo(SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit，Clontech.)(5′)AAG CAGTGG TAT CAA CGC AGA GTA CGC GGG做为上游引物，以细菌感染后真鲷肝脏总RNA为模板，进行5`race；从真鲷肝组织中扩增出一条包含5’UTR和一部分编码区在内的202bp的hepc5`端cDNA片段；3)利用特异性上游引物S1和Oligo dT-3sites Adaptor Primer(3’-Full RACE CoreSet，TaKaRa Bio)，以细菌感染后真鲷肝脏总RNA为模板，进行3`race及PCR扩增出530bp 3`端cDNA片段，包含起始密码子在内的完整的hepcidin编码区及3’UTR，将5’race和3’race的测序结果经过序列拼接和碱基校对，最终得到601bp的真鲷全长hepcidin cDNA。
全文摘要
海水养殖真鲷的hepcidin抗菌肽基因，涉及一种从海水养殖真鲷中克隆的hepcidin抗菌肽基因。以攻毒真鲷肝脏总RNA为模板，参考杂交斑纹鲈鱼hepcidin的基因序列，设计合成特异引物，利用RT－PCR、5`race和3`race等手段，属hepcidin基因家族新组员。具有抗真菌和革兰氏阳性、阴性菌的活性，是一种与铁代谢密切相关的铁调节激素，可与毕赤酵母等构建真核表达载体建立高效表达hepcidin的基因工程菌株，体外大量生产真鲷hepcidin抗菌肽，作为饲料免疫添加剂，减少乃至消除抗生素在水产品中的蓄积，提高水产品质量；作为某些耐药性抗生素的有效替代品，用于水产养殖业中耐药性细菌的防治药物及转基因鱼的育种研究。
文档编号C12N15/12GK1624127SQ20041009029
公开日2005年6月8日 申请日期2004年11月3日 优先权日2004年11月3日
发明者王克坚, 杨明, 周红玲 申请人:厦门大学