专利名称：一种猪皮本体高效纯化的方法
技术领域：
本发明涉及一种猪皮本体高效纯化的方法，属于生物医学材料的制备领域。
背景技术：
近些年来，随着科学技术的不断发展和进步，生物医学材料也得到了前所未有的发展，胶原在生物医学材料中的应用日渐广泛。
胶原广泛地存在于哺乳动物的骨、腱、软骨和皮肤及其它结缔组织中，约占哺乳动物蛋白总量的1/3，是构成人体重要的细胞外基质成分。胶原具有较好的生物相容性，较弱的抗原性，且亲水性好，对细胞的吸附作用强。由于它本身就是一种细胞外基质成分，还兼具诱导细胞增殖和分化的作用。因此，长期以来，人们利用胶原的性能特点，研究开发系列胶原基生物医学材料，如生物敷料、人工皮肤、生物医用膜、止血海绵、脱细胞真皮基质材料、可注射胶原溶液、胶原基复合医用纤维以及组织工程支架材料等等，部分胶原基生物医学材料已应用于临床，并被证明具有一定的疗效(但卫华，王坤余，曾睿，等.胶原的医学应用及其发展前景.生物医学工程与临床.2004，8(1)45-48)。
胶原是世界上资源存量最大的可再生动物生物质资源，来源广泛、价廉易得，具有很高的医学利用价值。令人遗憾的是，胶原在医学应用方面，由于胶原基生物医学材料的生物相容性在制造过程中难于控制，导致材料在使用过程中常常出现可靠性和安全性的问题。出现这些问题的根本原因就是由于所使用的胶原蛋白的纯度达不到要求。
根据我们的研究，解决胶原基生物医学材料的生物相容性的关键是提高胶原蛋白的纯度，尽量地清除原料中的非胶原成分和小分子物质；在纯化提取的过程中，既要确保胶原的生物活性，又要切除全部端肽。现有技术往往忽略了这些关键问题，有的技术是使用氯化钠溶液除去原料中的非胶原成分，再进行提纯(傅燕凤，沈月新，杨承刚，等.淡水鱼鱼皮胶原蛋白的提取.上海水产大学学报.2004，13(6)146-150)；有的技术则是进行一些简单的预处理就进行提取(李开雄，赵志远，刘霞.猪皮中胶原蛋白的提取及应用.肉类研究.1996，443-48)；从总体上来看，已有技术侧重于胶原提取的居多，而对胶原的本体纯化考虑甚少(胡胜，李志强，陈敏.皮胶原蛋白的酶法提取及在高附加值领域的应用.皮革科学与工程.2002，12(5)38-42)。
综上所述，现有技术存在以下不足1.以资源相对有限的牛腱、鼠尾腱为原料提取胶原蛋白，忽略了原料的选择及其纯化对于制备医用胶原蛋白的重要性；2.以牛腱为原料提取胶原蛋白，存在携带疯牛病病毒的风险；3.以猪皮、鱼皮等提取胶原蛋白，工艺过于简单，无法达到纯化的目的。
发明内容
本发明的目的是针对已有技术存在的不足而提供一种猪皮本体高效纯化的方法，其特点是以价廉易得的猪皮为原料，制备具有医学利用价值的纯化猪皮。
猪皮本体纯化的方法包括以下步骤(1)清洗选取健康的新鲜猪皮100重量份装入转鼓中，加水调节液比2.0-4.0，转动60-180min，控干废液，再加水调节液比2.0-4.0，加入氯化钠1.0-8.0重量份，转动60-180min，控干废液，然后充分水洗；(2)脱脂清洗完毕，加入40-45℃的热水调节液比1.0-4.0，鼓内温度为32-38℃，加入平平加0.1-1.0重量份，纯碱0.5-2.0重量份，渗透剂JFC 0.1-0.6重量份，转动60-120min，控干废液，加入温度为28-38℃的热水，使液比达到2.0-5.0，转动60-120min，控干废液，再加入28-38℃的热水，使液比达到2.0-5.0，转动60-150min，控干废液，加入40-45℃的热水调节液比2.0-5.0，鼓内温度为32-38℃，加入平平加0.3-0.8重量份，脱脂剂9088 2.0-5.0重量份，渗透剂JFC 0.2-0.8重量份，洗衣粉2.0-4.0重量份，2.1203脂肪酶0.3-0.6重量份，转动60-150min，控干废液，加入温度为30-35℃的热水，使液比达到3.0-5.0，转动60-150min，控干废液。再加入30-35℃的热水，使液比达到4.0-6.0，转动60-150min，控干废液；(3)浸酶加入40-45℃的热水调节液比0.5-1.2，鼓内温度为32-40℃，加入5万单位的166中性蛋白酶0.8-4.0重量份，5万单位的AS1.398蛋白酶0.3-2.0重量份，硫酸铵0.2-0.8重量份，平平加0.3-0.8重量份，间歇转动3min/30min，共转动3-10次，总时间90-300min，然后，控干废液，加入氯化钠3.0-8.0重量份，转动30-90min，将皮出鼓，在温度为25-32℃的温室内整齐堆置，堆置总时间24-72h；(4)去毛、清洗采用机器对猪皮进行去毛后，将猪皮装入转鼓中，加水调节液比2.0-5.0，转动60-180min，控干废液，加水至液比为2.0-5.0，转动60-180min，控干废液，反复操作3次，加入氯化钠2.0-5.0重量份，加水调节液比为2.0-5.0，转动60-180min，控干废液，加水调节液比为2.0-5.0，转动60-180min，控干废液，反复操作3次，然后，充分水洗，控干废液；(5)膨胀去毛、清洗后，加水调节液比1.5-4.0，加入30wt％的液碱3.0-6.0重量份，渗透剂JFC 0.3-0.8重量份，转动90-180min，流水洗30min；(6)脱碱、酶消化加入40-45℃的热水调节液比1.5-2.0，鼓内温度为30-32℃，加入硫酸0.1-0.3重量份，氯化铵或硫酸铵1.5-3.0重量份，平平加0.2-0.6重量份，转动90-180min，再加入5万单位的AS1.398中性蛋白酶0.1-0.8重量份、活力为1∶25的工业胰酶0.1-0.6重量份，转动120-240min，控干废液；(7)清洗加水调节液比2.0-5.0，加入氯化钠2.0-5.0重量份，转动90-180min，控干废液，加水调节液比2.0-5.0，转动90-180min，控干废液，按上述方法重复操作3次，然后，充分水洗，控干废液，获得纯化猪皮；(8)滚盐加入氯化钠3.0-12.0重量份，转动30-90min，出鼓；(9)分割首先将纯化猪皮裁成矩形，然后再分割成10.0-30.0cm×10.0-30.0cm的小块矩形；(10)装袋、冷冻保存将装袋的纯化猪皮放入冻库，在温度-5--15℃的条件下冷冻保存。
转鼓为悬挂式木制转鼓或不锈钢转鼓。
本发明所得到的纯化猪皮具有以下性能1.外观白色片状物，无肉眼所见之杂质；2.蛋白质含量＞95％；3.水分60-70％；4.重金属含量＜10μg/g(m/m)。
本发明的方法处理得到的纯化猪皮，用于提取制备医用胶原蛋白、制备组织工程支架材料和制备修复与重建材料。
本发明具有以下优点1.以价廉易得、来源广泛的猪皮为原料，制备纯化猪皮，既降低了材料成本，又避免了使用牛腱、鼠尾腱所存在的种种不足；2.方法简单，工艺条件不苛刻，容易满足；3.工艺规范，条件可控，易于工业化生产；4.实现了猪皮的高效纯化，纯化猪皮不仅可以作为提取制备医用胶原蛋白的原料，而且还适合其他多种医学用途；5.本方法也能用于其它动物皮的本体高效纯化；6.生产过程无污染，具有显著的环境效益和经济效益。
具体实施例方式
下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是，本实施例只用于对本发明进行进一步说明，而不能理解为对本发明的保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据本发明的内容作出一些非本质的改进和调整。
实施例11.清洗选取健康的新鲜猪皮100重量份装入转鼓中，加水调节液比2.0，转动60min，控干废液，再加水调节液比2.0，加入氯化钠1.0重量份，转动60min，控干废液，然后充分水洗；2.脱脂清洗完毕，加入40-45℃的热水调节液比1.0，鼓内温度为32℃，加入平平加0.1重量份，纯碱0.5重量份，渗透剂JFC 0.1重量份，转动60min。控干废液，加入温度为28℃的热水，使液比达到2.0，转动60min，控干废液，再加入28℃的热水，使液比达到2.0，转动60min，控干废液，加入40-45℃的热水调节液比2.0，鼓内温度为32℃，加入平平加0.3重量份，脱脂剂9088 2.0重量份，渗透剂JFC 0.2重量份，洗衣粉2.0重量份，4万单位的2.1203脂肪酶0.3重量份，转动60min，控干废液，加入温度为30℃的热水，使液比达到3.0，转动60min，控干废液。再加入30℃的热水，使液比达到4.0，转动60min，控干废液；3.浸酶加入40-45℃的热水调节液比0.5，鼓内温度为32℃，加入5万单位的166中性蛋白酶0.8重量份，5万单位的AS1.398蛋白酶0.3重量份，硫酸铵0.2重量份，平平加0.3重量份，间歇转动3min/30min，共转动3次，总时间90min，然后，控干废液，加入氯化钠3.0重量份，转动30min，将皮出鼓，在温度为25℃的温室内整齐堆置，堆置总时间24h；4.去毛、清洗采用机器对猪皮进行去毛后，将猪皮装入转鼓中，加水使液比达到2.0，转动60min，控干废液，加水至液比为2.0，转动60min，控干废液，反复操作3次，加入氯化钠2.0重量份，加水调节液比2.0，转动60min，控干废液，加水调节液比2.0，转动60min，控干废液，反复操作3次，然后，充分水洗，控干废液；5.膨胀去毛、清洗后，加水调节液比1.5，加入30wt％的液碱3.0重量份，渗透剂JFC 0.3重量份，转动90min，流水洗30min；6.脱碱、酶消化加入40-45℃的热水调节液比为1.5，鼓内温度为30℃，加入硫酸0.1重量份，氯化铵或硫酸铵1.5重量份，平平加0.2重量份，转动90min。再加入5万单位的AS1.398中性蛋白酶0.1重量份、活力为1∶25的工业胰酶0.1重量份，转动120min，控干废液；7.清洗加水调节液比为2.0，加入氯化钠2.0重量份，转动90min，控干废液，加水调节液比为2.0，转动90min，控干废液，按上述方法重复操作3次，然后，充分水洗，控干废液，获得纯化猪皮；8.滚盐加入氯化钠3.0重量份，转动30min，出鼓；9.分割首先将纯化猪皮裁成矩形，然后再分割成10.0-30.0cm×10.0-30.0cm的小块矩形；10.装袋、冷冻保存将装袋的纯化猪皮放入冻库，在温度为-5℃的条件下冷冻保存。
实施例21.清洗选取健康的新鲜猪皮100重量份装入转鼓中，加水调节液比3.0，转动120min，控干废液，再加水调节液比3.0，加入氯化钠4.5重量份，转动120min，控干废液，然后充分水洗；2.脱脂清洗完毕，加入40-45℃的热水调节液比2.5，鼓内温度为36℃，加入平平加0.5重量份，纯碱1.2重量份，渗透剂JFC 0.4重量份，转动90min。控干废液，加入温度为33℃的热水，使液比达到3.5，转动90min，控干废液，再加入33℃的热水，使液比达到3.5，转动110min，控干废液，调节液比3.5，鼓内温度为35℃，加入平平加0.5重量份，脱脂剂9088 3.5重量份，渗透剂JFC 0.5重量份，洗衣粉3.0重量份，4万单位的2.1203脂肪酶0.5重量份，转动110min，控干废液，加入温度为32℃的热水，使液比达到4.0，转动110min，控干废液。再加入32℃的热水，使液比达到5.0，转动110min，控干废液；3.浸酶加入40-45℃的热水调节液比0.8，鼓内温度为36℃，加入5万单位的166中性蛋白酶2.4重量份，5万单位的AS1.398蛋白酶1.2重量份，硫酸铵0.5重量份，平平加0.5重量份，间歇转动3min/30min，共转动6次，总时间180min，然后，控干废液，加入氯化钠6重量份，转动60min，将皮出鼓，在温度为29℃的温室内整齐堆置，堆置总时间48h；4.去毛、清洗采用机器对猪皮进行去毛后，将猪皮装入转鼓中，加水使液比达到3.5，转动120min，控干废液，加水调节液比3.5，转动120min，控干废液，反复操作3次，加入氯化钠3.5重量份，加水调节液比3.5，转动120min，控干废液，加水调节液比为3.5，转动120min，控干废液，反复操作3次，然后，充分水洗，控干废液；5.膨胀去毛、清洗后，加水调节液比2.6，加入30wt％的液碱4.5重量份，渗透剂JFC 0.5重量份，转动130min，流水洗30min；6.脱碱、酶消化加入40-45℃的热水调节液比为1.8，鼓内温度为31℃，加入硫酸0.2重量份，氯化铵或硫酸铵2.2重量份，平平加0.4重量份，转动130min。再加入5万单位的AS1.398中性蛋白酶0.45重量份、活力为1∶25的工业胰酶0.35重量份，转动180min，控干废液；7.清洗加水调节液比为3.5，加入氯化钠3.5重量份，转动135min，控干废液，加水调节液比为3.5，转动135min，控干废液，按上述方法重复操作3次，然后，充分水洗，控干废液，获得纯化猪皮；8.滚盐加入氯化钠7.5重量份，转动60min，出鼓；9.分割首先将纯化猪皮裁成矩形，然后再分割成10.0-30.0cm×10.0-30.0cm的小块矩形；10.装袋、冷冻保存将装袋的纯化猪皮放入冻库，在温度为-7.5℃的条件下冷冻保存。
实施例3
1.清洗选取健康的新鲜猪皮100重量份装入转鼓中，加水调节液比4.0，转动180min，控干废液，再加水调节液比4.0，加入氯化钠8.0重量份，转动180min，控干废液，然后充分水洗；2.脱脂清洗完毕，加入40-45℃热水调节液比4.0，鼓内温度为38℃，加入平平加1.0重量份，纯碱2.0重量份，渗透剂JFC 0.6重量份，转动120min。控干废液，加入温度为38℃的热水，使液比达到5.0，转动120min，控干废液，再加入38℃的热水，使液比达到5.0，转动150min，控干废液，调液比5.0，鼓内温度为38℃，加入平平加0.8重量份，脱脂剂9088 5.0重量份，渗透剂JFC0.8重量份，洗衣粉4.0重量份，4万单位的2.1203脂肪酶0.6重量份，转动150min，控干废液，加入温度为35℃的热水，使液比达到5.0，转动150min，控干废液。再加入35℃的热水，使液比达到6.0，转动150min，控干废液；3.浸酶加入40-45℃的热水调节液比1.2，鼓内温度为40℃，加入5万单位的166中性蛋白酶4.0重量份，5万单位的AS1.398蛋白酶2.0重量份，硫酸铵0.8重量份，平平加0.8重量份，间歇转动3min/30min，共转动10次，总时间300min，然后，控干废液，加入氯化钠8.0重量份，转动90min，将皮出鼓，在温度为32℃的温室内整齐堆置，堆置总时间72h；4.去毛、清洗采用机器对猪皮进行去毛后，将猪皮装入转鼓中，加水使液比达到5.0，转动180min，控干废液，加水调节液比为5.0，转动180min，控干废液，反复操作3次，加入氯化钠5.0重量份，加水调节液比5.0，转动180min，控干废液，加水调节液比5.0，转动180min，控干废液，反复操作3次，然后，充分水洗，控干废液；5.膨胀去毛、清洗后，加水调节液比4.0，加入30wt％的液碱6.0重量份，渗透剂JFC 0.8重量份，转动180min，流水洗30min；6.脱碱、酶消化加入40-45℃的热水调节液比为2.0，鼓内温度为32℃，加入硫酸0.3重量份，氯化铵或硫酸铵3.0重量份，平平加0.6重量份，转动180min。再加入5万单位的AS1.398中性蛋白酶0.8重量份、活力为1∶25的工业胰酶0.6重量份，转动240min，控干废液；7.清洗加水调节液比为5.0，加入氯化钠5.0重量份，转动180min，控干废液，加水调节液比为5.0，转动180min，控干废液，按上述方法重复操作3次，然后，充分水洗，控干废液，获得纯化猪皮；8.滚盐加入氯化钠12.0重量份，转动90min，出鼓；9.分割首先将纯化猪皮裁成矩形，然后再分割成10.0-30.0cm×10.0-30.0cm的小块矩形；10.装袋、冷冻保存将装袋的纯化猪皮放入冻库，在温度为-15℃的条件下冷冻保存。
注本发明所用的渗透剂JFC、平平加为上海助剂厂生产，脱脂剂9088为杭州永固化工厂生产，4万单位的2.1203脂肪酶和5万单位的166中性蛋白酶为上海酒精厂生产，活力为1∶25的工业胰酶为温江东方酶制剂厂生产，AS1.398蛋白酶为云南陆良酶制剂有限责任公司生产，其余的化学试剂均为市场购买。
权利要求
1.一种猪皮本体高效纯化的方法，其特征在于该纯化方法含有以下步骤(1)清洗选取健康的新鲜猪皮100重量份装入转鼓中，加水调节液比2.0-4.0，转动60-180min，控干废液，再加水调节液比2.0-4.0，加入氯化钠1.0-8.0重量份，转动60-180min，控干废液，然后充分水洗；(2)脱脂清洗完毕，加入40-45℃的热水调节液比1.0-4.0，鼓内温度为32-38℃，加入平平加0.1-1.0重量份，纯碱0.5-2.0重量份，渗透剂JFC 0.1-0.6重量份，转动60-120min，控干废液，加入温度为28-38℃的热水，使液比达到2.0-5.0，转动60-120min，控干废液，再加入28-38℃的热水，使液比达到2.0-5.0，转动60-150min，控干废液，加入40-45℃的热水调节液比2.0-5.0，鼓内温度为32-38℃，加入平平加0.3-0.8重量份，脱脂剂9088 2.0-5.0重量份，渗透剂JFC 0.2-0.8重量份，洗衣粉2.0-4.0重量份，2.1203脂肪酶0.3-0.6重量份，转动60-150min，控干废液，加入温度为30-35℃的热水，使液比达到3.0-5.0，转动60-150min，控干废液，再加入30-35℃的热水，使液比达到4.0-6.0，转动60-150min，控干废液；(3)浸酶加入40-45℃的热水调节液比0.5-1.2，鼓内温度为32-40℃，加入5万单位的166中性蛋白酶0.8-4.0重量份，5万单位的AS1.398蛋白酶0.3-2.0重量份，硫酸铵0.2-0.8重量份，平平加0.3-0.8重量份，间歇转动3min/30min，共转动3-10次，总时间90-300min，然后，控干废液，加入氯化钠3.0-8.0重量份，转动30-90min，将皮出鼓，在温度为25-32℃的温室内整齐堆置，堆置总时间24-72h；(4)去毛、清洗采用机器对猪皮进行去毛后，将猪皮装入转鼓中，加水调节液比2.0-5.0，转动60-180min，控干废液，加水至液比为2.0-5.0，转动60-180min，控干废液，反复操作3次，加入氯化钠2.0-5.0重量份，加水调节液比为2.0-5.0，转动60-180min，控干废液，加水调节液比为2.0-5.0，转动60-180min，控干废液，反复操作3次，然后，充分水洗，控干废液；(5)膨胀去毛、清洗后，加水调节液比1.5-4.0，加入30wt％的液碱3.0-6.0重量份，渗透剂JFC 0.3-0.8重量份，转动90-180min，流水洗30min；(6)脱碱、酶消化加入40-45℃的热水调节液比1.5-2.0，鼓内温度为30-32℃，加入硫酸0.1-0.3重量份，氯化铵或硫酸铵1.5-3.0重量份，平平加0.2-0.6重量份，转动90-180min，再加入5万单位的AS1.398中性蛋白酶0.1-0.8重量份、活力为1∶25的工业胰酶0.1-0.6重量份，转动120-240min，控干废液；(7)清洗加水调节液比2.0-5.0，加入氯化钠2.0-5.0重量份，转动90-180min，控干废液，加水调节液比2.0-5.0，转动90-180min，控干废液，按上述方法重复操作3次，然后，充分水洗，控干废液，获得纯化猪皮；(8)滚盐加入氯化钠3.0-12.0重量份，转动30-90min，出鼓；(9)分割首先将纯化猪皮裁成矩形，然后再分割成10.0-30.0cm×10.0-30.0cm的小块矩形；(10)装袋、冷冻保存将装袋的纯化猪皮放入冻库，在温度-5--15℃的条件下冷冻保存。
2.按照权利要求1所述一种猪皮本体高效纯化的方法，其特征在于转鼓为悬挂式木制转鼓或不锈钢转鼓。
全文摘要
本发明公开了一种猪皮本体高效纯化的方法，该纯化方法是选用健康的新鲜猪皮为原料，在维持猪皮的三维构造不变的前提下，对猪皮进行反复清洗和多种酶制剂－碱性材料交替处理，除去猪皮中的非胶原成分和小分子物质，得到具有良好生物相容性和生物活性的纯化猪皮。这种纯化猪皮用于提取制备医用胶原蛋白、制备组织工程支架材料和修复与重建材料。
文档编号A22B5/08GK1784986SQ200510022189
公开日2006年6月14日 申请日期2005年12月2日 优先权日2005年12月2日
发明者但卫华, 曾睿, 林海, 但年华, 陈驰, 曲健健, 叶易春, 关林波 申请人:四川大学