专利名称：稳定的脂酶变异体的制作方法
技术领域：
本发明涉及新型热稳定、有机溶剂耐受性以及pH耐受性的脂酶变异体的产生和制备。本发明还涉及筛选用于高温的脂酶变异体及其纯化的方法。
背景技术：
酶是细胞广为应用的物质，其几乎影响将有生命的生物体特征化的每个生物学过程。它们能够以显著的特异性以及增强的速率催化化学反应。酶强大的催化能力及其多功能性已经得到长期的证实，并且已经证明酶在活体系统外，同样是非常有用的。目前，酶已经在工业中广泛应用，并被认为是不破坏环境的化学试剂的替代物，因为酶反应需要的条件比较温和，同时会产生较少的副产品和废物因而是比较清洁的。酶正在使用于大量食品、饲料、农业、造纸、皮革以及纺织工业的新应用中，其显著地降低了成本并且不损害环境。
酶已经进化为在亲代生物的生理条件下会最好地发挥功能。而体外的应用通常需要酶在非生理条件下进行工作，或者需要其发挥未曾进化出的功能。例如，酶可能需要催化有新底物参与的反应；它们需要在盐、温度、pH等极端的条件下工作，或者在有潜在的抑制性或变性化学药品存在的情况下。已经发现，在这些应用中，酶作为工业催化剂具有极端的不稳定性。为了酶能够在试管试验以及工业反应器中都能够发挥最佳的性能，需要将生物催化剂进行修饰以使其适合特殊的应用。酶在商业上的成功可以归功于其灵活的应用。热稳定性酶除了可以在高温下发挥功能，通常还具有一种延长的保藏期，这显著地提高了其发挥作用的条件。要使酶能够在化学药品工艺中大规模应用，那么酶一定要能够忍受这些过程中所伴随的苛刻的条件。热稳定性酶是较容易操作的，并且持续时间较长，同时，如果提供合适的固定化支持的话，其可以适合多种应用。
为了得到热稳定性酶，传统的方法是对从嗜极端环境中收集到的微生物收集物进行筛选(Karsheroff和Ladenstein，2001)。进一步研究有希望的酶对特殊工艺的适应性。例如，为了需要对热及盐稳定的酶的应用，需要使用来自嗜热或者嗜盐生物的酶。然而，这种方法严重地限制了酶的应用，因为不能够在自然界中发现用于所有应用的酶。不可能有一种天然酶适应于多种转化。而且，酶的应用通常会被其不希望的性质所限制，例如产物抑制、低稳定性等。经常需要一种具有多种性质相结合的酶，而这不太可能在一种天然酶中得到。
另一种获得热稳定性酶的方法是基于目前关于来自嗜温菌和嗜热菌的同源酶的蛋白质结构(晶体结构)知识(Kumar等，2000；Lehmann等，1998)。这种比对得出了关于可能增强热稳定能力的相互作用的信息。利用这类信息，开展了一些工作来将这些变化与嗜温酶结合以提高它们的热稳定性。但这种方法并没有非常成功，因为与提高一种蛋白质热稳定性相关的相互作用有很多，而且每一种蛋白质需要经过进化的时间获得最适合它们的序列及其工作环境(mileu)的相互作用。尽管蛋白质稳定性的结构因素已经成为许多关于模式蛋白质的研究目标，但仍然没有发现普遍的稳定机制(Jaenicke和Bohm，1998)。能够从文献中得出的最明显的结论是不同的蛋白质已经通过一系列的进化机制适应了不同的温度环境。缺少对引起蛋白质热稳定性的结构特征的了解，部分上是由于数据的不足，这是因为关于对比来自嗜冷、嗜温和嗜热生物的同源蛋白的实验研究还仅限于几种蛋白质。而且，不能够形成用于提高蛋白质热稳定性的确定规律的原因是可能相关的因素的巨大数目及其复杂性(Jaenicke和Bohm，1998；Vogt等1997a；Vogt等，1997b；Ladenstein和Antranikain，1998)。基于对嗜温菌和嗜热菌的对比，提高热稳定性的主要机理确定为氢键和盐桥数目的增加、核心疏水性的提高、较好的包装效能、α-螺旋和环稳定性及其对共价破坏的抗性。通常，在其它如盐、pH值等筛选压力下描绘出有助于热稳定性的蛋白质相互作用是困难的。其它用来提高热稳定性的策略是基于对固定化酶会获得某些程度的热稳定性的观察(Reetz等，1995)。因此，尝试了几利固体支持物来固定蛋白质。同时，目前对在有机溶剂中的酶的观察显示在有机溶剂中的酶获得了热稳定性(Plou和Ballesteros，1999)。重组DNA技术通过采用容易进行蛋白质的突变和生产已经大大地推进了蛋白质工程。
术语“蛋白质热稳定性”是指一种多肽链在极端的温度条件下维持其特有的化学性质和空间结构的能力(Jaenicke和Bohm，1998)。通常，酶所暴露的温度越高，酶的半衰期越短(也就是酶保持其活性时间越短)。相似的，所述酶所暴露的有机溶液的水平越高，酶的半衰期越短。名词“催化活性”或者简单的称“活性”，是使一种给定的底物的kcat值降低或者KM值升高，结果反映在kcat/KM比率的增加。蛋白质热稳定的结构基础作为一种活跃追踪的研究领域已经持续至少二十年了(Argos等，1979)。然而，从活体移植出的酶并不总能够和它们在自然条件下一样发挥功能。例如，它们可以在生物的生理温度条件下有最佳活性，但在较高温度时会倾向变性，进而导致活性的下降。热稳定的酶是重要的，这样它们可以在工业环境中所需要的高温或者更苛刻的条件下使用。同时，通过避免低温保藏的需要以及减少保藏以及操作中的失活引起的损失，它们通常具有较高的保藏稳定性并可以降低成本。而且，在较高温度下进行的反应，其速率通常会比较高，从而进一步缩短操作时间。
因为环境安全的原因，保持恒定的压力以减少工业中造成环境污染的工艺的应用。酶越来越多地被用来代替皮革、食品以及制药工业中的化学工艺。来自嗜极端菌的蛋白质结构进行的对比证明蛋白结构的可塑性在一级结构中是大量的和固有的。这在很大程度上支持了通过改变蛋白质在基因水平上的一级结构然后筛选具有如热稳定性特殊性能的变异体的策略。基因操作和开发随意将其改变的方法所获得的巨大成功，已经使得进化出具有特殊功能的蛋白成为可能。这种策略依赖于通过分子生物学方法来产生基因序列上产生突变并通过表达变异体来对其进行筛选以及筛选突变群体(Arnold，1999；Stemmer，1994；Ostermeier等，1999)。筛选方法是基于感兴趣的性质，例如在高温下的活性或者在有机溶剂中的活性。本发明包含产生基因序列内变异的方法、筛选具有较高热稳定性的酶的方法，也包含测序和表达的方法。
脂酶(三酰基甘油酰基水解酶，E.C.3.1.1.3)是水溶性酶，其可以催化三酰基甘油的酯键的水解并经常表现出磷脂酶、角质酶和酰胺酶的活性(Woolley和Petersen，1994)。它们可以用来生产去污剂、药物、香水、香味增强剂以及化妆产品中的造型剂。脂酶对于多种食品的生产是非常重要的，特别是从牛奶、脂类和油类得到的产品。脂酶是普遍存在的，其具有很大的生理学意义和工业潜力。脂酶催化三酰基甘油水解为甘油和自由脂肪酸。与酯酶相比较，脂酶只有在被吸附到油水界面处才能被激活，其并不能水解在大量流体内溶解的底物。标准的脂酶可以切断甘油与长链脂肪酸的乳化酯类，例如三油酸甘油酯和三棕榈酸甘油酯。脂酶是丝氨酸水解酶。商业上有用的脂酶通常从是微生物中获得的，其生产了多种胞外脂酶(Jaeger等，1999)。许多脂酶在有机溶剂中是有活性的，其中它们催化许多有用的反应，包括酯化作用酯交换反应、乙二醇和薄荷醇的区域选择性酰化和肽的合成以及其它化学反应。可以获得越来越多具有适当性质的脂酶，同时也正在使以脂酶为基础的生物转化与合成成为商业化(Schmid和Verger，1998)。销售用于洗涤粉的酶仍然是工业用酶中单一的最大的市场。产生水解作用的脂酶的主要商业应用是它们在洗涤去污剂中的使用。去污剂酶占了全部脂酶销售的几乎32％。去污剂中使用的脂酶应该是热稳定的，同时应该在通常机洗的碱性环境中保持活性。每年估计有1000吨脂酶被加入到所生产的大约130亿吨的去污剂中。由于脂酶具有水解脂肪的能力，因此其有一个主要的作用是作为工业洗涤和家用去污剂的添加剂。特别选择去污剂脂酶以满足下面的要求(1)低底物特异性，也就是水解不同组合物的脂肪的能力；(2)耐受相对苛刻的洗涤条件的能力(pH值10-11，-60_C)；(3)耐受破坏性表面活性剂和酶[例如，线性烷基苯磺酸盐(LAS)和蛋白质酶]的能力，这些是许多去污剂配方的重要成分。具有所期望的性质的脂酶可以通过连续的筛选(Jaeger和Reez，1998；Wang等；Rubin和Dennis，1997)和蛋白质工程(Kazlauskas和Bornscheuer，1998)来获得。1994年，Novo Nordisk引入第一个商业重组脂酶“Lipolase”，其来源于真菌棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)，并在米曲霉菌(Aspergillusoryzae)中表达。1995年，Genencor International公司推出了两种细菌脂酶来自门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)的“Lumafast”以及来自类产碱假单胞菌(P.alcaligenes)的“Lipomax”(Jaeger等，1999)。根据一份报告，类产碱假单胞菌(P.alcaligenes)M-1生产的一种碱性脂酶也适合在现代机洗的条件下去除脂肪污渍。专利文献中也包含了许多据说适合用于去污剂的微生物脂酶的例子(Gerritse等，1998)。
生产脂酶的微生物包括细菌、真菌、酵母以及放线菌。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种革兰氏阳性、好氧、产孢子的细菌，其吸引了很大的商业兴趣，因为它具有高效的蛋白质分泌体系。尽管枯草芽孢杆菌的胞外分解脂肪活性早在1979年就被观察到了(Bycroft和Byng，1992)，但其分子研究1992年才开始，当时克隆并测序了一种脂肪酶lipA(Dartois等，1992)。接下来，对脂酶进行过表达、纯化，并对其进行特征描述(Leuisse等，1993)。后来，发现第二个基因lipB，其与lipA在核酸水平上有68％的同源性(Eggert等，2000)。也对这个基因进行过表达、纯化以及特征描述。
分子量为19,348的枯草芽孢杆菌脂酶(Bacillus subtilis)是已知最小的脂酶之一。它是为数不多的在油水界面不表现界面激活的脂酶之一。LipA对碱性pH值有很强的耐性，其在pH值10时有其最适宜的活性。其水解具有短链和长链脂肪酸的sn-1和sn-3甘油酯，对C8脂肪酸链表现出最适宜的活性。
根据细菌脂酶序列的相似性、保守的序列基元和生物学性质，可以将其分为8个家族(Arpigny和Jaeger，1999)。标准的脂酶被分在家族I，其中含有6个亚家族。芽孢杆菌脂酶被分在亚家族4和5。在这两个亚家族中，丙氨酸代替了活性位点丝氨酸残基周围的保守G-X-S-X-G五肽中的第一个甘氨酸。亚家族4只含有3个成员，来自枯草芽孢杆菌的LipA和LipB以及来自短小芽胞杆菌(Bacillus Pumilis)的脂酶，它们具有74-77％的同源性。这些是已知最小的脂酶，其与比其大得多的其它的组成亚家族5的芽孢杆菌脂酶只有很小的序列相似性(～15％)。
枯草芽孢杆菌脂酶LipA的晶体结构展示了一种具有35×36×42三维的球蛋白(Pouderoyen等，2001)。该结构显示出一种由在平行的β-折叠(β-sheet)内的6个β-股(β-strand)所组成的紧密结构域，该β-折叠被α-螺旋围绕。在β-折叠的一侧有2个α-螺旋，在另一侧有3个α-螺旋。枯草芽孢杆菌脂酶的折叠与α/β折叠水解酶的中心相类似。枯草芽孢杆菌脂酶缺少规范的α/β水解酶折叠的头两股，并且螺旋αD被一种小的310螺旋所代替。螺旋αE是非常小的，其只有一个螺旋转角，并且一些α-螺旋是以310螺旋转角开始或者结束。由于这些小尺寸以及缺少一种盖子结构域的结构特征，枯草芽孢杆菌脂酶被认为是一种最小的α/β折叠水解酶。
发明目的本发明的主要目的涉及新型热稳定、有机溶剂稳定以及pH值耐受性的脂酶基因变异体。
本发明的另一个目的涉及表达体系，其包括新型热稳定、有机溶剂稳定以及pH值耐受性的脂酶基因变异体。
本发明的另一个目的涉及表达体系的制备方法，所述体系包括新型热稳定、有机溶剂稳定以及pH值耐受性的脂酶基因变异体。
本发明的另一个目的涉及基因变异体，其中该基因具有抵抗10-11范围高pH值的内在能力；耐受破坏包含线性烷基苯磺酸盐、蛋白质酶及其化合物的表面活性剂和酶的能力。
本发明的再一目的涉及基因变异体，其中该基因变异体在家用去污剂和工业洗涤中作为去污剂。
本发明的另一目的涉及基因变异体，其中该基因变异体具有极强的高特殊活性。
图1在pBR322上的lipA基因。显示了含有整个脂酶基因及其信号序列、启动子和核糖体结合序列的lipA基因。
图2将带有信号序列的lipA亚克隆至pET 21b。用For1和Rev1引物扩增带有信号序列的lipA基因，然后插入到pET 21b上，得到pET-lipwt。设计For1和Rev1引物从而向LipA基因引入Nde 1和Bam H1位点。
图3将不带信号序列的lipA亚克隆至pJO290。使用引物PrEcoR1和PRBam HI扩增在pET-lipwt上的lipA基因，引物的特殊设计是为了向扩增产物引入EcoR 1和Bam H1位点图4纯化的蛋白在SDS-PAGE上的分布。通过在实施例中提供的步骤，将所有脂酶纯化。条带1，低分子量标记；条带2，野生型脂酶；条带3，基因序列2；条带4，基因序列3；条带5，基因序列4；条带6，基因序列5；条带7，基因序列6。
图5由脂酶催化的甘油三酯的水解。提供了脂酶对甘油三酯作用的示意图。脂酶作用于酯键并产生了自由脂肪酸和甘油。
图6各种突变体和野生型暴露在55℃下不同时间的残余活性。所使用的底物是PNPA。将野生型和突变型酶在55℃下孵育不同时间，将酶在冰上冷却几分钟后检测其活性。活性是在室温下检测的。活性以PNPA的水解速率表示。通过在分光计中410nm处吸收的增加来记录PNPA的水解。
图7以表格形式提供野生型和突变体暴露在55℃下的残余活性。孵育蛋白质一段特定的时间，将酶在冰上冷却后检测活性，活性检测实验是在室温下进行的。
图8各种突变体和野生型暴露在55℃下不同时间时的残余活性。所使用的底物是橄榄油。底物橄榄油是使用阿拉伯树胶乳化的。橄榄油在恒pH滴定仪(Metrohm 718 pH Titrino)上以每分钟加入0.1m氢氧化钠的速度来进行记录。橄榄油的水解会降低pH值，其可以通过氢氧化钠来中和。
图9野生型和突变型脂酶在55℃下动力学参数和半衰期稳定性。以残余活性对时间作图所得到图表的斜率代表了野生型和突变体的热稳定性。较低的斜率代表的是较长的半衰期，因此热稳定性有所提高。通过分析每种突变体相对底物浓度的细节活性来测量酶的常数。这些图表用来确定表观平衡常数和Vmax，也就是在底物浓度为无穷大时候的速率。Km/Vmax代表了酶的催化能力，这是在酶之间比较催化能力的有用参数。
图10脂酶及其突变体在不同浓度的乙腈存在时的活性。将野生型及突变体酶在含有不同浓度乙腈的介质中孵育。使用PNPA为底物测量在固定孵育时间30分钟的残余活性。
图11分析了野生型脂酶和突变体在20％乙腈中孵育蛋白质30分钟后的残余活性。
图12将野生型脂酶在不同浓度的三种去污剂存在的情况下孵育30分钟，并在30分钟后分析其活性。三种去污剂是中性去污剂Triton X-100、阴离子去污剂(十二烷基硫酸钠)和阳离子去污剂(十六烷基三甲基溴化铵)。发明的简要说明本发明涉及使用定点突变的方法所开发的新型脂酶基因变异体。这些基因变异体是高度热稳定、抵抗强有机溶剂并对高pH值有耐受性的。所开发的基因变异体在50℃-90℃的温度范围内具有200倍的热稳定性。由于所开发的基因具有高热稳定性、特异的能力和对高pH值的耐受性，可以应用于家用去污剂以及工业洗涤。
发明的详细说明在本发明中，对脂酶基因(基因Seq ID No.1)使用了定向进化的方法，从而分离具有增强的热稳定性能的原始序列的蛋白质变异体。这种方法最初依赖于在原始基因序列内产生随机变异体以及在细菌(E.coli)中表达相应的蛋白的能力。原始序列所产生的变异体会有改变的序列，进而改变性能。在蛋白质水平上，检测变异体的热稳定性，并将表现出增强的热稳定性的序列作为对象进行下一轮随机突变和筛选。这样，经过突变的连续积累以及随后的突变综合，脂酶在高温下的热稳定性提高了200倍。高温范围包括50℃-90℃的温度范围。
根据本发明的方法，在产生变异的脂酶及其特异性来获得热稳定性酶的过程中包括四个步骤。本方法的第一步中，通过易错PCR方法(error pronePCR)在脂酶基因原始序列内产生变异。所采用的方法与许多公开的方法相似。另外也可以使用许多不同的方法例如随机引物法、ITCHY等在基因序列内产生突变(Lutz和Benkovic，2000；Shao等，1998)。发明的第二步中，将突变序列克隆到一种表达载体并在培养物裂解液中表达蛋白质。筛选所表达蛋白质得到耐受较高温度能力，通过对大量蛋白质使用介质通量方法来测试。本发明的第三步中，根据Stemmer方法(1999)通过基因改组(shuffling)方法来综合有希望的变异体，并进一步测试其热稳定性。除了改组步骤外，还可以根据基本分子生物学步骤来对原始序列进行选择性改变。发明的第四步中，在大规模培养中过表达阳性序列并根据Dartois等(1992)发表的步骤来纯化蛋白质。检测所纯化蛋白质的热稳定性。
具有增强热稳定性的脂酶变异体的筛选步骤，涉及水解基于对硝基苯基(p-nitrophenyl)的发色底物酯类的能力。脂酶的天然底物是甘油三酯，其对于设计简单的介质来进行分析是不合适的，其中酶的来源是在细胞裂解物中过表达的脂酶(Besson等，2000)。脂肪酸的对硝基苯酯是合适的，脂酶的活性表示了脂酶对甘油三酯的活性。对硝基苯基的长链酯，特别是对硝基苯基油酸酯同样适用于这种目的。去污剂溶解的PNPO表现出微不足道的背景水解并很适合于在细胞裂解物中的脂酶。具有高消光系数的水解产物对硝基苯基的深黄色可以在96孔板中很容易的测定。同对硝基苯基酯类一样，许多其它发生荧光或者发色的脂肪酸酯也可以用来实现这个目的。
这里使用的术语热稳定性是指酶的性质，其在暴露于高温后仍然保持活性。当酶暴露在高温下时会由于结构元素增加的运动而丧失其三级构象，这会扰乱蛋白质的功能结构。通常，蛋白质在较高温度下一段时间会失去活性。这种失活的速率表现为半衰期，也就是失去原始活性一半时所需要的时间，这是比较蛋白质热稳定性的一个传统参数(Jaenicke和Bohm，1998)。这里所定义的活性，相应于术语kcat/Km所表示的催化活性，其中kcat是产物形成的速率，Km是底物与酶的表观亲合常数。在提高的温度下保持功能性结构归结于在蛋白质内部形成相互作用来抵抗高温的能力。本发明中适宜的温度范围是35℃-90℃。
来自芽胞杆菌脂酶的自然存在的脂酶具有序列SEQ ID No.1所提供的1-181的氨基酸序列。据发现，第68、71、114、120、132、144、147和166位的氨基酸取代对于脂酶的热稳定性是重要的。依照该发现，进一步发现了第114、132和166位的取代对于增强蛋白质的稳定性是适宜的。任何在每个这些位点用其它19个氨基酸可能取代的结合对于热稳定性都是有利的。
与脂酶热稳定性相关的特异取代如下所示
因此，本发明的主要实施方式涉及新型热稳定、有机溶剂抗性以及高pH值耐受性的脂酶基因变异体，其具有分子量为19443的SEQ ID No.2序列、分子量为19515的SEQ ID No.3序列、分子量为19456.9的SEQ ID No.4序列、分子量为19487的SEQ ID No.5序列和分子量为19470.9的SEQ ID No.6序列。
本发明的另一个实施方式涉及新型热稳定、有机溶剂抗性以及高pH值耐受性的脂酶基因变异体的表达体系，所述表达体系包含在载体pJO290上含有分子量为19443的SEQ ID No.2序列、分子量为19515的SEQ ID No.3序列、分子量为19456.9的SEQ ID No.4序列、分子量为19487的SEQ ID No.5序列和分子量为19470.9的SEQ ID No.6序列。
在本发明的另一个实施方式涉及新型热稳定、有机溶剂抗性以及高pH值耐受性的脂酶基因变异体的表达体系的制备方法，所述变异体具有分子量为19443的SEQ ID No.2序列、分子量为19515的SEQ ID No.3序列、分子量为19456.9的SEQ ID No.4序列、分子量为19487的SEQ ID No.5序列和分子量为19470.9的SEQ ID No.6序列，所述方法包括下列步骤(a)从枯草芽孢杆菌中分离纯化脂酶基因；(b)将步骤(a)中分离的脂酶基因克隆到载体pJO290；(c)通过随机突变以及使用序列为SEQ ID No.13的正向引物JOF和序列为SEQ ID No.14的反向引物JOR所进行定点突变，由步骤(a)中分离的脂酶基因生成基因变异体；(d)将步骤(c)中得到的基因变异体克隆到质粒载体pJO290上；(e)将步骤(d)中克隆的基因变异体连接到大肠杆菌JM109。
本发明的另一个实施方式涉及基因变异体，其中基因变异体在大约45℃～95℃的温度范围内是热稳定的。
本发明的另一个实施方式涉及基因变异体，其中基因变异体在大约55℃～90℃的温度范围内是高度热稳定的。
本发明的另一个实施方式涉及新基因变异体的T1/2值，其中T1/2值是在6～685的范围内。
本发明的另一个实施方式涉及新基因变异体的T1/2值，其中T1/2值是在7～677的范围内。
本发明的另一个实施方式涉及新基因变异体的Km值，其中Km值是在050～2.5mM的范围内。
本发明的另一个实施方式涉及新基因变异体的Km值，其中Km值是在0.63～1.96mM的范围内。
本发明的另一个实施方式涉及新基因变异体的kcat值，其中kcat值是在4.5×10-2～8.5×10-2min-1的范围内。
本发明的另一个实施方式涉及新基因变异体的kcat值，其中kcat值是在5×10-2～8.1×10-2min-1的范围内。
本发明的另一个实施方式涉及新基因变异体的kcat/Km值，其中kcat/Km值是在4×10-2～10×10-2min-1的范围内。
本发明的另一个实施方式涉及新基因变异体的kcat/Km值，其中kcat/Km值是在4.1×10-2～9.7×10-2min-1的范围内。
本发明的另一个实施方式涉及新基因在有机溶剂中的抗性，其中有机溶剂选自乙腈、异丙醇、二甲基亚砜和二甲基甲酰胺。
本发明的另一个实施方式涉及使用的有机溶剂，其中所使用的有机溶剂是乙腈。
本发明的另一个实施方式涉及基因变异体的残余活性，其中在乙腈存在情况下基因变异体的残余活性在25～100％范围内。
本发明的另一个实施方式涉及基因变异体的残余活性，其中在乙腈存在的情况下基因变异体的残余活性是在28.7～85.5％范围内。
本发明的另一个实施方式涉及基因变异体，其中基因变异体具有抵抗9～13范围内高pH值的固有能力，耐受破坏包含线性烷基苯磺酸盐(LAS)、蛋白质酶及其化合物的表面活性剂和酶的能力。
本发明的另一个实施方式涉及基因变异体，其中基因变异体具有抵抗10～11范围内高pH值的固有能力，耐受破坏包含线性烷基苯磺酸盐(LAS)、蛋白质酶及其化合物的表面活性剂和酶的能力。
以下实施例用于对本发明进行说明，因此并不用于限制本发明的范围。
实施例实施例1纯化来自枯草芽孢杆菌的脂酶纯化脂酶是通过表达在适当载体上脂酶的大肠杆菌进行的。纯化基本上包括将细胞裂解物通过苯基琼脂糖柱，接下来再通过Mono-S柱。脂酶是易凝聚的蛋白质，因此要特别保持蛋白质浓度在5mg/ml以下以避免蛋白质的凝聚。脂酶的纯化基本上按照之前所描述32进行，进行了很少的改动。来自芽孢杆菌培养过滤物的脂酶或者来自大肠杆菌裂解物的脂酶进行相似的处理。从大肠杆菌中纯化野生型和突变型蛋白质，将lipA基因或者突变体基因克隆到pET 21b。为此，用引物PrNde I(正向引物)(5′-CCATGATTACGCATATGGCTGAACACAA-3′)和JOF扩增相应于全长和成熟蛋白质的基因。正向引物具有改造的Nde I位点。正向引物还以ATG序列的形式在脂酶基因的开始引入了一个起始密码子，其中ATG序列是Nde I识别序列一部分。这使在大肠杆菌中表达的成熟蛋白质的N末端引入一个蛋氨酸，其位于从枯草芽孢杆菌培养上清液中纯化出的蛋白质的N末端出现的丙氨酸的前面。野生型蛋白质以及突变体进行扩增，用Nde I和BamH I消化，与用Nde I和BamH I消化的pET-21b连接。将连接混合物转入大肠杆菌DH5α并通过质粒微量制备和限制性消化来选择阳性产物(图1和图2)。
从大肠杆菌BL21(DE3)细胞中纯化蛋白质。在使用0.5mM IPTG诱导前，含有适宜的质粒的细胞生长到对数中期。诱导2.5小时后，在4℃下15,000转/分钟离心20分钟来收获细胞。使用STE清洗球状物，然后用含有0.3mg/ml溶菌酶的1×TE再次悬浮。将悬浮液在冰上孵育30分钟后通过超声裂解来溶解细胞。超声裂解是通过将细胞置于冰上而进行。使用半分钟周期的短时间脉冲，在两次脉冲之间冷却1分钟。将超声裂解的细胞在4℃下20,000rpm离心。将上清液装载到苯基琼脂糖柱。其余的步骤按照第二部分所描述的进行。纯化的蛋白在-70℃储藏直到以后使用。
将枯草芽孢杆菌BCL1051在21个厄伦美厄瓶(Erlenmeyer flask)中37℃下供氧培养16-18个小时，每个瓶中含有500ml下列组成的介质2.4％的酵母提取物、1.2％的膜化蛋白胨、0.4％的阿拉伯树胶、0.4％的甘油、0.017M的KH2PO4、0.072M的K2HPO4、50mg/ml的卡那霉素硫酸盐。使用10ml预培养物按1％的量为培养基接种。通过6000rpm(转/分钟)离心30分钟来收获细胞后，将培养物的上清液以30ml/小时的速度泵抽到苯基琼脂糖快速流动高层析柱(Phenyl Sepharose Fast Flow High sub column)(Pharmacia)上(每11瓶培养物使用20ml层析柱体积)，其使用100mM的磷酸钾(pH8.0)进行平衡。首先使用10mM的磷酸钾(pH8.0)以50ml/小时的流速将柱清洗，然后使用10mM磷酸钾中的30％乙二醇溶液。使用10mM磷酸钾(pH8.0)中80％乙二醇以50ml/小时的流速进行洗脱。收集2ml的组分，并检测含有蛋白质的组分(通过280nm处的吸收值来检测)的酶活性。将活性组分收集并用2mM甘氨酸-NaOH进行透析，pH为10.0。透析过的蛋白用1∶1的50mM的N-二(羟乙基)甘氨酸-NaOH(pH8.5)(缓冲液A)稀释，并使用在FPLC(Pharmacia)系统上的超容量杯，将其装载到被缓冲液A预平衡的MonoSHR5/5(Pharmacia)柱子上。使用缓冲液A将结合蛋白质的柱子完全洗一遍以除去未结合的蛋白质。使用缓冲液A到缓冲液B(二羟乙基甘氨酸-NaOH(pH8.5)、1MnaCl)的线性梯度来洗脱蛋白。在300mM NaCl周围洗脱的酶是单一色谱峰。将从MonoS柱洗脱的活性组分透析除去2mM甘氨酸(pHI0.0)并使用安装了YM10膜(阻断10kD)的Amicon浓缩器进行浓缩。在含有5M尿素的12％SDS-PAGE胶上检测蛋白质的纯度(Lessuisse等，1993)。考马斯(Coomassie)染色的胶上蛋白质的纯度＞95％(参看图4)。
实施例2脂酶测定脂酶属于一类已知为界面激活酶的酶。这些酶在底物单体上具有很少的活性，但对于不溶解的底物例如乳化的甘油三酯、单分子层等其活性会显著增加。这种性质使脂酶与其它作用于可溶的底物单体的酶不同。脂酶的天然底物甘油三酯不是很适合用来建立简单的发色检测。有时，可以通过使用对pH值敏感的染料来检测pH值的变化进而检测纯脂酶的活性。然而，当酶的来源是裂解物以及存在其它可能改变pH值的反应时，这种测定方法会产生一些复杂因素。对硝基苯基酯是最适合检测该活性的。可以按照常规的合成方法(在下而提供)来合成短链酯(对硝基苯基乙酸酯)和长链酯(对硝基苯基油酸酯)(PNPO)。PNPO是不溶性的酯类，在我们的检测中使用tritonX-100作为溶剂。Triton X-100PNOP的共微团表现出很低的背景水解并且在提高的温度下也是稳定的。在96孔板内进行筛选脂酶变异体的检测，尽管其对于筛选大量样品是有用的，但其只能对活性大概定量。通过试管检测对所有在96孔筛选中得到的阳性样品在试管检测中进一步确认，其中样品的数目较少并且可以得到更精确的特异性活性估算。
脂酶检测中发色底物的合成合成下列用于脂酶检测的发色底物1)对硝基苯基油酸酯；2)对硝基苯基硬脂酸酯；3)对硝基苯基辛酸酯。
将脂肪酸、N，N’-甲基四基双环六胺(二环己基碳化二亚胺，DCC)、N，N’-二甲胺吡啶(DMAP)以及对硝基苯酚按摩尔比1∶1∶1∶2使用。将脂肪酸置于含有20ml干燥的DCM和几毫升氯仿的圆底烧瓶中。将混合物搅拌两分钟后加入DCC。形成白色沉淀。接下来加入DMAP。连续加入对硝基苯酚后形成黄色沉淀。使用氮气冲洗反应容器并搅拌5小时。使用薄层层析来监控发应的进程。发应结束后，将DCM蒸发至干燥并使用柱色谱法(硅胶柱，使用石油醚-丙酮洗脱)纯化酯。使用1H-NMR光谱法来确认产物的纯度和单一性。
实施例396孔板微量滴定法检测脂酶克隆易错PCR产生的PCR产物所获得的克隆物修补到另一个类似平板上，同时接种在微量滴定板单独的孔中，该板含有200μl的具有25μg/ml氯霉素和0.2％葡萄糖的2XYT。在200rmp连续摇晃条件下细胞在微量滴定孔板中生长24小时。24小时后，取出来自每孔的5μl培养物并加入到另一微量滴定板的相应孔中，该板含有200μl 2XYT并补充25μg/ml氯霉素。生长3小时后，使用1mM的IPTG诱导培养物。再过3小时后，从每个孔中取出25μl的培养物加到两块新的微量滴定板相应的孔中，其含有25μl磷酸缓冲液，pH7.0。将其中一块板暴露于高温下20分钟后，在冰上冷却15分钟接着使其恢复到室温。另一块板保持在室温。准备25μl如上所述的PNPO-TritonX-100的底物溶液，并加入到每一个孔中。将板在37℃下孵育并在酶联免疫吸附读取仪(ELISA reader)上以确定的时间间隔来记录405nm处的吸光值。将活性低于野生型蛋白(或者其来源的亲代)活性20％的克隆排除不予考虑。计算每个克隆在暴露到高温后的残余活性。选择表现出最高活性的克隆以进行下一水平的筛选。
试管中检测脂酶将在微量滴定水平筛选上表现出最高残余活性的克隆在含有25μg/ml氯霉素以及0.2％葡萄糖的5ml 2XYT介质中生长12个小时。将10ml含有25μg/ml氯霉素以及0.2％葡萄糖的2XYT与100μl过夜生长的培养物一起孵育。生长2.5小时后，用1.5mM的IPTG诱导培养并再过2.5小时后收获细胞。使用STE洗细胞球状物后用1ml 0.05M的磷酸钾缓冲液(pH7.2)重新悬浮。使用Branson超声仪对细胞溶液进行4次30秒的脉冲以超声裂解细胞，在两次脉冲之间冷却1分钟。在超声裂解和冷却样品的过程中将式管置于冰上。将超声裂解的样品15,000rpm离心45分钟，并使用上清液来进行检测。将上清液分成4份250μ的等份。将等份中的3份暴露在更高的温度下，第4份保持在冰上。将试管暴露在高温下20分钟后，在冰上冷却，并在4℃下15,000rpm离心，然后在进行酶活检测前将其恢复到室温。室温下在磷酸钠缓冲液pH7.2中使用对硝基苯基油酸酯作为底物来确定细胞裂解物中脂酶活性。酶活性通过检测405nm处吸收值随时间的变化来计算。对不含有脂酶基因的细胞裂解物进行上述相同方法进行处理，使用这种细胞裂解物来确定对硝基苯基油酸酯在大肠杆菌裂解物内的背景水解。使用Lowry’s方法来确定细胞裂解物内的总蛋白质并用其使活性标准化。
实施例4热失活的半衰期将酶暴露在较高的温度下，并检测其在室温下的活性，这样就可以分析酶的热稳定性。在较高温度下，蛋白质变性和不可恢复地解折叠。热稳定的酶具有附加的使其稳定的相互作用，这使它们对热失活作用变得不太敏感。剩余的活性就是残余活性，其随着在暴露温度的增加和给定温度下暴露时间的增加而减少。纯化蛋白的热处理在可编程式热循环仪(GeneAmp PCR系统9700)的0.2ml薄壁PCR管中进行，可以对样品进行精确的温度控制。将蛋白质用0.05M磷酸钠缓冲液(pH7.0)配制成0.05mg/ml的浓度，每个管中放入25μl的蛋白质样品。进行酶活检测之前，将蛋白质加热需要的时间，在4℃冷却20分钟，离心并平衡到室温。将20μl热处理的蛋白质样品加入到1ml0.05M含有2mM对硝基苯基乙酸酯的磷酸钠(pH7.2)中。在25℃下通过检测405nm处吸收值的增长速率来确定酶活性。通常丧失80％以上的活性就会失活。Log(残余活性)对时间的图是线性的。失活率常数(kinact)可以由斜率而得到，按照t1/2＝log2/kinact计算半衰期。获得的各种突变体的半衰期在图中(图6和图7)绘出，其中残余活性是使用PNPA作为底物检测的。酶的突变体暴露在55℃。在图8中，描绘了使用橄榄油为底物测定的3种突变体的残余活性的数据。使用pH滴定仪测定活性。这个数据说明所观察到突变体的增强是不依赖底物和测试环境的。
底物储存物的制备在玻璃瓶称出适量的不溶性对硝基苯基酯和Triton X-100，并用磁性搅拌器混合直到酯完全溶解在Triton X-100中。在搅拌的过程中缓慢加入缓冲液以制备含有0.4mM对硝基苯基酯和40mM Triton X-100的2X储备溶液。这种方法制备的底物溶液看上去是清澈的。100X水溶性对硝基苯基乙酸酯的底物储备溶液在丙酮中制备，2mM对硝基苯基乙酸酯用于每个反应。反应是在没有Triton X-100情况下进行的，所有确定动力学参数的测试是在这种反应体系中完成的。
实施例5使用橄榄油的检测(使用脂酶降解脂肪/去污剂的示意图，图5)。
使用橄榄油的检测是在pH滴定仪上进行的。所有的脂酶随着它们的活性通过释放出质子而降低反应溶液的pH值。pH值的降低可以通过添加可知量的碱来中和。加入碱的速率也就反映了脂酶的活性。通过混合阿拉伯树胶(0.5％)、橄榄油和CaCl2来制备脂酶的底物。将混合物在水浴中进行超声处理以得到均一的乳液。每次检测使用10ml的底物。在检测的开始，通过加入碱来将底物的pH值调至8.4。加入10μl的1mg/ml的酶溶液来启动反应。通过所使用碱量对时间的曲线的斜率来计算反应的速率。所使用的碱是1N的NaOH。
实施例6在脂酶基因内产生变异的方法LipA序列，其产品是本发明所感兴趣的来自枯草芽孢杆菌的脂酶基因，已经被发表了。在芽孢杆菌中，由于在LipA基因的N末端的信号序列的存在，其可以辅助将其转运到细胞外，因此LipA基因产物被分泌到培养基中。已经对芽孢杆菌属的分子生物学进行了比较深入研究，其是一种革兰氏阳性菌。芽孢杆菌属不如大肠杆菌适合常规的分子生物学技术例如转化、克隆、表达等(Sambrook等，1989；Hoch等，1993)。主要的困难在于使用质粒转化芽孢杆菌。与大肠杆菌相比，其效率低了几个数量级。而且，所观察到的效率只有通过电激法才能检测到，而这是一种更为复杂的方法。大肠杆菌的转化效率要高并且是可再生的，质粒的选择范围也广。为了进行各种基因操作，使用大肠杆菌。
携带完整lipA基因的pBR322质粒克隆pLipA是Frens Pierce博士馈赠的(图1)。使用引物For1(正向引物)(5′-GGAGGATCATATGAAATTTGTAAAAA-3′)和Rev1(反向引物)(5′-CCCGGGATCCATTGTCCGTTACC-3′)扩增携带编码信号序列的区域的脂酶基因。两条引物具有分别构建的Nde 1和Bam H1位点。在For1上Nde 1位点的ATG与脂酶自然起始密码子一致，BamH 1在自然终止密码子的后面。使用Nde 1和Bam H1对扩增产物进行消化并克隆到质粒pET-21b的Nde I-BamHI位点中，以获得质粒pET-lipwt(图2)。使用引物PREcoR I(正向引物)(5’-CGTCAGCGAATTCCGCTGAACACAT-3′)和PRBamH I(反向引物)(5′-GCGGGAAGGATCCGAATTCGAGCT-3′)由pET-lipwt扩增编码成熟蛋白的脂酶基因。两条引物分别具有构建的EcoR I和BamH I位点。使用EcoR I和BamH I对扩增产物进行酶切并克隆到质粒pJO290的EcoR I-BamH I位点。使用构建物(pJO290lip)来筛选热稳定的突变体(图3)。除了特殊说明外，所有筛选步骤使用的都是大肠杆菌JM109菌株同时所有培养基都含有0.2％的葡萄糖。选择这个体系是因为其可以在大肠杆菌中得到低水平的、可控制的以及可诱导的基因产物的表达，这对于防止所报道的蛋白对大肠杆菌的毒性以及防止由于这种高疏水以及易凝聚蛋白质在体内的不可溶性引起的复杂因素是必要的。
随机突变的方法本发明的关键步骤是在基因内产生变异的能力。所产生的变异应该“足够”得到功能性的突变体。酶已经进化了数百万年，在这个过程中，酶可能测试并消除了许多有害的突变，同时也测试并引入了许多有益的突变。同时也相信大多数的基因突变是隐匿的，也就是说，它们没有带来氨基酸序列上的变化。随机突变的方法中，必须要获得基因序列的变异，其可以引起非隐匿的突变以及过量的变异，其中基因产物会是非功能性的或者可能不形成。需要优化以易错PCR为基础的突变方法，以得到脂酶活性的充分变异。定向进化方法的成功强烈依赖于对这种变异的控制。在本实施例中所使用的方法是对已经发表的方法的一些改进。
使用易错PCR对脂酶进行诱变(Cadwell and Joyce，1992)。使用引物JOF(5′-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3′)和JOR(5′-TGACACAGGAAACAGCTATGAC-3′)从质粒的EcoR I和BamH I位点的上游对基因进行扩增。在100μl的反应体系中进行易错PCR，其含有20毫微微摩尔(femtomoles)的pJ0290-lip质粒、引物JOF和JOR各50pmol、100mM的Tris.Cl(在25℃时pH8.3)、500mM KCl、0.1％的凝胶(w/v)、7mM MgCl2、dTTP和dCTP各1mM、dATP和dCTP各0.2mM以及5个单位的TaqDNA聚合酶。在经过94℃下3分钟的起始变性后，在热循环仪中重复下面的步骤30个循环94℃下1分钟、45℃下1分钟、72℃下1分钟。使用乙醇沉淀扩增产物，由1％的琼脂糖凝胶洗脱，使用EcoR I和BamH I进行消化。将消化后的产物再经过1％的琼脂糖凝胶洗脱，并与用EcoR I和BamH I消化过的pJO290连接。使用连接混和物转化到大肠杆菌JM109中，并在补充25μg/ml氯霉素和0.2％葡萄糖的LB琼脂上进行筛选。
定向突变通过一种改进PCR技术(Chen和Arnold，1991)对克隆在pET-21b上的脂酶基因进行定向突变。为了每一取代，使用包含希望的突变的寡核苷酸作为引物(错配引物)，以起始5′和3′PCR引物之间的链延伸。在第一PCR中，使用错配引物和3’引物以产生含有新碱基取代的DNA片断。使用琼脂糖凝胶电泳从模板和引物中分离片断，进行纯化，进而作为第二PCR的新3′引物，与5’引物一起产生全长的产物，其被克隆到pET-21b以表达突变蛋白质。
实施例7
第2代中获得的克隆的重组使用脂酶基因唯一限制性位点Hae III在910位上，由克隆2-8G10和野生型，获得突变基因序列5。使用T7启动子和终止子引物PCR扩增用于编码这两个蛋白的基因。通过胶提取纯化PCR产物，并用Hae II和Nde I进行消化。上方条带和下方条带分别对应于蛋白质的C-末端和N-末端区域。将来自克隆2-8G10的上方条带和来自野生蛋白质的下方条带进行洗脱。使用BamH I将较大分子量的片断进行消化，然后纯化。将包含Nde I-Hae II片断(来自野生型)、Hae-BamH I片断(来自2-8G10)和用Nde I和Hae II酶切的pET-21b的三点建立连接，将连接混和物转入DH5α并筛选阳性。通过DNA测序确认基因的序列。
通过对基因序列5模板进行定向突变得到基因序列6(三突变)，其使用诱导突变的引物PROLF5′-GGC AAG GCG CCT CCG GGA ACA GAT-3’，插入密码子改变CTT→CCT，其引起氨基酸序列的L114P改变。通过自动DNA测序确认所有基因的序列。
实施例8酶动力学以对硝基苯基乙酯为水溶性底物，使用自动调温分光光度仪进行所有动力学检测。在25℃下，磷酸钠缓冲液pH7.2中确定不同浓度对硝基苯基乙酯的起始水解速率。从相应的Lineweaver-Burke斜率得出KM值和kcaf值。图9中表示了野生型和突变型的动力学参数。
实施例9脂酶及其突变体在有机溶剂中的活性检测脂酶及其突变体在各种溶剂中的活性。所测试的有机溶剂是乙腈、异丙醇、二甲基亚砜和二甲基甲酰胺。使用PNPA为底物进行活性测试。底物(2mM)溶解在缓冲液(50mM，pH8.0)中各种浓度(v/v)的有机溶剂中，并通过加入0.246mg/ml的脂酶以启动反应。通过检测410nm处吸收的增加来检测活性，并根据曲线的起始斜率来计算其特异活性。图10和11中表明使用乙腈所得到的数据。
前面所述的实施例显示了本发明在产生、鉴定和分离脂酶的有效性，该脂酶与自然酶相比，在较高温度下有机介质中具有增强的稳定性和/或酯水解活性。
实施例10各种去污剂存在时野生型脂酶或对照脂酶的活性(图12)。
本发明已经描述了作为示范的实施方式，对于本领域技术人员的提示是，这里所公开的内容只是作为示范，各种其他替换、修改和变更都在本发明的范围内。因此，本发明并不限制于这里所列举的特殊实施方式。
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序列表<110>印度科学工业研究所<120>稳定的脂酶变异体<150>IN 075/DEL/2003<151>2003-01-30<160>26<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>181<212>PRT<213>枯草芽孢杆菌<400>1Met Ala Glu His Asn Pro Val Val Met Val His Gly Ile Gly Gly Ala1 5 10 15Ser Phe Asn Phe Ala Gly Ile Lys Ser Tyr Leu Val Ser Gln Gly Trp20 25 30Ser Arg Asp Lys Leu Tyr Ala Val Asp Phe Trp Asp Lys Thr Gly Thr35 40 45Asn Tyr Asn Asn Gly Pro Val Leu Ser Arg Phe Val Gln Lys Val Leu50 55 60Asp Glu Thr Gly Ala Lys Lys Val Asp Ile Val Ala His Ser Met Gly65 70 75 80Gly Ala Asn Thr Leu Tyr Tyr Ile Lys Asn Leu Asp Gly Gly Asn Lys85 90 95Val Ala Asn Val Val Thr Leu Gly Gly Ala Asn Arg Leu Thr Thr Gly100 105 110Lys Ala Leu Pro Gly Thr Asp Pro Asn Gln Lys Ile Leu Tyr Thr Ser115 120 125Ile Tyr Ser Ser Ala Asp Met Ile Val Met Asn Tyr Leu Ser Arg Leu130 135 140Asp Gly Ala Arg Asn Val Gln Ile His Gly Gly His Ile Gly Leu Leu145 150 155 160Tyr Ser Ser Gln Val Asn Ser Leu Ile Lys Glu Gly Leu Asn Gly Gly165 170 175Gly Gln Asn Thr Asn180<210>2<211>552<212>DNA<213>枯草芽孢杆菌<400>2atggctgaac acaatccagt cgttatggtt cacggtattg gaggggcatc attcaatttt60
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20 25 30Cys Gly Gly Thr Ala Thr Thr Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Cys Ala35 40 45Thr Cys Ala Thr Thr Cys Ala Ala Thr Thr Thr Thr Gly Cys Gly Gly50 55 60Gly Ala Ala Thr Thr Ala Ala Gly Ala Gly Cys Thr Ala Thr Cys Thr65 70 75 80Cys Gly Thr Ala Thr Cys Thr Cys Ala Gly Gly Gly Cys Thr Gly Gly85 90 95Thr Cys Gly Cys Gly Gly Gly Ala Cys Ala Ala Gly Cys Thr Gly Thr100 105 110Ala Thr Gly Cys Ala Gly Thr Thr Gly Ala Thr Thr Thr Thr Thr Gly115 120 125Gly Gly Ala Cys Ala Ala Gly Ala Cys Ala Gly Gly Cys Ala Cys Ala130 135 140Ala Ala Thr Thr Ala Thr Ala Ala Cys Ala Ala Thr Gly Gly Ala Cys145 150 155 160Cys Gly Gly Thr Ala Thr Thr Ala Thr Cys Ala Cys Gly Ala Thr Thr165 170 175Thr Gly Thr Gly Cys Ala Ala Ala Ala Gly Gly Thr Thr Thr Thr Ala180 185 190Gly Ala Thr Gly Ala Ala Ala Cys Gly Gly Gly Thr Gly Thr Gly Ala195 200 205Ala Ala Ala Ala Ala Gly Thr Gly Gly Ala Thr Ala Thr Thr Gly Thr210 215 220Cys Gly Cys Thr Cys Ala Cys Ala Gly Cys Ala Thr Gly Gly Gly Gly225 230 235 240Gly Gly Cys Gly Cys Gly Ala Ala Cys Ala Cys Ala Cys Thr Thr Thr245 250 255Ala Cys Thr Ala Cys Ala Thr Ala Ala Ala Ala Ala Ala Thr Cys Thr260 265 270Gly Gly Ala Cys Gly Gly Cys Gly Gly Ala Ala Ala Thr Ala Ala Ala275 280 285Gly Thr Thr Gly Cys Ala Ala Ala Cys Gly Thr Cys Gly Thr Gly Ala290 295 300Cys Gly Gly Thr Thr Gly Gly Cys Gly Gly Cys Gly Cys Gly Ala Ala305 310 315 320
Cys Cys Gly Thr Thr Thr Gly Ala Cys Gly Ala Cys Ala Gly Gly Cys325 330 335Ala Ala Gly Gly Cys Gly Cys Thr Thr Cys Cys Gly Gly Gly Ala Ala340 345 350Cys Ala Gly Ala Thr Cys Cys Ala Gly Ala Thr Cys Ala Ala Ala Ala355 360 365Gly Ala Thr Thr Thr Thr Ala Thr Ala Cys Ala Cys Ala Thr Cys Cys370 375 380Ala Thr Thr Thr Ala Cys Ala Gly Cys Ala Gly Thr Gly Ala Cys Gly385 390 395 400Ala Thr Ala Thr Gly Ala Thr Thr Gly Thr Cys Ala Thr Gly Ala Ala405 410 415Thr Thr Ala Cys Thr Thr Ala Thr Cys Ala Ala Gly Ala Thr Thr Ala420 425 430Gly Ala Thr Gly Gly Thr Gly Cys Thr Ala Gly Ala Ala Ala Cys Gly435 440 445Thr Thr Cys Ala Ala Ala Thr Cys Cys Ala Thr Gly Gly Cys Gly Thr450 455 460Thr Gly Gly Ala Cys Ala Cys Ala Thr Cys Gly Gly Cys Cys Thr Thr465 470 475 480Cys Thr Gly Thr Ala Cys Ala Gly Cys Ala Gly Cys Cys Ala Ala Gly485 490 495Thr Cys Thr Ala Cys Ala Gly Cys Cys Thr Gly Ala Thr Thr Ala Ala500 505 510Ala Gly Ala Ala Gly Gly Gly Cys Thr Gly Ala Ala Cys Gly Gly Cys515 520 525Gly Gly Gly Gly Gly Cys Cys Ala Gly Ala Ala Thr Ala Cys Gly Ala530 535 540Ala Thr Thr Ala Ala Thr Gly Ala545 550<2l0>23<211>181<212>PRT<213>人工序列<400>23Met Ala Glu His Asn Pro Val Val Met Val His Gly Ile Gly Gly Ala1 5 10 15Ser Phe Asn Phe Ala Gly Ile Lys Ser Tyr Leu Val Ser Gln Gly Trp20 25 30
Ser Arg Asp Lys Leu Tyr Ala Val Asp Phe Trp Asp Lys Thr Gly Thr35 40 45Asn Tyr Asn Asn Gly Pro Val Leu Ser Arg Phe Val Gln Lys Val Leu50 55 60Asp Glu Thr Gly Ala Lys Lys Val Asp Ile Val Ala His Ser Met Gly65 70 75 80Gly Ala Asn Thr Leu Tyr Tyr Ile Lys Asn Leu Asp Gly Gly Asn Lys85 90 95Val Ala Asn Val Val Thr Leu Gly Gly Ala Asn Arg Leu Thr Thr Gly100 105 110Lys Ala Pro Pro Gly Thr Asp Pro Asp Gln Lys Ile Leu Tyr Thr Ser115 120 125Ile Tyr Ser Ser Asp Asp Met Ile Val Met Asn Tyr Leu Ser Arg Leu130 135 140Asp Gly Ala Arg Asn Val Gln Ile His Gly Gly His Ile Gly Leu Leu145 150 155 160Tyr Ser Ser Gln Val Tyr Ser Leu Ile Lys Glu Gly Leu Asn Gly Gly165 170 175Gly Gln Asn Thr Asn180<210>24<211>552<212>DNA<213>人工序列<400>24atggctgaac acaatccagt cgttatggtt cacggtattg gaggggcatc attcaatttt 60gcgggaatta agagctatct cgtatctcag ggctggtcgc gggacaagct gtatgcagtt 120gatttttggg acaagacagg cacaaattat aacaatggac cggtattatc acgatttgtg 180caaaaggttt tagatgaaac gggtgcgaaa aaagtggata ttgtcgctca cagcatgggg 240ggcgcgaaca cactttacta cataaaaaat ctggacggcg gaaataaagt tgcaaacgtc 300gtgacggttg gcggcgcgaa ccgtttgacg acaggcaagg cgccctccgg gaacagatcc 360agatcaaaag attttataca catccattta cagcagtgac gatatgattg tcatgaatta 420cttatcaaga ttagatggtg ctagaaacgt tcaaatccat ggcgttggac acatcggcct 480tctgtacagc agccaagtct acagcctgat taaagaaggg ctgaacggcg ggggccagaa 540tacgaattaa tga 553<210>25<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>25cgccagggtt ttcccagtca cgac 24
<210>26<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>26tgacacagga aacagctatg ac 2权利要求
1.新型热稳定、有机溶剂抗性以及pH值耐受性的脂酶基因变异体，其具有分子量为19443的SEQ ID No.2序列、分子量为19515的SEQ ID No.3序列、分子量为19456.9的SEQ ID No.4序列、分子量为19487的SEQ ID No.5序列和分子量为19470.9的SEQ ID No.6序列。
2.权利要求1中所述的新型基因变异体，其中所述基因变异体在45℃～95℃的温度范围内是热稳定的。
3.权利要求2中所述的新型基因变异体，其中所述基因变异体在55℃～90℃的温度范围内是高热稳定的。
4.权利要求1中所述的新型基因变异体，其中T1/2值是在6～685的范围内。
5.权利要求1中所述的新型基因变异体，其中T1/2值是在7～677的范围内。
6.权利要求1中所述的新型基因变异体，其中Km值是在0.50～2.5mM的范围内。
7.权利要求1中所述的新型基因变异体，其中Km值是在0.63～1.96mM的范围内。
8.权利要求1中所述的新型基因变异体，其中kcat值是在4.5×10-2～8.5×10-2min-1的范围内。
9.权利要求1中所述的新型基因变异体，其中kcat值是在5×10-2～8.1×10-2min-1的范围内。
10.权利要求1中所述的新型基因变异体，其中kcat/Km值是在4×10-2～10×10-2min-1的范围内。
11.权利要求1中所述的新型基因变异体，其中kcat/Km值是在4.1×10-2～9.7×10-2min-1的范围内。
12.权利要求1中所述的新型基因变异体，其中所述基因变异体对选自乙腈、异丙醇、二甲基亚砜和二甲基甲酰胺的有机溶剂具有抗性。
13.权利要求4中所述的新型基因变异体，其中所使用的有机溶剂是乙腈。
14.权利要求1中所述的新型基因变异体，其中所述基因变异体的残余活性在乙腈存在下是在25～100％范围内。
15.权利要求1中所述的新型基因变异体，其中所述基因变异体的残余活性在乙腈存在下是在28.7～85.5％范围内。
16.权利要求1中所述的新型基因变异体，其中所述基因变异体具有耐受9～13范围内高pH值的固有能力；耐受破坏包括线性烷基苯磺酸盐(LAS)、蛋白质酶及其化合物的表面活性剂和酶的能力。
17.权利要求16中所述的新型基因变异体，其中所述基因变异体具有耐受9～13范围内高pH值的固有能力；耐受包含破坏线性烷基苯磺酸盐(LAS)、蛋白质酶及其化合物的表面活性剂和酶的能力。
18.一种新型热稳定、有机溶剂抗性以及pH值耐受性的脂酶基因变异体的表达体系，其包括在载体pJO290上的分子量为19443的SEQ ID No.2序列、分子量为19515的SEQ ID No.3序列、分子量为19456.9的SEQ ID No.4序列、分子量为19487的SEQ ID No.5序列和分子量为19470.9的SEQ ID No.6序列。
19.权利要求18中所述的表达体系，其中所述基因变异体在45℃～95℃的温度范围内是热稳定的。
20.权利要求19中所述的表达体系，其中所述基因变异体在55℃～90℃的温度范围内是高热稳定的。
21.权利要求18中所述的表达体系，其中T1/2值是在6～685的范围内。
22.权利要求21中所述的表达体系，其中T1/2值是在7～677的范围内。
23.权利要求18中所述的表达体系，其中Km值是在0.50～2.5mM的范围内。
24.权利要求23中所述的表达体系，其中Km值是在0.63～1.96mM的范围内。
25.权利要求18中所述的表达体系，其中kcat值是在4.5×10-2～8.5×10-2min-1的范围内。
26.权利要求25中所述的表达体系，其中kcat值是在5×10-2～8.1×10-2min-1的范围内。
27.权利要求18中所述的表达体系，其中kcat/Km值是在4×10-2～10×10-2min-1的范围内。
28.权利要求27中所述的表达体系，其中kcat/Km值是在4.1×10-2～9.7×10-2min-1的范围内。
29.权利要求18中所述的表达体系，其中所述基因变异体对选自乙腈、异丙醇、二甲基亚砜和二甲基甲酰胺的有机溶剂具有抗性。
30.权利要求29中所述的表达体系，其中所使用的有机溶剂是乙腈。
31.权利要求18中所述的新型基因变异体，其中所述基因变异体的残余活性在乙腈存在下是在25～100％范围内。
32.权利要求31中所述的新型基因变异体，其中所述基因变异体的残余活性在乙腈存在下是在28.7～85.5％范围内。
33.权利要求18中所述的新型基因变异体，其中所述基因变异体具有耐受9～13范围内高pH值的固有能力；耐受破坏包括线性烷基苯磺酸盐(LAS)、蛋白质酶及其化合物的表面活性剂和酶的能力。
34.权利要求33中所述的新型基因变异体，其中所述基因变异体具有耐受9～13范围内高pH值的固有能力；耐受破坏包含线性烷基苯磺酸盐(LAS)、蛋白质酶及其化合物的表面活性剂和酶的能力。
35.一种新型热稳定、有机溶剂抗性以及pH值耐受性的脂酶基因变异体的表达体系的制备方法，所述基因变异体包括分子量为19443的SEQ ID No.2序列、分子量为19515的SEQ ID No.3序列、分子量为19456.9的SEQ IDNo.4序列、分子量为19487的SEQ ID No.5序列和分子量为19470.9的SEQ ID No.6序列，所述方法包括下列步骤(a)从枯草芽孢杆菌中分离和纯化脂酶基因；(b)将步骤(a)中分离的脂酶基因克隆到载体pJO290；(c)通过随机突变以及使用带有序列SEQ ID No.13的正向引物JOF和带有序列SEQ ID No.14的反向引物JOR进行的定向突变，由步骤(a)中分离的脂酶基因产生基因变异体；(d)将步骤(c)中得到的基因变异体克隆到质粒载体pJO290上；(e)将步骤(d)中得到的克隆的基因变异体连接到大肠杆菌JM109。
36.权利要求35中所述的方法，其中所述基因变异体在45℃～95℃的温度范围内是热稳定的。
37.权利要求36中所述的方法，其中所述基因变异体在55℃～90℃的温度范围内是高热稳定的。
38.权利要求35中所述的方法，其中T1/2值是在6～685的范围内。
39.权利要求38中所述的方法，其中T1/2值是在7～677的范围内。
40.权利要求35中所述的方法，其中Km值是在0.50～2.5mM的范围内。
41.权利要求40中所述的方法，其中Km值是在0.63～1.96mM的范围内。
42.权利要求35中所述的方法，其中kcat值是在4.5×10-2～8.5×10-2min-1的范围内。
43.权利要求42中所述的方法，其中kcat值是在5×10-2～8.1×10-2min-1的范围内。
44.权利要求35中所述的方法，其中kcat/Km值是在4×10-2～10×10-2min-1的范围内。
45.权利要求44中所述的方法，其中kcat/Km值是在4.1×10-2～9.7×10-2min-1的范围内。
46.权利要求35中所述的方法，其中所述基因变异体对选自乙腈、异丙醇、二甲基亚砜和二甲基甲酰胺的有机溶剂具有抗性。
47.权利要求46中所述的方法，其中所使用的有机溶剂是乙腈。
48.权利要求35中所述的方法，其中所述基因变异体的残余活性在乙腈存在下是在25～100％范围内。
49.权利要求48中所述的方法，其中所述基因变异体的残余活性在乙腈存在下是在28.7～85.5％范围内。
50.权利要求35中所述的方法，其中所述基因变异体具有耐受9～13范围内高pH值的固有能力；耐受的能力。
51.破坏包含线性烷基苯磺酸盐(LAS)、蛋白质酶及其化合物的表面活性剂和酶的能力。
52.权利要求50中所述的方法，其中所述基因变异体具有耐受9～13范围内高pH值的固有能力；耐受破坏包含线性烷基苯磺酸盐(LAS)、蛋白质酶及其化合物的表面活性剂和酶的能力。
全文摘要
本发明涉及新型热稳定、有机溶剂抗性以及pH值耐受性的脂酶基因变异体的产生和制备。本发明还涉及筛选用于高温的脂酶变异体及其纯化的方法。
文档编号C12N5/00GK1768135SQ200480008757
公开日2006年5月3日 申请日期2004年1月29日 优先权日2003年1月30日
发明者那拉姆·马德胡苏德哈那·劳, 皮亚姆瓦达·阿恰尔雅 申请人:印度科学工业研究所