专利名称：酵母菌生物合成、生产旋光纯腺苷甲硫氨酸的方法及其培养液的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种生物合成法生产腺苷甲硫氨酸的方法，具体地说是一种利用酵母菌大规模合成、并进一步生产(S，S)-型旋光纯腺苷甲硫氨酸的方法，以及其中采用的一种培养液。
背景技术：
腺苷甲硫氨酸也被称为腺苷蛋氨酸、活性甲硫腺苷，英文缩写为SAMe或SAM，它是人体和其它生物体内的主要甲基供体，为体内蛋白质、脂肪、核糖核酸和维生素B12提供甲基，为体内多胺合成提供氨丙基，为tRNA的生物合成提供前体，参与体内激素、神经递质、核酸、蛋白质和磷脂的生物合成和代谢，是维护细胞膜正常功能和人体正常代谢和健康不可缺少的重要生命物质。腺苷甲硫氨酸对肝病、抑郁症和关节炎具有明确疗效，是预防癌症、心血管疾病和抗衰老的高级保健品。
腺苷甲硫氨酸有(S，S)和(R，S)两种光学异构体，试验证明仅(S，S)-型腺苷甲硫氨酸具有转甲基的生物活性(参见De La Haba et al.，J.A.C.S.，1959，813975-3980)。目前市场上使用的各种腺苷甲硫氨酸商品(如丁二烷磺酸腺苷蛋氨酸，甲苯磺酸硫酸腺苷蛋氨酸)均为这两种光学异构体的混合物，其中(S，S)-型腺苷甲硫氨酸的含量仅在60％～80％。因此，采用旋光纯的(S，S)-型腺苷甲硫氨酸在医药应用上具有显而易见的好处。
目前，腺苷甲硫氨酸的工业化制备方法主要是采用酵母菌进行生物合成的方法，可以用生长酵母进行发酵合成，也可以用代谢酵母进行生物合成(参见Schlenk F et al.，Archives of Biochemistry and Biophysics，1959，8328-34)。美国专利DN20020025926A1公布了一种旋光纯(S，S)-型腺苷甲硫氨酸的分离纯化方法，由于该方法在生产中需使用制备性高效液相色谱，因此从生产成本较高，而且不容易实现大规模制备。美国专利申请DN20020173012A1公开了旋光纯(S，S)-型腺苷甲硫氨酸的制备方法，该方法使用酵母，以葡萄糖和柠檬酸为碳源，以DL-型甲硫氨酸为前体，利用代谢酵母产生腺苷甲硫氨酸，同时在低温的条件下进行旋光纯(S，S)-型腺苷甲硫氨酸的分离纯化，最后采用冷冻干燥的方法得到产品，虽然该方法易于实现工业化生产，但其腺苷甲硫氨酸的合成水平在6g/L左右，而实际上本发明人按照该方法多次进行试验，合成水平多数均在4g/L以下。因此，仍需要对生物合成法生产腺苷甲硫氨酸进行研究，特别是对提高旋光纯腺苷甲硫氨酸产量起重要作用的酵母生物合成旋光纯腺苷甲硫氨酸的步骤进行改进，以得到稳定的较高的代谢酵母合成水平，且降低旋光纯(S，S)-型腺苷甲硫氨酸的生产成本，从而满足人们随生活质量提高而对腺苷甲硫氨酸日益增加的需求。
发明内容
本发明要解决的技术问题即是上述问题，目的是提供一种合成水平较高的酵母菌生物合成旋光纯腺苷甲硫氨酸的方法。
本发明通过下列技术方案来实现一种酵母菌生物合成旋光纯腺苷甲硫氨酸的方法，其利用酵母菌在含有碳源、甲硫氨酸和维生素的培养液中，通入空气并辅以搅拌，进行腺苷甲硫氨酸的生物合成，其特征在于在生物合成反应过程中，进行碳源补充。
本发明中所说的“生物合成过程”，可为现有常规技术，如上述背景技术中所题文献所公开的内容。
其中，本发明所使用产生腺苷甲硫氨酸的酵母(菌)可以是Saccharomyces carlsbergensis CBS 1513，也可以是Saccharomyces cerevisiaeIFO 2044，以及其它能产生腺苷甲硫氨酸的微生物；以上酵母的产生按照本领域公知的酵母菌发酵方法进行。
至于所说的培养液，也可采用现有技术，通常含有碳源、甲硫氨酸和维生素，并且含或不含氮源和/或无机盐。其中，本发明的碳源可包括但不限于葡萄糖、蔗糖及糖蜜等，最优地使用葡萄糖，在培养液中该碳源浓度为1％～10％，最优地浓度为5％；甲硫氨酸使用DL-型甲硫氨酸，在反应液中浓度通常为0.5～2.0％，最优地浓度为1.0％；而所需的维生素来源可以是应用多种单一的维生素(如维生素B1、B2、B6、B12等)进行组合，而本发明的独特之处在于可采用含有多种维生素的天然物质，如酵母粉、酵母浸膏及果汁等，最优地使用酵母浸膏，在反应液中该物质优选浓度为0.05％～1％，因浓度太低或太高，则腺苷蛋氨酸的合成水平均会降低，本发明最优选其浓度在0.2％；氮源可包括但不限于蛋白胨、花生粉和硫酸铵等，其在反应液中的浓度一般为0～2％；无机盐可包括但不限于磷酸氢二钾，其浓度一般为0～0.5％，优选0.3％。
而本发明生物合成过程中的空气通气量通常在0.2～1.5vvm，本发明最优选在0.5vvm；温度控制在20～37℃，本发明最优选在26～28℃；合成时间在18～24h，本发明最优选在22h。
至于本发明所述的碳源补充优选在合成开始8～14小时后，最优12h，通过补料的方式维持碳源在反应液中的浓度在0.5％～1.5％，维持到反应结束，通常为8～12h。其中，碳源补充太早，如在合成开始8小时以前，则延长腺苷蛋氨酸的合成时间，反之，太晚，则不能得到高合成水平的苷蛋氨酸；而维持碳源浓度太低，则合成时间延长；太高，则腺苷蛋氨酸的合成受到抑制。最优选的方案为在合成开始12h，通过补料的方式维持葡萄糖的浓度在0.8％，维持10h。
本发明要解决的另一技术问题是提供一种利用上述方法生产旋光纯腺苷甲硫氨酸的方法。
其技术方案包括①上述的酵母菌生物合成旋光纯腺苷甲硫氨酸的方法；②接着将合成的旋光纯腺苷甲硫氨酸从酵母菌中释放；③将释放出的旋光纯腺苷甲硫氨酸进一步分离纯化；④将分离纯化后的旋光纯腺苷甲硫氨酸进行浓缩；⑤将步骤④所得旋光纯腺苷甲硫氨酸干燥。
其中上述步骤②～⑤为从酵母中提取旋光纯腺苷甲硫氨酸的方法，均可采用现有技术(如美国专利USP5102791和美国专利申请DN20020025926A1等)，如采用上述文献公开的内容，具体为②在酸性环境中，用剧烈搅拌的方式使腺苷甲硫氨酸从酵母中释放出来；③接着使用微滤设备进行固液分离，然后再采用超滤技术以去除蛋白质，再使用阳离子交换层析技术进行超滤液中腺苷甲硫氨酸的富集有关杂质的去除，然后用硫酸或丁二烷磺酸洗脱，并使用吸附层析技术对腺苷甲硫氨酸溶液进行脱色；④脱色后，使用反渗透技术对腺苷甲硫氨酸溶液进行浓缩；⑤使用常规干燥技术，如低温冷冻干燥技术对腺苷甲硫氨酸浓缩液进行干燥，即得旋光纯的腺苷甲硫氨酸。
本发明步骤③中所使用微滤膜的孔径在0.1μm～0.2μm；超滤膜的截流分子量为10000道尔顿。阳离子交换层析介质可使用美国罗门哈斯(ROHMAND HAAS)公司生产的IRC系列，最优地使用AMBERLIITE IRC-50；使用以聚苯乙烯-二乙烯基苯为骨架的合成吸附树脂，如美国罗门哈斯公司生产的XAD系列，本发明特别地最优选AMBERLIITE XAD-16。
本发明的特点还在于步骤④中的浓缩可采用纳滤技术，可节约能源，进而进一步节约成本。
本发明所述的微滤、超滤、层析和纳滤步骤所要求的工作环境可同常规，即在2～20℃，最优地温度在2～8℃。
本发明要解决的又一技术问题是提供一种上述酵母菌生物合成、生产旋光纯腺苷甲硫氨酸两种方法中采用的培养液。
本发明的培养液含有碳源、甲硫氨酸和维生素等各种原料，其特别之处在于该维生素选用含有多种维生素的天然物质。
其中，该培养液中除维生素外的各种原料的种类、浓度可同现有技术，本发明选用1％～10％的碳源，0.5～2.0％的甲硫氨酸，0～2％的氮源以及0～0.5％的无机盐。该碳源选自葡萄糖、蔗糖及糖蜜，本发明最优选葡萄糖，其浓度最优选为5％；该甲硫氨酸为DL-型甲硫氨酸；该氮源选自蛋白胨、花生粉及硫酸铵；而该含有多种维生素的天然物质在培养液中的浓度为0.05％～1％，选自酵母粉、酵母浸膏和果汁等，本发明最优选酵母浸膏，其浓度最优选为0.2％。
本发明中所说的“培养液”是指反应开始前未加入酵母菌的液体；“反应液”是指培养液中加入湿酵母菌的液体；“浓度”、百分比均指各原料占培养液或反应液的重量/体积百分比，其单位为克/100毫升。
使用本发明方法进行光纯腺苷甲硫氨酸的生物合成，其合成水平通常可稳定地达到7g/l以上，较佳地可达到10～12g/l，产品纯度在98％以上，其中(S，S)-型腺苷甲硫氨酸的含量在97％以上。本发明的制备方法简单易行，容易实现规模化生产，由于生物合成水平高，而且所需要的原料成本较低，所以降低了生产成本。
具体实施例方式
下面用具体实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。
实施例1酵母菌体的富集可以自己使用常规的酵母发酵方法产生，也可以委托酵母发酵生产企业生产。取Saccharomyces carlsbergensis CBS 1513湿菌体500kg于2.0m3的生物反应器中，再加500kg自来水、50kg葡萄糖(浓度5％)、2kg酵母浸膏(浓度0.2％)、3kg磷酸氢二钾(浓度0.3％)和10kg DL-型甲硫氨酸(浓度1.0％)，组成1000L反应液，搅拌速度为180rpm，通气量为0.5vvm，温度控制在27℃，在反应开始12h后，通过补料的方式维持葡萄糖的浓度在0.8％并维持10h。取样分析，结果得到11.6g/l的腺苷甲硫氨酸。
实施例2～3分别使用蔗糖、糖蜜作为碳源替换实施例1中的葡萄糖进行试验，余同实施例1，结果分别得到了8.6g/l和10.5g/l的腺苷甲硫氨酸。
实施例4变换实施例1中的葡萄糖的浓度为1％，培养液中加入浓度为2％的氮源蛋白胨，酵母浸膏浓度为0.05％，甲硫氨酸的浓度为2％，通气量在0.2vvm，温度控制在37℃，反应时间为18小时，在反应开始8小时后通过补料所维持的葡萄糖浓度在1％至反应结束，余同实施例1，结果得到7.2g/l的腺苷甲硫氨酸。
实施例5使用酵母粉替换实施例1中的酵母浸膏，浓度为1％，葡萄糖浓度为5％，DL-型甲硫氨酸的浓度为0.5％，通气量在0.8vvm，温度控制在20℃，反应时间为24小时，在反应开始14小时后通过补料所维持的葡萄糖浓度在0.5％至反应结束，余同实施例1，结果得到了8.1g/l的腺苷甲硫氨酸。
实施例6使用果汁替换实施例1中的酵母浸膏，浓度为0.2％，葡萄糖浓度为10％，通气量在1.5vvm，温度控制在26℃，反应时间为22小时，在反应开始10小时后通过补料所维持的葡萄糖浓度在1.5％至反应结束，余同实施例1，结果得到9.3g/l的腺苷甲硫氨酸。
实施例7使用酵母菌Saccharomyces cerevisiae IFO 2044替换实施例1中的Saccharomyces carlsbergensis CBS 1513，葡萄糖浓度为2％，酵母浸膏浓度为0.1％，去除磷酸氢二钾，通气量在0.6vvm，温度控制在28℃，反应时间为20小时，在反应开始12小时后通过补料所维持的葡萄糖浓度在0.6％至反应结束，余同实施例1，结果得到了10.6g/l的腺苷甲硫氨酸。
对比实施例完全按照美国专利申请申请号为20020173012A1公布的例1进行腺苷甲硫氨酸的生物合成，即取加有酵母Saccharomyces carlsbergensis CBS1513的湿酵母100kg(用100L去离子水稀释至2.2g/l的浓度)，2kg DL-型甲硫氨酸，12kg葡萄糖和1.5kg柠檬酸，保持搅拌，在27±0.5℃温度下合成22小时，结果仅得到生物合成腺苷甲硫氨酸的水平为3.2g/l，远低于实施例1～7的合成水平。
实施例81、在实施例1中的酵母反应结束后，加入预冷的去离子水500L，用10mol/L的硫酸调节酵母液的pH值为1.0，剧烈搅拌30min，维持温度在4℃。然后使用微滤进行固液分离，温度控制在4℃，微滤膜的孔径在0.1μm～0.2μm，收集滤过液；再使用超滤设备对微滤液进行处理，温度控制在4℃，超滤膜的截流分子量为10000道尔顿，收集滤过液，并加预冷的去离子水500L稀释超滤浓缩液，共得到滤过液1600L，含10.1kg腺苷甲硫氨酸。
2、使用400L已转化为H+型的AMBERLIITE IRC-50树脂富集步骤1中得到的10.1kg腺苷甲硫氨酸，1000L预冷的去离子水洗后，用800L 0.5mol/L的硫酸洗脱(或者用0.2mol/L的丁二烷磺酸洗脱)，收集含腺苷甲硫氨酸的洗脱液，洗脱液再用400L AMBERLIITE XAD-16脱色，收集无色的腺苷甲硫氨酸溶液，计960L，含9.7kg腺苷甲硫氨酸。
3、采用纳滤设备对步骤2中得到的腺苷甲硫氨酸溶液进行浓缩，温度控制在4℃，纳滤膜的截流分子量为200道尔顿，收集浓缩液，然后加入适量预冷的硫酸和甲苯磺酸溶液(或者丁二烷磺酸溶液)，最后采用常规冷冻干燥的方法进行干燥，即得到目的产物甲苯磺酸硫酸腺苷甲硫氨酸或丁二烷磺酸腺苷蛋氨酸，其中含9.2kg腺苷甲硫氨酸。按照文献报道的方法(参见Hoffman，Biochemistry 1986，254444-4449。)测定(S，S)-型腺苷甲硫氨酸的含量，结果表明得到的腺苷甲硫氨酸中(S，S)-型的含量为97.5％，产品纯度为98.7％，结果与使用反渗透技术相仿。
实施例9～14分别将实施例2～7中反应结束的酵母按实施例8的步骤1～3进行操作，最终均得到了腺苷甲硫氨酸纯度大于98％，(S，S)-型腺苷甲硫氨酸含量大于97％的样品。
上述实施例中所用原料、试剂、各种膜等均为常规市售产品。
权利要求
1.一种酵母菌生物合成旋光纯腺苷甲硫氨酸的方法，其利用酵母菌在含有碳源、甲硫氨酸和维生素的培养液中，通入空气并辅以搅拌，进行腺苷甲硫氨酸的生物合成，其特征在于在生物合成反应过程中，进行碳源补充。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的碳源补充是在合成开始8～14小时后，通过补料的方式维持碳源在反应液中的浓度为0.5％～1.5％，该浓度单位为克/100毫升。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于该碳源选自葡萄糖、蔗糖及糖蜜。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述的碳源补充是在合成开始12小时后，保持葡萄糖在反应液中的浓度在0.8％，并维持10小时。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于该维生素选用多种单一维生素的组合，或含有多种维生素的天然物质。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于该含有多种维生素的天然物质选自酵母粉、酵母浸膏和果汁，其在培养液中的浓度为0.05％～1％，该浓度单位为克/100毫升。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于该含有多种维生素的天然物质为浓度为0.2％的酵母浸膏。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于该培养液还含有氮源和/或无机盐，所述的空气通气量在0.5vvm。
9.一种利用酵母菌生产旋光纯腺苷甲硫氨酸的方法，其包括①权利要求1、2、5～8任一项所述的酵母菌生物合成旋光纯腺苷甲硫氨酸的方法；②接着将合成的旋光纯腺苷甲硫氨酸从酵母菌中释放；③将释放出的旋光纯腺苷甲硫氨酸进一步分离纯化；④将分离纯化后的旋光纯腺苷甲硫氨酸进行浓缩；⑤将步骤④所得旋光纯腺苷甲硫氨酸干燥。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于该步骤④中的浓缩采用反渗透技术或纳滤技术。
11.一种酵母菌生物合成旋光纯腺苷甲硫氨酸的培养液，其含有碳源、甲硫氨酸和维生素，其特征在于该维生素选用含有多种维生素的天然物质。
12.如权利要求11所述的培养液，其特征在于该培养液含有浓度为1％～10％的碳源，0.5～2.0％的甲硫氨酸，0.05％～1％的含有多种维生素的天然物质，0～2％的氮源以及0～0.5％无机盐，该浓度单位为克/100毫升。
13.如权利要求11或12所述的培养液，其特征在于该碳源选自葡萄糖、蔗糖及糖蜜，该甲硫氨酸为DL-型甲硫氨酸，该氮源选自蛋白胨、花生粉及硫酸铵，该含有多种维生素的天然物质选自酵母粉、酵母浸膏和果汁。
14.如权利要求13所述的培养液，其特征在于该碳源是浓度为5％的葡萄糖，该含有多种维生素的天然物质是浓度为0.2％的酵母浸膏。
全文摘要
本发明公开了一种酵母菌生物合成旋光纯腺苷甲硫氨酸的方法，其利用酵母菌在含有碳源、甲硫氨酸和维生素的培养液中，通入空气并辅以搅拌，进行腺苷甲硫氨酸的生物合成，其中在生物合成过程中，进行碳源补充。本发明还公开了一种采用上述方法生产旋光纯腺苷甲硫氨酸的方法，并提供了一种酵母菌生物合成旋光纯腺苷甲硫氨酸的培养液。本发明腺苷甲硫氨酸的生物合成水平可达到10g/l，产品纯度在 98.5％以上，(S，S)－型的含量超过97.0％，且方法简单易行，成本较低，易实现规模化生产。
文档编号C12N1/16GK1955306SQ20051003085
公开日2007年5月2日 申请日期2005年10月28日 优先权日2005年10月28日
发明者冯军, 赵文杰, 程晴华, 朱裕辉, 薛春佳, 蒋家琛, 林纲 申请人:上海医药工业研究院