辅助鉴定具有优良性状的小麦的方法

专利名称：：辅助鉴定具有优良性状的小麦的方法
技术领域：
：本发明涉及一种辅助鉴定具有优良性状的小麦的方法。
背景技术：
：长期以来，小麦产量一直是育种家改良和培育品种中最为重要的目标，但产量总体上受环境影响较大，尤其是水肥条件的影响较大，因此培育广适性品种则成为提高小麦产量的主要运用手段。近些年，随着分子生物学技术的快速发展，与产量性状相关的多个QTL位点也逐渐被发现和定位。Groos等(GroosC,RobertN,BervasE,CharmetG.Geneticanalysisofgrainprotein-content,grainyieldandthousand—kernelweightinbreadwheat.Theor.Appl.Genet.2003，106:1032_1040)在小麦的7D染色体上发现了控制小麦产量的QTL，而在染色体7A和7D上则发现了控制籽粒千粒重的QTL。Quarrie等(QuarrieSA,SteedA,CalestaniC,etal.Ahighdensitygeneticmapofhexaploidwheat(TriticumaestivumL.)fromthecrossChineseSpringxSQ1anditsusetocompareQTLsforgrainyieldacrossarangeofenvironments.Theor.Appl.Genet.2005,110865-880；QuarrieSA,PekicQuarrieS,RadosevicR,etal.DissectingawheatQTLforyieldpresentinarangeofenvironments:fromtheQTLtocandidategenes,JExp.Botany2006，57:2627_2637)则在一个DH群体中发现了多个控制产量性状的QTL位点，其中7AL和7BL上的QTL贡献最大，尤其是对小麦穗粒数的贡献率最高，他还在7AL上发现了控制小麦粒重的QTL。Wilkinson^(WilkinsonM,WanY,TosiP,etal.Identificationandgeneticmappingofvariantformsofpuroindolinebexpressedindevelopingwheatgrain.JCerealSci，2008，48:722_728)在小麦的cDNA中发现了三种与puroindolineb基因相似性达72%的基因，并将其定位在7A染色体的长臂上，进一步分析表明，该基因可能能够调控硬质小麦SKCS硬度5-7左右。Chen等(ChenF，BrianB,MorrisCF.Puroindolineb~2inwheat.Theoreticalandappliedgenetics,2009,D0I10.1007/s00122-009-1195-y)对上述三个基因进行了命名，分别为Pinb_2vl、Pinb_2v2和Pinb-2v3，并发现了一种新的基因类型，命名为Pinb-2v4，利用非整倍体进行物理定位后发现，Pinb-2vl位于7DL染色体上，Pinb_2v2位于7BL染色体上，Pinb_2v3位于7B染色体上，Pinb-2v4则位于7AL染色体上，且Pinb_2vl和Pinb_2v4出现在调查的所有品种中，而Pinb-2v2和Pinb-2v3则分别出现在不同的品种中。
发明内容本发明的目的是提供一种辅助鉴定具有优良性状的小麦的方法。本发明提供了辅助鉴定具有不同性状小麦的方法，包括如下步骤以待测小麦的基因组DNA为模板，用序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA组成的引物对进行PCR扩增，然后进行如下1)至6)中任一所述的判断1)能扩增出DNA片段的小麦的千粒重在统计学上小于不能扩增出DNA片段的小麦；2)能扩增出DNA片段的小麦的粒径在统计学上小于不能扩增出DNA片段的小麦；3)能扩增出DNA片段的小麦的穗粒重在统计学上小于不能扩增出DNA片段的小麦；4)能扩增出DNA片段的小麦的穗粒数在统计学上小于不能扩增出DNA片段的小麦；5)能扩增出DNA片段的小麦的旗叶面积在统计学小于不能扩增出DNA片段的小麦；6)能扩增出DNA片段的小麦的旗叶宽度在统计学小于不能扩增出DNA片段的小麦。1)至6)中，所述DNA片段具体可为401bp的DNA片段。本发明还保护序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA组成的引物对。所述引物对在制备辅助鉴定具有不同性状小麦的试剂盒中的应用也属于本发明的保护范围；所述性状为千粒重、粒径、穗粒数、每穗粒重(穗粒重)、旗叶面积和旗叶宽度中的至少一种。本发明还保护一种辅助鉴定具有不同性状小麦的试剂盒，包括所述引物对；所述性状为千粒重、粒径、穗粒数、每穗粒重、旗叶面积和旗叶宽度中的至少一种。本发明提供的另一种辅助鉴定具有不同性状小麦的方法，是检测待测小麦的基因组DNA中是否具有序列表的序列2所示核苷酸，然后进行如下1)至6)中任一所述的判断1)基因组DNA中具有序列表的序列2所示核苷酸的小麦的千粒重在统计学上小于基因组DNA中不具有序列表的序列2所示核苷酸的小麦；2)基因组DNA中具有序列表的序列2所示核苷酸的小麦的粒径在统计学上小于基因组DNA中不具有序列表的序列2所示核苷酸的小麦；3)基因组DNA中具有序列表的序列2所示核苷酸的小麦的穗粒重在统计学上小于基因组DNA中不具有序列表的序列2所示核苷酸的小麦；4)基因组DNA中具有序列表的序列2所示核苷酸的小麦的穗粒数在统计学上小于基因组DNA中不具有序列表的序列2所示核苷酸的小麦；5)基因组DNA中具有序列表的序列2所示核苷酸的小麦的旗叶面积在统计学小于基因组DNA中不具有序列表的序列2所示核苷酸的小麦；6)基因组DNA中具有序列表的序列2所示核苷酸的小麦的旗叶宽度在统计学小于基因组DNA中不具有序列表的序列2所示核苷酸的小麦。本发明提供的第三种辅助鉴定具有不同性状小麦的方法，是检测待测小麦的基因组DNA中是否具有序列表的序列2自5’端第34至434位所示核苷酸，然后进行如下1)至6)中任一所述的判断1)基因组DNA中具有序列表的序列2自5，端第34至434位所示核苷酸的小麦的千粒重在统计学上小于基因组DNA中不具有序列表的序列2自5’端第34至434位所示核苷酸的小麦；2)基因组DNA中具有序列表的序列2自5，端第34至434位所示核苷酸的小麦的粒径在统计学上小于基因组DNA中不具有序列表的序列2自5’端第34至434位所示核苷酸的小麦；3)基因组DNA中具有序列表的序列2自5，端第34至434位所示核苷酸的小麦的穗粒重在统计学上小于基因组DNA中不具有序列表的序列2自5’端第34至434位所示核苷酸的小麦；4)基因组DNA中具有序列表的序列2自5’端第34至434位所示核苷酸的小麦的穗粒数在统计学上小于基因组DNA中不具有序列表的序列2自5’端第34至434位所示核苷酸的小麦；5)基因组DNA中具有序列表的序列2自5，端第34至434位所示核苷酸的小麦的旗叶面积在统计学小于基因组DNA中不具有序列表的序列2自5’端第34至434位所示核苷酸的小麦；6)基因组DNA中具有序列表的序列2自5，端第34至434位所示核苷酸的小麦的旗叶宽度在统计学小于基因组DNA中不具有序列表的序列2自5’端第34至434位所示核苷酸的小麦。以待测小麦的基因组DNA为模板，用序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA组成的引物对进行PCR扩增得到的DNA片段即为序列表的序列2自5’端第34至434位所示DNA。所述方法，所述引物对，所述试剂盒，均可应用于小麦育种。本发明还保护一种蛋白质，是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与小麦生产性状相关的由序列1衍生的蛋白质。所述蛋白质的编码基因也属于本发明的保护范围。所述编码基因具体可为如下1)或2)或3)或4)的DNA分子1)序列表中序列2所示的DNA分子；2)序列表中序列2自5，端第34至434位核苷酸所示的DNA分子；3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码小麦生产性状相关蛋白的DNA分子；4)与1)或2)或3)限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码小麦生产性状相关蛋白的DNA分子。本发明公开了一个与小麦产量性状相关基因Pinb-2v2的功能及其在小麦产量性状改良中的应用，含有Pinb-2v2基因的小麦品种主要表现为与产量性状密切相关的性状总体表现不良，分别体现在千粒重低、粒径小、穗粒重低、穗粒数少、旗叶较窄和旗叶面积较小等特点。具有Pinb-2v3基因的普通小麦品种千粒重平均值40.3克、粒径平均值2.36毫米、穗粒数平均值45.5个、每穗粒重平均值1.86克、旗叶面积平均值25.2平方厘米、旗叶宽度平均值1.72厘米。因此，通过沉默Pinb-2v2基因，消除其对产量性状的负面影响将对利用基因工程技术改良小麦农艺性状和培育高产小麦品种起到十分重要作用，同时也有助于产量性状的遗传和分子生物学的进一步研究。本发明提供的方法可以应用于小麦的育种，实现早期筛选，节省时间和资源。具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例中所用引物均由上海生物工程公司合成。小麦材料为来自黄淮麦区的169份有代表性的农家小麦品种和当地大规模种植的普通小麦品种和高代品系，具体如下(ZM编号为国家种质资源库编号)1、钱交麦河南农业大学；参考文献赵亮，田纪春.山东省不同年代小麦推广品种遗传多样性的AFLP分析.分子植物育种，2007，5:403_411。2、晋麦50河南农业大学；参考文献刘新月，张久刚，卫云宗.优质抗旱小麦新品种晋麦78号的选育.山西农业科学，2007，4:35-37。3、庆丰1号ZM010038。4、江东门河南农业大学；参考文献田梦雨，李丹丹，戴廷波，姜东，荆奇，曹卫星.水分胁迫下不同基因型小麦苗期的形态生理差异.应用生态学报，2010，21:41-47。5、晋麦49河南农业大学；参考文献刘志峰，张晓鹏.山西南部高水肥地冬麦丰产技术.山西农业，2003，12:20-21。6、合作2号ZM009681。7、晋麦54:ZM010378o8、蚰包ZM009411。9、陇麦157河南农业大学；参考文献任根深.丰产多抗冬小麦新品系陇麦157选育报告.甘肃农业科技，2007，5:3-4。10、冀麦26河南农业大学；参考文献傅满良，马炳义.冀麦26在和田的种植表现及其栽培要点.新疆农业科学，1993，1:8-8。11、豫麦47河南农业大学；参考文献林作辑，雷振生，吴政卿，杨会民，章家长，刘嫒媛.豫麦47号选育与开发中的经验与问题.河南农业科学，2001,6:7-8。12、鲁麦19河南农业大学；参考文献曹学昌.旱地小麦新品种鲁麦19号的选育及配套技术.山东农业科学，1993，4:23-23。13、西农6028河南农业大学；参考文献张小燕，宋哲民，严威凯.陕西小麦品种生态亚型的分类1994，3:23-26。14、松花江1号ZM009687。15、红蚰子河南农业大学；参考文献黄惠主编。河南省及黄淮麦区小麦种质资源目录。黄河水利出版社，2003，1-117。16、昌乐5号:ZM009419o17、豫麦13河南农业大学；参考文献林作楫，王胜军.豫麦13小麦高产栽培技术河南农业科学，1992，1:8-12。18、藁麦9415河南农业大学；参考文献张清海，范濂，崔党群，牛云生。黄淮南片小麦主要审定推广小麦品种及其选育(2008修订版)。中国农业科学出版社，2008，Pp1-394。19、内乡182(豫麦17):ZM022977。20、山前麦ZM016066。21、洛旱2号河南农业大学；参考文献李永春，孟凡荣，王潇，陈雷，任江萍，牛洪斌，李磊，尹钧.水分胁迫条件下“洛旱2号”小麦根系的基因表达谱.作物学报，2008，342126-2133。22、信阳234河南农业大学；参考文献张清海，范濂，崔党群，牛云生。黄淮南片小麦主要审定推广小麦品种及其选育(2008修订版)。中国农业科学出版社，2008，Pp1-394。23、晋麦47河南农业大学；参考文献董孟雄，李秀绒，柴永峰，孙来虎.旱地小麦新品种-晋麦47号.麦类作物学报2001，21:98-98。24、西农881河南农业大学；参考文献晓雅.小麦新品种西农881.农村科技开发，2002，7:42-42。25、百农64河南农业大学；参考文献张清海，王志和，张桂兰.黄淮南片小麦申请推广品种及其选育.中国农业科技出版社，2000:1-401。26、阜阳936河南农业大学；参考文献张清海，范濂，崔党群，牛云生。黄淮南片小麦主要审定推广小麦品种及其选育(2008修订版)。中国农业科学出版社，2008，Pp1-394。27、晋麦61河南农业大学；参考文献潘幸来，谢三刚.晋麦61号中水小麦新品种简介.麦类作物学报.2002，4:106。28、五一麦河南农业大学；参考文献刘登才，郑有良，兰秀锦.小麦中国春遗传背景的育种改良中国农业科学2003，361383-1389。29、新麦9178(新麦13)河南农业大学；参考文献董昀，赵宗武，孔长江，马华平，蒋志凯.新麦13号选育特点及选育体会.小麦研究，2003，24:1-3。30、矮丰3号河南农业大学；参考文献汪夕彬，伊虎英，鱼红斌.辐射小麦丫1植株穗部的嵌合现象.遗传，1980，1215-18。31、豫麦58河南农业大学；参考文献张清海，王志和，张桂兰.黄淮南片小麦申请推广品种及其选育.中国农业科技出版社，2000:1-401。32、优麦2号河南农业大学；参考文献田纪春，王延训.节水高产优质小麦山农优麦2号的选育作物杂志，2001，445-45。33、冀麦29河南农业大学；参考文献张茶，梁虹，王睿辉，安浩军，王静华，赵金峰，赵玉新，常文锁。河北省主栽小麦品种醇溶蛋白遗传多样性分析。中回农学通报，2008，24:191-196。34、辉县红河南农业大学；参考文献李爱霞，亓增军，裴自友，庄丽芳，冯祎高，王秀娥.普通小麦辉县红-荆州黑麦异染色体系的选育及其梭条花叶病抗性鉴定.作物学报，2007，33:639-645。35、豫麦41河南农业大学；参考文献张清海，王志和，张桂兰.黄淮南片小麦申请推广品种及其选育.中国农业科技出版社，2000:1-401。36、泛麦5号河南农业大学；参考文献罗家传，朱高纪，张伟，吴秋艳，孙艳华，崔小东，韦胜利，高启云.小麦新品种泛麦5号播期播量研究.山东农业科学，2008，5:46-49。37、郑麦004河南农业大学；参考文献曹廷杰，王西成，赵虹，陈渝.国审小麦新品种郑麦004综合表现及利用前景分析.中国农学通报，2008，24:209_212。38、矮孟牛ZM022837。39、陕160河南农业大学；参考文献王怡，董剑.小麦新品种陕160的选育及体会麦类作物1999，19:56-58。40、周麦19河南农业大学；参考文献张清海，范濂，崔党群，牛云生。黄淮南片小麦主要审定推广小麦品种及其选育(2008修订版)。中国农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1.5小时)，电泳结束后用凝胶成像系统(MultiGeniusGelDocumentationandAnalysisSystem)扫描成像并用计算机进行分析。检测结果见表1。表1不同品种小麦性状的测定结果和基因型检测结果编千粒11粒径~~穗粒数~~每穗粒重旗叶宽旗叶长~旗叶面积是否具有号(mg)(mm)(个)(g)(cm)(cm)(cm2)PCR产物~3672391738Τθ625ΙθΓθ^~~2347Zl337172821202^~~33579Ζ243Γδθ173321209^~27ΛΓδ43Τθ8Τ37222Ζ6^~~5499Ζ839ΓθL4217Τ^~~6292Γδ40096L4334365^~~7502O45Ζ04L441819Λ^~~836762Λ421722L4517ΙδΓδ^~~93179252L78L4521228^~10429Ζ5371763L4914ΙδΓβ^~Π342Ζ230Τθ8ΠΙ16Τ^~12δΤΓθO411795175318207^~13295L766ΓδθUEl273L2^~14267Γδ36086Γδβ27βΤΓβ^~1537^4251L49Τ5720236^~163772Λ46LTJΤ5724283^~174782Λ492731Τβ17205^~1837501769Τβ182L7^~195042839ΓδΤβ22266^<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>有40份材料的PCR扩增产物电泳显示具有条带，将所有得到的PCR产物进行测序，发现PCR产物的核苷酸序列均如序列表的序列2自5’端第34至434位核苷酸所示。将PCR产物的核苷酸序列如序列表的序列2自5’端第34至434位核苷酸所示的小麦的基因型命名为Pinb-2v2基因型。总体上，拥有Pinb-2v2基因的小麦品种千粒重、粒径、穗粒数、每穗粒重、旗叶面积和旗叶宽度均显著低于不含Pinb-2v2的品种。为消除puroindoline基因对小麦产量性状的可能影响，进一步增强数据可靠性，分别对属于相同puroindoline基因型不同puroindolineb_2基因型的样本进行比较，拥有Pinb_2v2的小麦品种千粒重、粒径、穗粒数、每穗粒重、旗叶面积和旗叶宽度均显著低于不含Pinb-2v2的品种(见表2)。表2小麦Pinb-2v2基因型与其它基因型产量性状比较表<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>注不同字母差异表明差异达5%显著水平。权利要求一种辅助鉴定具有不同性状小麦的方法，包括如下步骤以待测小麦的基因组DNA为模板，用序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA组成的引物对进行PCR扩增，然后进行如下1)至6)中任一所述的判断1)能扩增出DNA片段的小麦的千粒重在统计学上小于不能扩增出DNA片段的小麦；2)能扩增出DNA片段的小麦的粒径在统计学上小于不能扩增出DNA片段的小麦；3)能扩增出DNA片段的小麦的穗粒重在统计学上小于不能扩增出DNA片段的小麦；4)能扩增出DNA片段的小麦的穗粒数在统计学上小于不能扩增出DNA片段的小麦；5)能扩增出DNA片段的小麦的旗叶面积在统计学小于不能扩增出DNA片段的小麦；6)能扩增出DNA片段的小麦的旗叶宽度在统计学小于不能扩增出DNA片段的小麦。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于1)至6)中，所述DNA片段为401bp的DNA片段。3.序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA组成的引物对。4.权利要求3所述引物对在制备辅助鉴定具有不同性状小麦的试剂盒中的应用；所述性状为千粒重、粒径、穗粒数、每穗粒重、旗叶面积和旗叶宽度中的至少一种。5.辅助鉴定具有不同性状小麦的试剂盒，包括权利要求3所述引物对；所述性状为千粒重、粒径、穗粒数、每穗粒重、旗叶面积和旗叶宽度中的至少一种。6.一种辅助鉴定具有不同性状小麦的方法，是检测待测小麦的基因组DNA中是否具有序列表的序列2所示核苷酸，然后进行如下1)至6)中任一所述的判断1)基因组DNA中具有序列表的序列2所示核苷酸的小麦的千粒重在统计学上小于基因组DNA中不具有序列表的序列2所示核苷酸的小麦；2)基因组DNA中具有序列表的序列2所示核苷酸的小麦的粒径在统计学上小于基因组DNA中不具有序列表的序列2所示核苷酸的小麦；3)基因组DNA中具有序列表的序列2所示核苷酸的小麦的穗粒重在统计学上小于基因组DNA中不具有序列表的序列2所示核苷酸的小麦；4)基因组DNA中具有序列表的序列2所示核苷酸的小麦的穗粒数在统计学上小于基因组DNA中不具有序列表的序列2所示核苷酸的小麦；5)基因组DNA中具有序列表的序列2所示核苷酸的小麦的旗叶面积在统计学小于基因组DNA中不具有序列表的序列2所示核苷酸的小麦；6)基因组DNA中具有序列表的序列2所示核苷酸的小麦的旗叶宽度在统计学小于基因组DNA中不具有序列表的序列2所示核苷酸的小麦。7.一种辅助鉴定具有不同性状小麦的方法，是检测待测小麦的基因组DNA中是否具有序列表的序列2自5’端第34至434位所示核苷酸，然后进行如下1)至6)中任一所述的判断1)基因组DNA中具有序列表的序列2自5’端第34至434位所示核苷酸的小麦的千粒重在统计学上小于基因组DNA中不具有序列表的序列2自5’端第34至434位所示核苷酸的小麦；2)基因组DNA中具有序列表的序列2自5’端第34至434位所示核苷酸的小麦的粒径在统计学上小于基因组DNA中不具有序列表的序列2自5’端第34至434位所示核苷酸的小麦；3)基因组DNA中具有序列表的序列2自5’端第34至434位所示核苷酸的小麦的穗粒重在统计学上小于基因组DNA中不具有序列表的序列2自5’端第34至434位所示核苷酸的小麦；4)基因组DNA中具有序列表的序列2自5’端第34至434位所示核苷酸的小麦的穗粒数在统计学上小于基因组DNA中不具有序列表的序列2自5’端第34至434位所示核苷酸的小麦；5)基因组DNA中具有序列表的序列2自5’端第34至434位所示核苷酸的小麦的旗叶面积在统计学小于基因组DNA中不具有序列表的序列2自5’端第34至434位所示核苷酸的小麦；6)基因组DNA中具有序列表的序列2自5’端第34至434位所示核苷酸的小麦的旗叶宽度在统计学小于基因组DNA中不具有序列表的序列2自5’端第34至434位所示核苷酸的小麦。8.权利要求1或2所述方法，权利要求3所述引物对，权利要求5所述试剂盒，权利要求6所述方法或权利要求7所述方法在小麦育种中的应用。9.一种蛋白质，是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与小麦生产性状相关的由序列1衍生的蛋白质。10.编码权利要求1所述蛋白的基因，优选如下1)或2)或3)或4)的DNA分子1)序列表中序列2所示的DNA分子；2)序列表中序列2自5，端第34至434位核苷酸所示的DNA分子；3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码小麦生产性状相关蛋白的DNA分子；4)与1)或2)或3)限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码小麦生产性状相关蛋白的DNA分子。全文摘要本发明公开了一种辅助鉴定具有优良性状的小麦的方法。本发明提供的方法，包括如下步骤以待测小麦的基因组DNA为模板，用序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA组成的引物对进行PCR扩增，然后进行如下1)至6)中任一所述的判断1)能扩增出DNA片段的小麦的千粒重在统计学上小于不能扩增出DNA片段的小麦；2)能扩增出DNA片段的小麦的粒径在统计学上小于不能扩增出DNA片段的小麦；3)能扩增出DNA片段的小麦的穗粒重在统计学上小于不能扩增出DNA片段的小麦；4)能扩增出DNA片段的小麦的穗粒数在统计学上小于不能扩增出DNA片段的小麦；5)能扩增出DNA片段的小麦的旗叶面积在统计学小于不能扩增出DNA片段的小麦；6)能扩增出DNA片段的小麦的旗叶宽度在统计学小于不能扩增出DNA片段的小麦。本发明提供的方法可以应用于小麦的育种，实现早期筛选，节省时间和资源。文档编号C12N15/29GK101798597SQ201010129598公开日2010年8月11日申请日期2010年3月19日优先权日2010年3月19日发明者崔党群,程西永,董中东,詹克慧,许海霞,陈锋申请人:河南农业大学