专利名称：一种检测小麦多酚氧化酶活性性状的方法及其专用引物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种检测小麦多酚氧化酶活性性状的方法及其专用引物。
背景技术：
小麦多酚氧化酶(Polyphenol oxidase，简称PPO)是引起面条、馒头、饺子和面团等小麦制品在贮存期间颜色褐变的主要因素，其决定面条等制品颜色稳定性的70％。通过遗传育种途径降低小麦PPO活性，培育PPO活性低的小麦品种是小麦品质改良的重要目标。
研究人员已作过许多关于小麦PPO活性的遗传研究，例如，葛秀秀等应用植物数量性状主基因加多基因混合遗传模型对冬小麦PPO活性进行了遗传分析，分析结果表明PPO活性受2对独立的主基因控制。Jimenz和Anderson等通过对代换系PPO活性的测定，也推测控制小麦PPO的主效基因为1-2个，同时指出针对PPO的底物专化性存在多个等位基因。但是目前还未发现PPO基因在小麦染色体上的位置。
Demeke等研究了三个重组近交系群体的QTL标记，发现三个群体均出现超亲分离，PPO主效基因位于第二部分同源群染色体上与RFLP标记Xfba314连锁。Udall和Demekes等利用RFLP标记分析研究了四个重组近交系群体，Mares等利用AFLP标记分析了一个DH群体，上述两项研究结果均证明PPO活性的主效基因位于第二同源群染色体上。但是，RFLP标记和AFLP标记不是基于PCR(PCR-based)的分子标记技术，难以在小麦育种上应用。
此外，Demeke和Morris根据苹果、马铃薯等作物PPO基因序列的保守区设计引物扩增出大小为2070bp的小麦PPO的DNA序列。Jukanti等和Anderson等也发表了一段PPO基因序列。但迄今为止还未开发出可应用于小麦育种的PPO活性分子标记。
发明内容
本发明的目的是提供一种可用于检测小麦多酚氧化酶活性性状的引物。
本发明所提供的用于检测小麦多酚氧化酶活性性状的引物，名称为Xgwm312，是由序列表中序列1的核苷酸序列和序列2的核苷酸序列组成的一对引物。
序列表中的序列1由20个碱基组成，序列表中的序列2由21个碱基组成。
本发明的第二个目的是提供一种检测小麦多酚氧化酶活性性状的方法。
本发明所提供的检测小麦多酚氧化酶活性性状的方法，是以待测小麦基因组DNA为模板，以序列表中序列1的核苷酸序列和序列2的核苷酸序列为引物，进行PCR扩增，检测扩增产物中是否有198bp大小的条带。
如扩增产物中有198bp大小的条带，表明待测小麦中的多酚氧化酶活性高。
其中，以20μl总体积为例，PCR扩增的反应体系包括1×PCR缓冲液(50mmol·L-1KCl，10mmol·L-1Tris·Cl，0.01％明胶)、MgCl21.5mM、dNTP(A.T.C.G)各250μM、TaqDNA聚合酶1U、每条引物4pmol、模板DNA 80ng。反应条件可为首先94℃变性5min；然后94℃变性1min，55℃退火55sec，72℃延伸1min，共36个循环；最后72℃延伸10min。
可通过6％的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增产物中是否有198bp大小的条带。
本发明应用分子数量遗传学方法和小麦微卫星(microsatellite或SSR)技术将小麦多酚氧化酶基因PPO定位在小麦染色体2A长臂(2AL)上，并提供了该基因的SSR分子标记Xgwm312，该标记与PPO基因紧密连锁(1.6cM)，利用该标记可以对小麦多酚氧化酶基因PPO进行分子标记辅助选择，从而培育出多酚氧化酶活性低的优良小麦品种；此外，还可利用该分子标记检测小麦中多酚氧化酶的活性，检测方法简单易行、稳定可靠。本发明的方法及其专用引物将在小麦多酚氧化酶活性性状的检测和小麦育种中发挥重要作用。
图1为SSR标记与多酚氧化酶基因PPO的连锁2为引物Xgwm312对15个小麦品种的PCR扩增产物电泳图具体实施方式
实施例1.小麦多酚氧化酶基因PPO的SSR分子标记Xgwm312的获得用中国农科院作物所培育的PPO活性高的小麦品种‘中优9507’与PPO活性较低的小麦品种“CA9632”杂交，F1代种于试验田中，抽穗时取花药离体培养，并进行单倍体加倍，得到DH群体，然后进行PPO活性分析。
田间试验分别在中国农科院作物所(北京)、中国农科院棉花所(安阳)和山东农科院作物所(济南)3个地点进行，每个地点重复2次，小区为3行区，行长2米，每行播种80粒。收获后测试每个DH系的PPO活性。
用126对SSR引物(wmc336a，Xgwm136，gdm33c，wmc329，wmc84b，Xgwm357，wmc469，wmc312b，Xgwm448c，Xgwm99，wmc367，Xgwm26，gdm33b，wmc336b，wmc522，wmc177，Xgwm356，wmc191，Xgwm372，Xgwm425，Xgwm448b，Xgwm382，Xgwm312，Xgwm294，Xgwm410，Xgwm374，wmc154，wmc257b，Xgwm261，Xgwm296，Xgwm157，Xgwm539，Xgwm349，wmc419，wmc256a，wmc200a，wmc132c，wmc36a，wmc41，wmc410，wmc532，Xgwm66，Xgwm493，wmc326，wmc308c，Xgwm114c，Xgwm264a，Xgwm285，wmc291，Xgwm376，Xgwm247，Xgwm389，gdm72，wmc533，Xgwm3，wmc170b，Xgwm645，Xgwm383，wmc236，wmc132e，wmc297，wmc308a，wmc238，Xgwm495，wmc349，Xgwm6，Xgwm251，Xgwm149，wmc449，wmc459，wmc285，wmc473，gdm125，wmc308b，wmc457，gdm133a，Xgwm194，Xgwm293，wmc257a，Xgwm186，wmc327b，Xgwm126，gdm133c，wmc537，Xgwm67，wmc118，gdm132b，Xgwm190，gdm68，Xgwm182，Xgwm272，Xgwm114a，wmc215，wmc132a，gdm33a，wmc201，Xgwm570，wmc256b，wmc32，wmc84a，wmc312a，Xgwm169，Xgwm518，Xgwm114g，Xgwm193，gdm132a，Xgwm325，wmc479，wmc17，Xgwm276，Xgwm282，wmc36b，Xgwm264b，Xgwm569，Xgwm297，wmc402b，wmc396，wmc76，Xgwm400，Xgwm577，wmc323，wmc132b，Xgwm111，wmc346，wmc38，wmc438)、4对贮藏蛋白的STS引物(Glu-A3，Glu-B3，Gli-B1，Glu-D1)和26对AFLP引物组合(P41-M32e，P33-M38c，P42-M45c，P42-M45a，P32-M35e，P41-M32a，P42-M45h，P42-M45j，P32-M35b，P33-M38a，P31-M31a，P38-M46d，P42-M45g，P38-M46b，P38-M46a，P42-M45d，P42-M45e，P31-M31c，P42-M45f，P41-M32c，P35-M41d，P42-M45i，P35-M41a，P31-M31e，P35-M41b，P31-M31b)对该DH群体进行遗传分析，应用MAPMAKER3.0软件构建连锁图，并用Cartographer软件包的复合区间作图法(CIM)分别进行3个地点(北京、安阳和济南)PPO活性的QTL分析。
结果如图1所示，表明在小麦染色体2A长臂(2AL)上有一主效PPO活性基因，并与微卫星标记Xgwm312紧密连锁(1.6cM)。
实施例2.小麦多酚氧化酶(PPO)活性的测定实验用小麦品种1.苏引10号(购自江苏农科院作物所)，2.农大152(购自中国农业大学)，3.豫麦21(购自河南省漯河市农业科学研究所)，4.中梁88375(购自甘肃天水市农科所)，5.扬麦5号(购自江苏里下河地区农科所)，6.豫麦56(购自河南农科院小麦所)，7.冬丰9801(购自中国农科院作物所)，8.晋麦50(购自山西省农科院棉花研究所)，9.藁城8901(购自河北省藁城农业科学研究所)，10.高优503(购自中国科学院石家庄农业现代化研究所)，11.冀麦38(购自河北省石家庄市农科院)，12.98中18(购自中国农科院作物所)，13.临汾138(购自山西省农科院小麦研究所)，14.云麦46(购自云南省农科院作物所)，15.山东928802(购自山东省农科院作物所)。
将上述15个冬小麦品种种植于中国农科院棉花研究所(安阳)、中国农科院作物所(北京)和山东农科院作物所(济南)，田间管理按常规方法进行，收获籽粒并按下述方法测定其PPO活性，具体步骤为
a)称取15粒种子放入约20ml玻璃瓶内，加入4.5ml反应试剂，放在混旋器上混合，使样品充分湿润。
反应试剂为50mM pH6.5的MOPS(3-[N-morpholino]propanesulfonic acid)缓冲液，10mM L-DOPA(L-3，4-dihydroxyphenyl alanine)。
b)把样品瓶放在往复振荡机上振荡0.5小时(样品充分暴露在空气中)。再放在混旋器上迅速混合，使样品颜色一致。马上将样品放在冰块上终止反应。
c)以空白L-DOPA/MOPS溶液为比色对照，用分光光度计取1.0cm比色皿，在475nm下测定上清液的吸光度A。计算结果PPO活性(A475nm/min·g-1×103)＝A/(30min×15粒种子克数)×103式中A为475nm下上清液的吸光度。
实验结果表明1.苏引10号籽粒PPO活性10.29 A475/g min-1×103，2.农大152籽粒PPO活性9.07 A475/g min-1×103，3.豫麦21籽粒PPO活性9.34 A475/g min-1×103，4.中梁88375籽粒PPO活性11.83 A475/g min-1×103，5.扬麦5号籽粒PPO活性2.08 A475/g min-1×103，6.豫麦56籽粒PPO活性3.09 A475/g min-1×103，7.冬丰9801籽粒PPO活性2.96A475/g min-1×103，8.晋麦50籽粒PPO活性2.50 A475/gmin-1×103，9.藁城8901籽粒PPO活性3.29 A475/g min-1×103，10.高优503籽粒PPO活性4.60 A475/g min-1×103，11.冀麦38籽粒PPO活性2.88 A475/g min-1×103，12.98中18籽粒PPO活性3.27 A475/g min-1×103，13.临汾138籽粒PPO活性9.62 A475/gmin-1×103，14.云麦46籽粒PPO活性8.61A475/g min-1×103，15.山东928802籽粒PPO活性11.83 A475/g min-1×103。结果表明苏引10号(籽粒PPO活性10.29 A475/gmin-1×103)，农大152(籽粒PPO活性9.07 A475/g min-1×103)，豫麦21(籽粒PPO活性9.34 A475/g min-1×103)，中梁88375(籽粒PPO活性11.83 A475/g min-1×103)，临汾138(籽粒PPO活性9.62 A475/g min-1×103)，云麦46(籽粒PPO活性8.61A475/g min-1×103)和山东928802(籽粒PPO活性11.83 A475/g min-1×103)的PPO活性明显高于其它小麦品种。
实施例3.Xgwm312分子标记用于检测小麦多酚氧化酶活性性状的有效性验证实验用小麦品种与实施例2相同。
将上述15个冬小麦品种分别种植于中国农科院棉花研究所(安阳)、中国农科院作物所(北京)和山东农科院作物所(济南)，田间管理按常规进行，收获籽粒后提取各个小麦品种的基因组DNA，然后以其为模板，以序列表中序列1的核苷酸序列和序列2的核苷酸序列为引物，进行PCR扩增。
其中，PCR扩增的反应体系为20μl总体积中包含1×PCR缓冲液(50mmol·L-1KCl，10mmol·L-1Tris·Cl，0.01％明胶)、MgCl21.5mM、dNTP(A.T.C.G)各250μM、TaqDNA聚合酶1U、每条引物4pmol、模板DNA 80ng。反应条件为首先94℃变性5min；然后94℃变性1min，55℃退火55sec，72℃延伸1min，共36个循环；最后72℃延伸10min。
可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增产物中是否有198bp大小的条带。所述电泳检测的方法为电泳缓冲液为pH8.0的1×TBE；制胶用6％聚丙烯酰胺胶储存液(尿素420.2g，丙稀酰胺60.0g，N’N-甲叉双丙烯酰胺3.16g，10×TBE 50ml，定容至1000ml)60ml，10％过硫酸铵(APS)300μl，TEMED 60μl，混合均匀后灌胶，胶型为380mm/300mm/0.4mm；电泳程序为首先100W预电泳30min，插60孔加样梳，点样后80W电泳60min。电泳结束后进行银染程序(1)脱色与固定将胶板放入10％冰醋酸中轻摇30min；(2)漂洗用蒸馏水漂洗3次，每次3min；(3)银染1L 1％的AgNO3溶液中加2ml 37％的甲醛，放入胶板轻摇30min；(4)蒸馏水漂洗约20sec；(5)显影在预冷的1L 30％的Na2CO3溶液中加2ml甲醛和200μl 1％ NaS2O3溶液，放入胶板轻摇直到目标片段显示出来；(6)终止迅速将胶板转入10％冰醋酸溶液中，终止显色反应；(7)用蒸馏水飘洗2min；(8)将胶板自然干燥后，记录带型并用数码相机照相。结果如图2所示(泳道M为pBR332DNA/BsuRI(HaeIII)Marker，泳道1-15分别为以上述15种小麦的基因组DNA为模板的PCR扩增产物)，出现了四种电泳带型，分别称为带型1、2、3和4，其片段大小分别约为198bp、216bp、232bp和240bp。其中，以苏引10号(籽粒PPO活性10.29 A475/g min-1×103)，农大152(籽粒PPO活性9.07 A475/g min-1×103)，豫麦21(籽粒PPO活性9.34 A475/g min-1×103)，中梁88375(籽粒PPO活性11.83 A475/g min-1×103)，临汾138(籽粒PPO活性9.62A475/g min-1×103)，云麦46(籽粒PPO活性8.61 A475/g min-1×103)和山东928802(籽粒PPO活性11.83 A475/g min-1×103)的基因组DNA为模板的PCR扩增产物均为带型1(198bp)，实施例2的实验结果表明这四种小麦的PPO活性明显高于其它小麦品种，从而证明Xgwm312的198bp扩增片段的有无与小麦品种PPO活性大小密切相关，该片段出现表明该小麦品种的PPO活性高。图2中，1为苏引10号(籽粒PPO活性10.29 A475/g min-1×103)，2为农大152(籽粒PPO活性9.07 A475/g min-1×103)，3为豫麦21(籽粒PPO活性9.34 A475/g min-1×103)，4为中梁88375(籽粒PPO活性11.83 A475/g min-1×103)，5为扬麦5号(籽粒PPO活性2.08 A475/g min-1×103)，6为豫麦56(籽粒PPO活性3.09 A475/g min-1×103)，7为冬丰9801(籽粒PPO活性2.96A475/g min-1×103)，8为晋麦50(籽粒PPO活性2.50A475/g min-1×103)，9为藁城8901(籽粒PPO活性3.29 A475/g min-1×103)，10为高优503(籽粒PPO活性4.60 A475/g min-1×103)，11为冀麦38(籽粒PPO活性2.88 A475/g min-1×103)，12为98中18(籽粒PPO活性3.27 A475/g min-1×103)，13为临汾138(籽粒PPO活性9.62 A475/g min-1×103)，14为云麦46(籽粒PPO活性8.61 A475/gmin-1×103)，15为山东928802(籽粒PPO活性11.83 A475/g min-1×103)。
序列表<160>2<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<230>
<400>1atcgcatgat gcacgtagag 20<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<230>
<400>2acatgcatgc ctacctaatg g2权利要求
1.用于检测小麦多酚氧化酶活性性状的引物，是由序列表中序列1的核苷酸序列和序列2的核苷酸序列组成的一对引物。
2.一种检测小麦多酚氧化酶活性性状的方法，是以待测小麦基因组DNA为模板，以序列表中序列1的核苷酸序列和序列2的核苷酸序列为引物，进行PCR扩增，检测扩增产物中是否有198bp大小的条带。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述PCR扩增的反应体系的总体积为20μl，包括1×PCR缓冲液、MgCl21.5mM、dNTP各250μM、TaqDNA聚合酶1U、每条引物4pmol、模板DNA 80ng；反应条件为首先94℃变性5min；然后94℃变性1min，55℃退火55sec，72℃延伸1min，共36个循环；最后72℃延伸10min。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于所述检测扩增产物方法为对扩增产物进行6％的聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后银染显色。
全文摘要
本发明公开了一种检测小麦多酚氧化酶活性性状的方法及其专用引物。本发明所提供的用于检测小麦多酚氧化酶活性性状的引物，是由序列表中序列1的核苷酸序列和序列2的核苷酸序列组成的一对引物。检测小麦多酚氧化酶活性性状的方法，是以待测小麦基因组DNA为模板，以序列表中序列1的核苷酸序列和序列2的核苷酸序列为引物，进行PCR扩增，检测扩增产物中是否有198bp大小的条带。本发明的方法及其专用引物将在小麦多酚氧化酶活性性状的检测和育种中发挥重要作用。
文档编号C12Q1/68GK1778966SQ20041009042
公开日2006年5月31日 申请日期2004年11月18日 优先权日2004年11月18日
发明者何中虎, 张立平, 孙道杰, 夏先春 申请人:中国农业科学院作物育种栽培研究所