专利名称：一种基于生物芯片检测核酸结合蛋白的方法
技术领域：
本发明涉及核酸结合蛋白的检测方法，特别是涉及一种基于生物芯片检测核酸结合蛋白的方法。
背景技术：
核酸结合蛋白包括双链DNA结合蛋白，单链DNA结合蛋白和RNA结合蛋白等。
双链DNA结合蛋白是一类可以与一段特定序列的双链DNA特异结合的蛋白质分子或是蛋白质分子复合物。双链DNA结合蛋白主要包括原核生物中的阻遏子、操作子蛋白和真核生物中的转录因子等。这些双链DNA结合蛋白通过与特定序列的DNA双链(operator/promoter)结合，从而激活、抑制、减弱或是增强特定基因的表达。原核生物中的阻遏子蛋白和操作子蛋白的功能相对简单，可以调控编码细胞代谢过程所需酶类、编码抗生素耐受基因的表达，使得细胞的生理活动与外界的环境相适应；真核生物的转录因子的功能繁多，细胞周期、细胞凋亡、癌变等各种现象都与特定的转录因子密切相关。在生物体，尤其是真核生物的基因表达调控网络中，编码蛋白质的基因的表达要经过转录因子介导的转录激活，转录，转录后修饰(包括RNA的剪切、加帽和加尾)，翻译，翻译后修饰(包括磷酸化、糖基化、乙酰化等)等过程，在转录前、转录后和翻译后三个水平受到调控。
转录因子介导的转录激活作为整个基因表达调控网络的第一环是非常重要的。生物体对外界环境的应激反应大多是通过特定的转录因子开启或是关闭一些特定的基因实现的。研究表明，绝大多数的真核生物的基因的表达都受到一个或是一些特定的转录因子的调节。愈是复杂的生物体，编码转录因子的基因一般愈多，基因表达调控的机制也更为复杂。据预测，人类基因组中有超过5％的编码蛋白质的基因是编码转录因子的。许多转录因子与癌症密切相关。例如有些转录因子是一些仅仅在恶性肿瘤组织中才表达或是会增强表达的原癌基因的产物(如FOS和C-Myc)，而又有一些转录因子仅仅在恶性肿瘤组织中微弱表达或是没有表达(如p53和E2F)。因此，如果可以检测生物体某一时刻的部分转录因子或是全部转录因子的表达水平，再结合已知的转录因子调控基因的数据，就可以得到转录前水平的调控信息，可能用以诊断组织是否发生癌变，还可以筛选药物靶点，研究一些细胞应激反应的机制，观察细胞的信号通路的激活或是关闭等。
现有的cDNA微阵列技术可以给出全基因组水平所有转录因子编码基因的mRNA表达状况的数据。但是只有具有活性的转录因子才可以调控基因的表达，而转录因子的活性往往受到磷酸化，乙酰化，糖基化等多种修饰方式的调控，转录因子在细胞中的定位也会影响转录因子的活性，所以具有活性的转录因子的数量和转录因子的mRNA或是蛋白水平的表达状况并不是直接相关的。例如在细胞周期各个阶段中，转录因子Yin Yang 1(YY1)的mRNA和蛋白水平的表达几乎是恒定的，但是具有活性的YY1数量是随着细胞周期有规律变化。所以cDNA微阵列从理论上是不能给出生物学家感兴趣的转录因子表达谱数据的。
常规的“活性”双链DNA结合蛋白(转录因子)的检测方法是凝胶滞留法(EMSAElectrophoretic Mobility Shift Assay，gel shift，band shift)。将待测蛋白质样品与已知的带有同位素标记的DNA双链分子混合反应后，在非变性的条件下进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。由于在电泳过程中，结合了蛋白质的双链核酸分子比没有结合蛋白质的双链核酸分子迁移的慢一些，电泳后通过放射自显影，可以在胶片上得到分立的电泳条带，从而可以判断是否有预期的双链核酸和结合蛋白的相互作用的发生。近年来，凝胶滞留技术也得到了一些改进，例如使用荧光或是化学放光技术替代同位素进行检测。针对非特异结合现象，使用特异的双链DNA结合蛋白的抗体进行DNA-结合蛋白复合物的检测，称为Super-shift。凝胶滞留法这项技术的出现极大地推动了DNA和蛋白质相互作用的研究工作，但是它存在着明显的缺点操作复杂；耗时耗力，往往需要一整天的时间进行实验；检测通量低，一次仅仅能对一种双链核酸结合蛋白进行检测，检测多种双链核酸结合蛋白时，需要的样品量较多；检测如果使用同位素，对人体有潜在的伤害，如果使用化学发光或是荧光，价格昂贵。
美国的BD Biosciences Clontech公司(Palo Alto，CA)推出了一种MercuryTM转录因子试剂盒(MercuryTMTranscription Factor Kit)。该试剂盒给出了用以检测转录因子的96孔板。96孔板上的每个孔里包被有带有可以与一种转录因子特异结合的核酸序列的双链DNA探针。将待检测样品加入孔中进行反应，探针就会与待测样品中对应的转录因子结合。清洗后，再加入特异识别该转录因子的一抗，再加入酶标记的二抗与一抗结合，进行化学发光检测。该技术大大缩短了传统的凝胶滞留方法的实验时间，使用化学发光技术替代了可能对人体产生伤害的同位素。但是仍然存在通量较低的问题，即一次(一个孔中进行的反应)仅仅能对一种转录因子进行检测；检测多种双链核酸结合蛋白时，需要的样品量较多；反应需要使用特异识别转录因子的抗体，而大多数转录因子并没有满足上述方法需要的商业化的一抗。
生物体内还有一些序列特异的单链DNA结合蛋白和RNA结合蛋白，它们大多可以调节生物体的生理活动。此外，通过体外进化(in vitro evolution)的方法，可以筛选出与靶标蛋白分子特异结合的类似于抗体的核酸配体，这些核酸结合蛋白还没有相应的高通量的分析方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测通量高、灵敏特异的基于生物芯片检测核酸结合蛋白的方法。
本发明所述提供的基于生物芯片检测核酸结合蛋白的方法，包括如下步骤1)将含有若干组核酸捕获探针的溶液加入到含有若干待检核酸结合蛋白的生物样品体系中，形成核酸捕获探针—核酸结合蛋白复合物，所述核酸捕获探针的核酸序列含有至少一段能与目的核酸结合蛋白相结合的结合序列；2)分离出所述核酸捕获探针—核酸结合蛋白复合物，然后回收核酸捕获探针；3)将步骤2)所回收核酸捕获探针与固定在生物芯片基质上，且与所述核酸捕获探针对应的若干条单链固定化探针进行杂交，所述固定化探针的核酸序列与其对应的所述核酸捕获探针或核酸捕获探针中的一条链互补；4)检测杂交结果。
其中，步骤2)所述分离出所述核酸捕获探针—核酸结合蛋白复合物按如下五种过程进行a)将步骤1)所得混合样品用常规凝胶电泳分离，经切胶、用试剂盒分离或用电洗脱得到所述核酸捕获探针—核酸结合蛋白复合物。b)将步骤1)所得混合样品采用色谱柱方法分离得到核酸捕获探针—核酸结合蛋白复合物。c)将步骤1)所得混合样品通过滤膜，分离得到核酸捕获探针—核酸结合蛋白复合物，所述滤膜可以吸附蛋白。d)将步骤1)所得混合样品中加入可以特异识别各个核酸结合蛋白的抗体，使用类似于抗体纯化的方法(例如使用protein A/G包被的agarose珠体结合抗体)，分离得到核酸捕获探针—核酸结合蛋白复合物。e)将步骤1)所得混合样品用毛细管电泳设备进行分离，自动收集所述核酸捕获探针—核酸结合蛋白复合物。
本发明方法可命名为“末端标记法”，可以用来检测核酸结合蛋白，如双链DNA结合蛋白，单链DNA结合蛋白，RNA结合蛋白(如HuB，HuC，ELAV等)等，通过体外进化方法筛选出来的非天然的可以结合蛋白分子的核酸配体(如凝血酶(thrombin)的核酸配体(aptamer)等)也可以应用本发明方法进行检测。
在本发明中，所述核酸结合蛋白优选为双链DNA结合蛋白，更优选的是转录因子，如AP1，Sp1，p53，E2F等。
在应用本发明方法进行检测时，其中优选的情况是所述核酸捕获探针的核酸序列含有一段能与目的核酸结合蛋白相结合的结合序列；每组所述核酸捕获探针的一条核酸链的一端均带有一段突出端序列。
为了能提高核酸捕获探针与固定化探针的杂交能力，所述固定化探针与其对应的所述核酸捕获探针中的带有突出端序列的核酸链完全互补。
为方便进行杂交信号检测，所述核酸捕获探针中的带有突出端序列的核酸链的一端还带有标记分子，其中，优选为生物素，第高辛，荧光标记，量子点，金颗粒，纳米颗粒。
为提高检测灵敏度，可以对本发明方法进行如下改进(“杂交前进行单链扩增法”)每组所述核酸捕获探针的一条核酸链的3’端还均带有一段3’突出端序列，进行步骤3)所述杂交前，还利用一条引物对所述回收核酸捕获探针进行扩增，所述引物能与所述核酸捕获探针中的带有3’突出端序列的核酸链杂交，以便于进行随后的核酸扩增步骤。
其中，优选的情况是每组所述核酸捕获探针的一条带有3’突出端序列的核酸链中的所述3’突出端序列均相同，所述引物的序列与所述3’突出端序列完全互补。
此时，为方便进行杂交信号检测，可以在体系中加入标记分子，可以先使引物分子末端带有标记分子再进行扩增，也可以在进行扩增时在扩增原料中掺有带标记分子的核苷酸，其中，标记分子优选为生物素，第高辛，荧光标记，量子点，金颗粒，纳米颗粒。
为提高检测灵敏度，可以对本发明方法进行另一种改进(“杂交前进行双链扩增法”)每组所述核酸捕获探针的一条核酸链的3’端和5’端还均分别带有一段3’突出端序列和一段5’突出端序列；进行步骤3)所述杂交前，还利用两条引物对所述回收核酸捕获探针进行扩增，所述两条引物中的一条能与所述核酸捕获探针中的带有3’突出端序列和5’突出端序列的核酸链的3’突出端杂交，另外一条引物的序列和所述核酸捕获探针中的带有3’突出端序列和5’突出端序列的核酸链的5’突出端一致。
其中，优选的情况是所述核酸捕获探针的带有3’突出端序列和5’突出端的核酸链中的所述3’突出端序列均相同，所述核酸捕获探针的带有3’突出端序列和5’突出端的核酸链中的所述5’突出端序列均相同，所述两条引物一条能与所述核酸捕获探针中的带有3’突出端序列和5’突出端序列的核酸链的3’突出端杂交，另外一条引物的序列和所述核酸捕获探针中的带有3’突出端序列和5’突出端序列的核酸链的5’突出端一致。
采用双链扩增法进行检测的操作流程如图7所示，将捕获探针1与目的蛋白3(图中为圆形和三角形)混合反应，经分离后得到核酸捕获探针—核酸结合蛋白复合物4，回收捕获探针；用两条引物6对所回收捕获探针进行扩增，扩增后的产物与固定有固定化探针2的芯片5进行杂交，检测杂交信号即可得到检测结果。所用的捕获探针、固定化探针和引物的优选结构如图8所示捕获探针含有一个目的蛋白的结合序列，其两条链中的一条带有3’突出端和5’突出端；引物1的序列与该3’突出端序列互补，引物2的序列和5’突出端一致；固定化探针序列与该结合序列一致。
同样，为方便进行杂交信号检测，可以在体系中加入标记分子，可以先使引物分子末端带有标记分子再进行扩增，也可以在进行扩增时在扩增原料中掺有带标记分子的核苷酸，其中，标记分子优选为生物素，第高辛，荧光标记，量子点，金颗粒，纳米颗粒。
本发明采用生物芯片方法进行核酸结合蛋白，特别是转录因子的检测，通过捕获探针与固定化探针的杂交信号检测，具有检测灵敏度高和检测通量高的优点；而且，当采用本发明的两种改进方法(杂交前单链扩增、杂交前双链扩增)时，可以先对引物进行预先标记，而不再需要对每组核酸捕获探针进行分子标记修饰，能大大降低实验成本。本发明方法可以广泛用于疾病诊断、药物靶标筛选、疾病机理等领域。
图1为本发明的使用“末端标记法”检测多种核酸结合蛋白的操作流程示意图；图2为本发明的使用“末端标记法”检测多种核酸结合蛋白的探针结构示意图；图3A为实施例1芯片点阵设计图；图3B为实施例1同时检测三种结合蛋白的实验结果；图3C为实施例1同时检测三种结合蛋白的实验结果，结合反应体系中加入了AP1的竞争性结合探针；图3D为实施例1同时检测三种结合蛋白的实验结果，结合反应体系中加入了NFkB的竞争性结合探针；图3E为实施例1同时检测三种结合蛋白的实验结果，结合反应体系中加入了Sp1的竞争性结合探针；图4为本发明的使用“单链扩增法”检测多种核酸结合蛋白的操作流程示意图；图5为本发明的使用“单链扩增法”检测多种核酸结合蛋白的探针、引物结构示意图；图6A为实施例2使用“单链扩增法”同时检测三种结合蛋白(AP1、NFkB、Sp1)的实验结果；图6B为实施例2采用与实施例1相同的“末端标记法”进行检测的实验结果；图7为本发明的使用“双链扩增法”检测多种核酸结合蛋白的操作流程示意图；图8为本发明的使用“双链扩增法”检测多种核酸结合蛋白的探针、引物结构示意图。
具体实施例方式
实施例1、使用DNA芯片同时检测3种核酸结合蛋白AP1，NFkB和Sp1(末端标记法)采用末端标记法进行检测的操作流程如图1所示，将捕获探针1与目的蛋白3(图中为圆形和三角形)混合反应，经分离后得到核酸捕获探针—核酸结合蛋白复合物4，回收捕获探针，然后与固定有固定化探针2的芯片5进行杂交，检测杂交信号即可得到检测结果。
其中，所用的捕获探针和固定化探针的优选探针结构如图2所示捕获探针含有一个目的蛋白的结合序列，其两条链中的一条带有突出端和标记分子，图中为生物素(biotin)；固定化探针与捕获探针中的长链互补。
试验材料转录因子AP-1(c-Jun)(#E3061)，NFkB(p50)(#E3770)和Sp1(#E6391)来自Promega公司(Madison，WI)。通用结合缓冲液的成分为10mM Tris-HCl(pH7.5)，4％甘油，1mM MgCl2，0.5mM EDTA，5mM DTT，50mM NaCl，0.05mg/mL poly(dI-dC)·(dI-dC)。使用的电泳缓冲液是0.5×TBE(0.9M Tris碱，0.9M硼酸，0.02M EDTA，pH8.0)。PBST(磷酸缓冲液，0.1％Tween 20)作为清洗液。电泳用琼脂糖来自Biowest公司(Miami，FL)。牛血清白蛋白(BSA)购自Amresco公司(Solon，OH)。Cy3标记的链霉亲和素购自Amersham Biosciences(Uppsala，Sweden)。
实验步骤A.DNA探针的制备所有的探针都由上海博亚公司合成，探针的序列见表1(表中AP-1-IP为AP1的固定探针，AP-1-LP、AP-1-FP组成为AP1的捕获探针，AP-1-CP和AP-1-FP组成为AP1的竞争性结合探针，其他探针的表示与此类似；本实施例LP探针的突出端序列为5’-CGGGA-3’。)。每组中的固定探针都先用水溶解，配置在50％二甲亚砜(DMSO)的溶液中，探针的终浓度为10微摩尔每升。蛋白捕获探针都用水溶解，再把对应的探针(每组探针中的FP和LP探针)退火形成双链，其中每组探针的终浓度都为60纳摩尔每升。
B.DNA芯片的制作使用PixSys5500(Cartesian Technologies，Irvine，CA)机械手将上述的固定探针按照图3A的点阵模式点制到氨基修饰的玻片上，点间距为350微米。点样完毕后，玻片在80摄氏度的温箱中烘烤1小时，再使用紫外胶连仪，在250毫焦的能量下胶连以固定点在玻片表面的核酸分子。图3A中A1-A5为AP1固定探针，B1-B5为NFkB固定探针，C1-C5为Sp1固定探针，D1-D5为TFIID固定探针，E1-E5为NC固定探针，F1-F5为HC固定探针，A6、B6、C6、D6、E6、F6为点样对照，该点样对照是一种本身带有荧光素的核酸分子，在点样结束后扫描玻片，可以检测到点样对照，证明玻片点样的步骤正确。
C.核酸—蛋白结合体系的配置将三种转录因子(1.0μg AP1，300ng NFkB和1.0μgSp1)和蛋白捕获探针(就是LP和FP的退火产物)混合，加入通用结合缓冲液，使得缓冲液的终浓度达到1X。反应体系在室温结合30分钟。进行图3C、图3D、图3E所描述的实验时，在反应体系中还加有竞争性结合探针(CP)。
D.核酸—蛋白结合体系的分离预先配置2％的琼脂糖凝胶和电泳用的TBE缓冲液，并预冷到4℃。将上述结合反应体系加入凝胶的加样孔，在120伏电压下电泳20分钟。根据电泳缓冲液中溴酚兰指示剂的位置，切出所需要的凝胶部分。
E.核酸的回收使用Qiagen公司的QIAGEN II型凝胶回收试剂盒回收上一步骤中得到的凝胶中的核酸，按照产品说明书进行。
F.芯片的杂交分析将上步得到的核酸，配置成15微升体系的杂交液(杂交液中还加有HC-LP探针)，其中含有3XSSC和0.1％的SDS，加到DNA芯片上，在65℃杂交1小时。然后使用0.2XSSC和0.1％SDS的清洗液清洗玻片，室温10分钟，再1000转/分甩干玻片。在芯片上加入1％BSA进行封闭，反应条件为37℃30分钟。使用PBST清洗玻片，室温10分钟，再1000转/分甩干玻片。加15微升的1微克/毫升浓度的Cy3标记的链霉亲和素到芯片表面，37℃反应1小时。使用PBST清洗玻片，室温10分钟，再1000转/分甩干玻片。使用Scanarray 4000扫描仪进行图像扫描，图像使用GenePix进行分析处理。其中图3A是芯片的点阵设计图；图3B是使用“末端标记法”在芯片上同时检测3种核酸结合蛋白的实验结果；图3C是使用“末端标记法”在芯片上同时检测3种核酸结合蛋白的实验结果，结合反应体系中加入了核酸结合蛋白AP1的竞争性结合探针；图3D是使用“末端标记法”在芯片上同时检测3种核酸结合蛋白的实验结果，结合反应体系中加入了核酸结合蛋白NFkB的竞争性结合探针；图3E是使用“末端标记法”在芯片上同时检测3种核酸结合蛋白的实验结果，结合反应体系中加入了核酸结合蛋白Sp1的竞争性结合探针。结果表明，采用本发明的“末端标记方法”可以很明显地检测出三种转录因子，而NC中的序列来自于原核生物噬菌体的启动子序列，和真核生物的转录因子结合序列差异很大，不能与任何一个上述转录因子结合，所以NC探针的信号始终为阴性；HC是作为杂交对照，在杂交之前加入，用以对不同的点阵进行归一化处理，所以HC信号始终为阳性。
表1.几种转录因子的固定探针和捕获探针的探针序列表
实施例2、使用DNA芯片同时检测3种核酸结合蛋白AP1，NFkB和Sp1(单链扩增法)采用单链扩增法进行检测的操作流程如图4所示，将捕获探针1与目的蛋白3(图中为圆形和三角形)混合反应，经分离后得到核酸捕获探针—核酸结合蛋白复合物4，回收捕获探针；用引物6对所回收捕获探针进行扩增，扩增后的产物与固定有固定化探针2的芯片5进行杂交，检测杂交信号即可得到检测结果。
其中，所用的捕获探针、固定化探针和引物的优选设计原理如图5所示捕获探针含有一个目的蛋白的结合序列，其两条链中的一条带有3’突出端；引物序列与该3’突出端互补；固定化探针与该结合序列一致。
试验材料转录因子AP-1(c-Jun)(#E3061)，NFkB(p50)(#E3770)和Sp1(#E6391)来自Promega公司(Madison，WI)。通用结合缓冲液的成分为10mM Tris-HCl(pH7.5)，4％甘油，1mM MgCl2，0.5mM EDTA，5mM DTT，50mM NaCl，0.05mg/mL poly(dI-dC)·(dI-dC)。使用的电泳缓冲液是0.5×TBE(0.9M Tris碱，0.9M硼酸，0.02M EDTA，pH8.0)。PBST(磷酸缓冲液，0.1％Tween 20)作为清洗液。电泳用琼脂糖来自Biowest公司(Miami，FL)。牛血清白蛋白(BSA)购自Amresco公司(Solon，OH)。Cy3标记的链霉亲和素购自Amersham Biosciences(Uppsala，Sweden)。
实验步骤A.DNA探针的制备探针都由上海博亚公司合成，探针的序列见表2(每组探针中的LFP和LP’探针组成为对应转录因子的捕获探针；IP探针为固定探针)。每组中的固定探针制备方法同实施例1中的“DNA探针制备”部分。蛋白捕获探针都用水溶解，再把对应的探针(每组探针中的LFP和LP’探针)退火形成双链，其中每组探针的终浓度都为60纳摩尔每升。
B.DNA芯片的制作同实施例1中的“DNA芯片的制作”部分。
C.核酸—蛋白结合体系的配置将三种转录因子(1.0μg AP1，100ng NFkB和0.1μgSp1)和蛋白捕获探针混合，加入通用结合缓冲液，使得缓冲液的终浓度达到1X。反应体系在室温结合30分钟。
D.核酸—蛋白结合体系的分离预先配置2％的琼脂糖凝胶和电泳用的TBE缓冲液，并预冷到4℃。将上述结合反应体系加入凝胶的加样孔，在120伏电压下电泳20分钟。根据电泳缓冲液中溴酚兰指示剂的位置，切出所需要的凝胶部分。
E.核酸的回收使用Qiagen公司的QIAGEN II型凝胶回收试剂盒回收上一步骤中得到的凝胶中的核酸，按照产品说明书进行。最后用20微升的洗脱液进行洗脱。
F.芯片的杂交分析将上步得到的核酸，真空抽干，加入5微升水重新溶解，加入dNTP和PCR的缓冲液，再加入带有Cy3标记的T7 Pro的引物进行核酸扩增。PCR程序是95度5分钟；95度30秒，53度30秒，72度20秒，重复40个循环；73度7分钟。扩增产物真空抽干，用5微升水重新溶解，配置成15微升体系的杂交液(HC-LP探针也于此时加入到杂交液中)，其中含有3XSSC和0.1％的SDS，加到DNA芯片上，在65℃杂交1小时。然后使用0.2XSSC和0.1％SDS的清洗液清洗玻片，室温10分钟，再1000转/分甩干玻片。使用Scanarray 4000扫描仪进行图像扫描，图像使用GenePix进行分析处理。
以采用实施例1的“末端标记法”进行本实施例三种蛋白的检测，作为本实施例检测结果的对照。
检测结果分别如图6A和图6B所示，图6A是采用“单链扩增法”进行检测的实验结果图；图6B为采用实施例1的“末端标记法”进行检测的结果图，图中，A1-A5为AP1检测结果点；B1-B5为NFkB检测结果点；C1-C5为杂交对照点(HC点，HC-IP与HC-LP序列见表1)；D1-D5为Sp1检测结果点。结果表明，采用单链扩增法进行检测可以提高本发明方法的检测灵敏度，使采用末端标记法不能检测出来的信号点也能清楚、灵敏地检测出来。
表2.带3’突出端序列的探针序列表
权利要求
1.一种基于生物芯片检测核酸结合蛋白的方法，包括如下步骤1)将含有若干组核酸捕获探针的溶液加入到含有若干待检核酸结合蛋白的生物样品体系中，形成核酸捕获探针—核酸结合蛋白复合物，所述核酸捕获探针的核酸序列含有至少一段能与目的核酸结合蛋白相结合的结合序列；2)分离出所述核酸捕获探针—核酸结合蛋白复合物，然后回收核酸捕获探针；3)将步骤2)所回收核酸捕获探针与固定在生物芯片基质上，且与所述核酸捕获探针对应的若干条单链固定化探针进行杂交，所述固定化探针的核酸序列与其对应的所述核酸捕获探针或核酸捕获探针中的一条链互补；4)检测杂交结果。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤2)所述分离出所述核酸捕获探针—核酸结合蛋白复合物按如下过程进行将步骤1)所得混合样品用凝胶电泳分离，经切胶、用试剂盒分离或用电洗脱得到所述核酸捕获探针—核酸结合蛋白复合物。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤2)所述分离出所述核酸捕获探针—核酸结合蛋白复合物按如下过程进行将步骤1)所得混合样品采用色谱柱方法分离得到核酸捕获探针—核酸结合蛋白复合物。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤2)所述分离出所述核酸捕获探针—核酸结合蛋白复合物按如下过程进行将步骤1)所得混合样品通过滤膜，分离得到核酸捕获探针—核酸结合蛋白复合物，所述滤膜可以吸附蛋白。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤2)所述分离出所述核酸捕获探针—核酸结合蛋白复合物按如下过程进行将步骤1)所得混合样品中加入可以特异识别各个核酸结合蛋白的抗体，使用抗体纯化的方法，分离得到核酸捕获探针—核酸结合蛋白复合物。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤2)所述分离出所述核酸捕获探针—核酸结合蛋白复合物按如下过程进行将步骤1)所得混合样品用毛细管电泳进行分离，收集所述核酸捕获探针—核酸结合蛋白复合物。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述核酸结合蛋白为双链DNA结合蛋白，RNA结合蛋白，单链DNA结合蛋白或通过体外进化方法筛选出来的非天然的可以结合蛋白分子的核酸配体。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述双链DNA结合蛋白为转录因子。
9.根据权利要求1-8任一所述的方法，其特征在于所述核酸捕获探针的核酸序列含有一段能与目的核酸结合蛋白相结合的结合序列。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于每组所述核酸捕获探针的一条核酸链的一端均带有一段突出端序列。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于所述固定化探针与其对应的所述核酸捕获探针中的带有突出端序列的核酸链完全互补。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于所述核酸捕获探针中的带有突出端序列的核酸链还带有标记分子。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于所述标记分子为生物素，第高辛，荧光标记，量子点，金颗粒或纳米颗粒。
14.根据权利要求1-8任一所述的方法，其特征在于每组所述核酸捕获探针的一条核酸链的3’端还均带有一段3’突出端序列，进行步骤3)所述杂交前，还利用一条引物对所述回收核酸捕获探针进行扩增，所述引物能与所述核酸捕获探针中的带有3’突出端序列的核酸链杂交。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于每组所述核酸捕获探针的一条带有3’突出端序列的核酸链中的所述3’突出端序列均相同，所述引物的序列与所述3’突出端序列完全互补。
16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于所述利用一条引物进行扩增时所述引物中还掺有标记分子。
17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于所述引物分子的5’端带有标记分子。
18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于所述标记分子为生物素，第高辛，荧光标记，量子点，金颗粒或纳米颗粒。
19.根据权利要求15所述的方法，其特征在于所述利用一条引物进行扩增时还在扩增原料中掺有带标记分子的核苷酸。
20.根据权利要求19所述的方法，其特征在于所述标记分子为生物素，第高辛，荧光标记，量子点，金颗粒或纳米颗粒。
21.根据权利要求1-8任一所述的方法，其特征在于每组所述核酸捕获探针的一条核酸链的3’端和5’端还均分别带有一段3’突出端序列和一段5’突出端序列；进行步骤3)所述杂交前，还利用两条引物对所述回收核酸捕获探针进行扩增，所述两条引物中的一条能与所述核酸捕获探针中的带有3’突出端序列和5’突出端序列的核酸链的3’突出端杂交，另外一条引物的序列和所述核酸捕获探针中的带有3’突出端序列和5’突出端序列的核酸链的5’突出端一致。
22.根据权利要求21所述的方法，其特征在于所述核酸捕获探针的带有3’突出端序列和5’突出端的核酸链中的所述3’突出端序列均相同，所述核酸捕获探针的带有3’突出端序列和5’突出端的核酸链中的所述5’突出端序列均相同，所述两条引物一条能与所述核酸捕获探针中的带有3’突出端序列和5’突出端序列的核酸链的3’突出端杂交，另外一条引物的序列和所述核酸捕获探针中的带有3’突出端序列和5’突出端序列的核酸链的5’突出端一致。
23.根据权利要求22所述的方法，其特征在于所述利用两条引物进行扩增时所述引物中还掺有标记分子。
24.根据权利要求23所述的方法，其特征在于所述引物分子的5’端带有标记分子。
25.根据权利要求24所述的方法，其特征在于所述标记分子为生物素，第高辛，荧光标记，量子点，金颗粒或纳米颗粒。
26.根据权利要求22所述的方法，其特征在于所述利用两条引物进行扩增时还在扩增原料中掺有带标记分子的核苷酸。
27.根据权利要求26所述的方法，其特征在于所述标记分子为生物素，第高辛，荧光标记，量子点，金颗粒或纳米颗粒。
全文摘要
本发明公开了一种基于生物芯片检测核酸结合蛋白的方法，包括如下步骤1)将含有若干组核酸捕获探针的溶液加入到含有若干待检核酸结合蛋白的生物样品体系中，形成核酸捕获探针－核酸结合蛋白复合物，所述核酸捕获探针的核酸序列含有至少一段能与目的核酸结合蛋白相结合的结合序列；2)分离出所述核酸捕获探针－核酸结合蛋白复合物，然后回收核酸捕获探针；3)将步骤2)所回收核酸捕获探针与固定在生物芯片基质上，且与所述核酸捕获探针对应的若干条单链固定化探针进行杂交，所述固定化探针的核酸序列与其对应的所述核酸捕获探针或核酸捕获探针中的一条链互补；4)检测杂交结果。本发明可以广泛用于疾病诊断、药物靶标筛选、疾病机理等领域。
文档编号C12Q1/68GK1635165SQ20041009042
公开日2005年7月6日 申请日期2004年11月18日 优先权日2004年11月18日
发明者邵威, 赵永超, 孙义民, 乔继英, 魏华江, 杨卫平, 周玉祥, 程京 申请人:北京博奥生物芯片有限责任公司, 清华大学