专利名称：一种共表达cyp和cpr的酵母系统的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于体外药物代谢性质评价的药物代谢酶异源表达系统，具体的说是一种稳定的共表达人细胞色素P450酶(CYP)和人细胞色素P450氧化还原酶(CPR)的酿酒酵母新表达系统。
背景技术：
目前，临床前的ADME/T和药代动力学研究已经从传统的以单一实验动物为研究对象的模式转变为综合分子水平、蛋白水平、细胞水平、组织器官水平等多水平、不断比较人与动物的ADME/T性质的异同的评价模式或体系。其中，运用体外重组的人源代谢系统对药物代谢性质的评价，有利于减少种间误差，提高准确性并大大缩短了研发时间。利用分子生物学的手段，以人源cDNA为模板、克隆出CYPs酶类，并在不同的异源表达系统中进行表达，进而利用这些酶和其他相关酶建立起体外筛选体系，进行体外代谢数据和性质到体内代谢数据和性质的预测，是体外药物代谢研究中的一个极为重要的方面。酿酒酵母表达系统是最早应用于CYP体外药物代谢研究的异源表达体系，它具有低本底CYP含量，较完整的真核膜结构及含有一定量的酵母CPR的优点。但是，酵母体系中酵母本身CPR含量低，其结构和哺乳动物的CPR也有所不同，致使酵母本身的CPR不能满足异源表达的CYP反应的需要，而造成异源的CYP在酿酒酵母表达系统中活性较低(表1中列举了报道的主要单表达CYP所使用的酵母系统，包括酵母宿主、酵母载体、载体调控单元和表达结果，H，R，M分别代指人、兔、小鼠；表2中列举了报道的主要单表达CPR所使用的酵母系统，包括酵母宿主、酵母载体、载体调控单元和表达结果)。但自1990年以来，多有报道CYP与CPR在酵母系统中共表达，使CYP活性得到了提高。同时，发现细胞色素B5(另一种CYP酶的供氢酶)也有提高部分CYP活性的能力(表3中列举了报道的主要共表达CYP、CPR/B5所使用的酵母系统，包括酵母宿主、酵母载体、载体调控单元和表达结果，H，R，M分别代指人、兔、小鼠)。但使用酿酒酵母系统应用于CYP酶系共表达时仍存在以下缺点1、与供氢体CPR共表达可使CYP的活性提高，但易造成系统不稳定；2、表达CYP和CPR的载体过大，载体在系统中的丢失现象严重，蛋白表达不稳定，引起系统的在体外药物代谢评价时，数据重复性低。
表1不同CYP在酿酒酵母中单基因表达
表2不同CPR在酿酒酵母中单基因表达
表3CYP与CPR/B5在酿酒酵母系统中共表达
发明内容本发明的目的在于提供一种稳定高效的共表达人细胞色素P450(CYP)和人细胞色素P450氧化还原酶(CPR)的酿酒酵母新系统，并用于CYP酶的体外药物代谢性质的评价，应用于体外CYP代谢酶系的药物开发。
为实现上述目的，本发明中构建了一个新的CYP酿酒酵母共表达系统。其中构建了两个新的载体，这两个表达载体是由含有酿酒酵母启动子基因全编码序列，酵母营养缺陷型筛选基因的大肠杆菌克隆载体衍生而来，和外源基因一起构建成以酿酒酵母启动子调控的含有外源目的基因的酿酒酵母表达载体。其中一个为酵母整合型表达载体，另一个为酵母游离型表达载体。游离型表达载体是由整合型表达载体酶切下其表达单元，而后表达单元和酵母游离型复制载体构建而得。CYP酶系中最重要的药物代谢酶CYP1A2、CYP2D6、CYP2E1、CYP2C9、CYP3A4和CPR分别由新构建的酵母游离型表达载体和酵母整合型表达载体导入酿酒酵母细胞中得到稳定高效表达。本发明所提供的表达CPR和CYP的方法，还包括培养上述重组酿酒酵母细胞，葡萄糖、δ-ALA(δ-aminolevulinic)、热冲击诱导表达CPR和CYP的步骤。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的一种共表达CYP和CPR的酵母表达系统，分别带有CPR的DNA片段和CYP的DNA片段的酵母表达载体转导酵母细胞中，这两个表达载体分别以整合型和游离型的方式在酵母细胞中表达，重组的酵母细胞经发酵诱导，得到的酵母细胞制备物即为目的表达系统，其可应用于CYP酶系体外药物代谢性质的评价。
所述载体由酵母启动子、终止子、外源基因、酵母筛选基因、大肠杆菌克隆载体体外构建而成。
所述酵母启动子基因全编码序列是酵母组成型及诱导型启动子全基因序列，由启动子基因的5’端上游调控序列，蛋白编码序列和3’端终止序列组成(如PGK、GAP、ADH1、GAL1、GAL7、GAL10、PHO5、CUP1等；)所述酵母筛选基因是筛选基因LEU、URA、TRP、LYS、HIS或ADE；载体可在大肠杆菌中高拷贝复制，含有大肠杆菌复制子、大肠杆菌筛选基因和多克隆位点。
所述整合型方式表达的载体为酵母整合型表达质粒，来源于去掉酵母启动基因蛋白编码序列的载体，其由酵母启动子基因全编码序列、酵母筛选基因、大肠杆菌克隆载体体外构建而成；酵母整合型表达质粒以该载体为模板，通过反向PCR扩增后和CPR连接而成；其中，在连接前，可将CPR基因切下并融合其他外源基因，调控其在酵母细胞中的表达。
在适宜CYP表达时，在多克隆位点上插入细胞色素B5基因。
所述游离型方式表达的载体为酵母高拷贝型表达质粒，来源于去掉酵母启动基因蛋白编码序列的载体，其由酵母启动子基因全编码序列、酵母筛选基因、大肠杆菌克隆载体体外构建而成；酵母高拷贝型表达质粒以该载体为模板，通过反向PCR扩增后和CYP连接，再由载体上酶切下带有5’上游启动调控区-外源基因-3’下游终止子区的长片断，插入到酵母游离型载体的多克隆位点中构建而成；其中，在连接前，可将CYP基因切下并融合其他外源基因，调控其在酵母细胞中的表达。
所述CYP为1、2、3、4、6、10A、10B、15、17、19或23家族的细胞色素P450酶，这些酶参与类固醇、脂肪酸、前列腺素、油脂、维生素、药物、杀虫剂或致癌物等的代谢；所述酵母细胞是单倍体型酵母细胞；酵母是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
1、酵母表达质粒的构建和鉴定一个新载体pTPL在pGEM-T easy vector基础上构建，插入PGK(phosphoglycerate kinase)全基因编码序列及亮氨酸筛选基因(LEU)。通过反向PCR扩增得到片断pTPL’，该片断含有pGEM-T easy vector序列，亮氨酸编码序列及PGK 5’上游启动子及3’下游终止子序列。CPR基因及CYP基因与此片断整合。
由PGK编码区切下表达单元，连接入带有尿嘧啶(URA)筛选基因的酵母游离型载体Yeplac195，构建得到质粒Yeplac195-1A2、Yeplac195-2D6、Yeplac195-2E1、Yeplac195-2C9、Yeplac195-3A4。这些质粒由PGK启动子调控。
2、酵母表达系统的构建和鉴定质粒pTPL-hCPR线性化后导入酿酒酵母菌株BWG1-7α感受态细胞，用LEU标记筛选重组子，之后，质粒Yeplac195-CYP等导入酿酒酵母BWG-CPR及BWG1-7α感受态细胞，用URA标记筛选得到重组子，3、蛋白在酵母中的表达及系统活性及稳定性分析酵母菌株BWG-CPR/CYP、BWG-CYP、BWG-CPR、BWG1-7α在发酵培养基中发酵诱导培养，并制备酵母微粒体，检测微粒体中CPR活性及CYP含量及活性。检测质粒pTPL-hCPR及Yeplac195-CYP在非选择性培养基中的传代稳定性。
4、将该系统与体外药物代谢实验结合，评价其药物代谢活性。
CYP特异底物反应分析其代谢活性，并与同源的人肝微粒体中CYP的代谢活性进行比较。
本发明酵母共表达系统可以应用于除CPR和CYP基因外其他双基因的共表达；将酵母筛选基因、酵母启动基因更换，可构建成新的整合型载体；酵母筛选基因和启动基因可从染色体扩增或从其他质粒上酶切得到所需组件；酵母游离型载体为酵母2μm质粒的衍生载体，可在酵母细胞中稳定传代，并高拷贝复制，是大肠杆菌和酵母间的穿梭型载体，含有大肠杆菌复制子，大肠杆菌筛选基因，酵母筛选基因和多克隆位点。
本发明具有如下优点(1)本发明提供的表达系统(即酵母重组细胞)构建容易，成本低。新的酿酒酵母表达系统由两个携带外源基因的新构建的载体导入而成。这两个载体由普通的大肠杆菌克隆载体出发，构建容易，成本低，稳定性高，简单有效。通过同源重组使hCPR整合入酵母基因组中，并高拷贝表达hCYP，经稳定性实验验证该系统稳定，在发酵过程中无需使用昂贵的培养基成分，使生产成本大大降低。此外，hCPR和hCYP1A2、hCYP2D6、hCYP2E1、hCYP2C9、hCYP3A4的表达量分别达到436.2 reduced cytochromec/min/mg protein和50pmol/mg、22pmol/mg、132pmol/mg、85pmol/mg、35.53pmol/mg protein，CYP1A2、CYP2D6、CYP2E1、CYP2C9和CYP3A4的活性分别为0.4nmol/min/nmol CYP、7.1nmol/min/nmol CYP、2.6nmol/min/nmol CYP、14.2nmol/min/nmol CYP和7.5nmol/min/nmol CYP。整合型载体的多克隆位点上还可插入细胞色素B5基因，用于适宜CYP的表达，将酵母筛选基因、酵母启动基因更换，还可构建成新的整合型载体。游离型载体为酵母高拷贝型表达载体，可用于除CYP外的其他氧化还原型药物代谢酶的表达。
(2)本发明提供的表达系统稳定性高。本发明使用了新构建的载体将CPR和CYP基因导入酿酒酵母细胞中，应用于CPR和CYP的表达。CPR和CYP的基因稳定性分别达到90％和70％。本发明所提供的表达CPR和CYP的方法，还包括培养重组酿酒酵母细胞，葡萄糖、δ-ALA(δ-aminolevulinic)、热冲击诱导表达CPR和CYP的方法。
(3)本发明提供的表达系统药物代谢活性和同源人肝微粒体的代谢活性接近，可用于不同CYP同工酶体外药物代谢的应用开发。本发明构建的稳定共表达细胞色素P450氧化还原酶(CPR)和细胞色素P450的新的酿酒酵母系统，可广泛地应用于氧化还原酶体系如细胞色素P450酶系，后者被广泛地应用于涉及ADME/T和药代动力学中先导化合物的优化及其酶催化工业中。本发明具有重要的实际应用价值，可应用于不同CYP同工酶体外药物代谢的研究。
总之，本发明构建了一种稳定共表达细胞色素P450氧化还原酶(CPR)和细胞色素P450的新的酿酒酵母系统。此系统由两个新的表达载体组成，它们分别被用于稳定和高活性地表达CYP和CPR酶。所构建成新的酿酒酵母共表达系统可广泛地应用于氧化还原酶体系如细胞色素P450酶系，后者被广泛地应用于涉及ADME/T和药代动力学中药物代谢等的筛选、应用和开发。
图1为pTPL、pTPL-hCPR和Yeplac195-3A4的质粒图谱；图2为hCPR的western-blot鉴定结果；图3为hCYP3A4的western-blot鉴定结果；图4为hCYP3A4的p450-CO吸收峰图谱(baseline-基线，未通入CO时450nm下吸收峰，CO-通入CO后450nm下吸收峰)；图5a-d为hCPR、hCYP3A4的基因稳定性实验结果；其中PCR扩增(图5a，泳道1为母系酵母染色体扩增对照，泳道2-7为1至6天培养的酵母染色体扩增结果，8为DNA marker DL2000)、CPR活性(图5b)和western结果(图5c，泳道1至6为培养1至6天分别得到的酵母微粒体的western结果)进一步证明hCPR传代稳定。pTPL-hCPR、Yeplac195-3A4两载体的稳定性分别达到90％和70％(图5d，LEU是pTPL-hCPR上的筛选标记，URA是Yeplac195-3A4上的筛选标记)。
具体实施例方式本发明结合具体实施例做进一步说明实施例1酵母表达质粒的构建和鉴定1.提取酵母染色体扩增得到PGK片断。得到的PGK扩增片断经回收纯化直接连接入克隆载体pGEM-T easy vector，得到的重组子经测序后证明序列正确。载体pT-PGK用Klenow酶去掉NdeI位点，得到pT-PGKn质粒。LEU筛选基因和pT-PGKn经SacII和SphI酶切，而后由T4DNA连接酶连接，转化入大肠杆菌，得到的重组子即为pTPL质粒(如图1)。以pTPL为模板，设计引物进行PCR扩增。获得了pTPL’片断，长度约为5000bp(包括酵母启动子、终止子、酵母筛选基因、大肠杆菌克隆载体的序列)。
2.hCPR cDNA和hCYP1A2、hCYP2D6、hCYP2E1、hCYP2C9、hCYP3A4cDNA分别由人胚胎cDNA文库和人肝cDNA文库PCR扩增得到。hCPR和hCYP1A2、hCYP2D6、hCYP2E1、hCYP2C9、hCYP3A4分别和pTPL’由T4DNA连接酶连接，得到质粒pTPL-hCPR及pTPL-1A2、pTPL-2D6、pTPL-2E1、pTPL-2C9、pTPL-3A4。质粒pTPL-1A2、pTPL-2D6、pTPL-2E1、pTPL-2C9、pTPL-3A4进一步从PGK启动子及终止子部分酶切得到PGK-1A2、PGK-2D6、PGK-2E1、PGK-2C9、PGK-3A4表达片断，由T4DNA连接酶连接入pYeplac195，重组子酶切鉴定并测序。
实施例2酵母表达系统的构建和鉴定用SphI限制性内切酶将质粒pTPL-hCPR线性化，转化酵母菌BWG1-7α感受态细胞，重组子用亮氨酸筛选鉴定，构建成宿主菌株BWG-CPR。提取酵母染色体并进行PCR扩增，鉴定重组子。同时，制备酵母微粒体，SDS-PAGE电泳微粒体，并用western blot分析CPR表达条带(如图2)。
质粒pYeplac195-CYP直接转化入BWG-CPR感受态细胞，重组子用尿嘧啶筛选鉴定，构建成菌株BWG-CPR/CYP。挑取转化菌落接种于液体YPD培养基中，30℃培养至OD600＝0.6-0.8，提取酵母染色体并进行PCR扩增，鉴定重组子。同时，制备酵母微粒体，SDS-PAGE电泳微粒体，并用westernblot分析CYP表达条带(CYP3A4表达条带如图3)。
实施例3蛋白在酵母中的表达及系统活性及稳定性分析1、制备酵母微粒体(yeast microsome，YM)发酵培养基1L，培养基成分酵母浸出物10g，蛋白胨20g，葡萄糖30g，定容于1000ml蒸馏水中。
菌体开始振摇时，加入菌体δ-ALA，使其终浓度为0.5mmol/L。30℃振摇至6小时，降温至25℃，振摇30分钟，而后迅速升温至30℃，直至菌体长至OD600＝1.0-1.5，离心菌液，收集菌体，制备酵母微粒体。
2、酵母系统活性测定及稳定性分析使用Bradford方法检测酵母微粒体蛋白含量，并检测微粒体中CPR活性(表4)及CYP含量(如图4，CYP3A4-CO还原吸收峰)。hCYP1A2、hCYP2D6、hCYP2E1、hCYP2C9、hCYP3A4的表达量分别为50pmol/mg、22pmol/mg、132pmol/mg、85pmol/mg、35.53pmol/mg酵母微粒体蛋白。目前常用的表达CYP的酿酒酵母系统(宿主为酿酒酵母菌株AH22，载体为pYeDP60，调控单元GAL10-CYC1-tPGK)，CPR活性为99 reduced cytochromec/min/mg酵母微粒体蛋白，以CYP3A4为例，其活性为5.2nmol/min/nmolCYP。
3、验证系统稳定性接种BWG1-7α及BWG-CPR/CYP于5ml YPD培养基中，30℃，振摇至OD600＝1.0左右，分别转接这两个菌液1ml于100ml YPD培养基，30℃，振摇培养24小时，各取4ul划线于YPD平板，同时各再转接1ml菌液于100mlYPD液体培养基。待YPD平板培养至菌落长起，50个BWG1-7α菌落分别点种于COM-LEU(COM，酵母极限培养基)和COM-URA平板，50个BWG-CPR/CYP分别点种于COM-LEU和COM-URA平板。如此培养6天，即菌液转接6次，涂板6次。计COM-LEU和COM-URA上的菌落，与YPD板上生长菌落数相比的百分数即为基因在酵母系统中的稳定性常数。同时，收集菌液，提取酵母染色体并制备酵母微粒体，PCR扩增酵母染色体、western blot鉴定CPR蛋白，及活性分析CPR，验证蛋白表达的稳定性(如图5a-d所述)。
实施例4、CYP底物特征反应，与同源人肝微粒体CYP药物代谢活性进行比较，评价其药物代谢活性。
在体外溶液系统中，37℃下完成CYP的特征反应，产物在高效液相色谱系统中检测(表5)。本研究以人肝微粒体的代谢活性作为对照。
表4CPR蛋白在BWG-CPR/CYP酵母细胞和母系酵母细胞BWG1-7α中活性的比较
*与对照组比，P＜0.01表5hCYP的HPLC活性检测结果
*与对照组比，P＜0.0权利要求
1.一种共表达CYP和CPR的酵母表达系统，其特征在于分别带有CPR的DNA片段和CYP的DNA片段的酵母表达载体转导酵母细胞中，这两个表达载体分别以整合型和游离型的方式在酵母细胞中表达，重组的酵母细胞经发酵诱导，得到的酵母细胞制备物即为目的表达系统，其可应用于CYP酶系体外药物代谢性质的评价。
2.按照权利要求1所述的共表达CYP和CPR的酵母表达系统，其特征在于所述载体由酵母启动子、终止子、外源基因、酵母筛选基因、大肠杆菌克隆载体体外构建而成。
3.按照权利要求2所述的共表达CYP和CPR的酵母表达系统，其特征在于所述酵母启动子基因全编码序列是酵母组成型及诱导型启动子全基因序列，由启动子基因的5’端上游调控序列，蛋白编码序列和3’端终止序列组成；所述酵母筛选基因是筛选基因LEU、URA、TRP、LYS、HIS或ADE；载体可在大肠杆菌中高拷贝复制，含有大肠杆菌复制子、大肠杆菌筛选基因和多克隆位点。
4.按照权利要求1或2所述的共表达CYP和CPR的酵母表达系统，其特征在于所述整合型方式表达的载体为酵母整合型表达质粒，来源于去掉酵母启动基因蛋白编码序列的载体，其由酵母启动子基因全编码序列、酵母筛选基因、大肠杆菌克隆载体体外构建而成；酵母整合型表达质粒以该载体为模板，通过反向PCR扩增后和CPR连接而成；其中，在连接前，可将CPR基因切下并融合其他外源基因，调控其在酵母细胞中的表达。
5.按照权利要求1或2所述的共表达CYP和CPR的酵母表达系统，其特征在于所述游离型方式表达的载体为酵母高拷贝型表达质粒，来源于去掉酵母启动基因蛋白编码序列的载体，其由酵母启动子基因全编码序列、酵母筛选基因、大肠杆菌克隆载体体外构建而成；酵母高拷贝型表达质粒以该载体为模板，通过反向PCR扩增后和CYP连接，再由载体上酶切下带有5’上游启动调控区-外源基因-3’下游终止子区的长片断，插入到酵母游离型载体的多克隆位点中构建而成；其中，在连接前，可将CYP基因切下并融合其他外源基因，调控其在酵母细胞中的表达。
6.按照权利要求4或5所述的共表达CYP和CPR的酵母表达系统，其特征在于在适宜CYP表达时，在多克隆位点上插入细胞色素B5基因。
7.按照权利要求1或5所述的共表达CYP和CPR的酵母表达系统，其特征在于所述CYP为1、2、3、4、6、10A、10B、15、17、19或23家族的细胞色素P450酶，这些酶参与类固醇、脂肪酸、前列腺素、油脂、维生素、药物、杀虫剂或致癌物等的代谢。
8.按照权利要求1所述的共表达CYP和CPR的酵母表达系统，其特征在于所述酵母细胞是单倍体型酵母细胞；酵母是酿酒酵母。
9.按照权利要求1所述的共表达CYP和CPR的酵母表达系统，其特征在于所述的酵母共表达系统可以应用于除CPR和CYP基因外其他双基因的共表达。
全文摘要
本发明涉及一种用于体外药物代谢性质评价的药物代谢酶异源表达系统，具体的说一种共表达CYP和CPR的酵母表达系统，分别带有CPR的DNA片段和CYP的DNA片段的酵母表达载体转导酵母细胞中，这两个表达载体分别以整合型和游离型的方式在酵母细胞中表达，重组的酵母细胞经发酵诱导，得到的酵母细胞制备物即为目的表达系统，其可应用于CYP酶系体外药物代谢性质的评价。所构建成新的酿酒酵母共表达系统可广泛地应用于氧化还原酶体系如细胞色素P450酶系，后者被广泛地应用于涉及ADME/T和药代动力学中药物代谢等的筛选、应用和开发。
文档编号C12N15/53GK1948460SQ20051004740
公开日2007年4月18日 申请日期2005年10月14日 优先权日2005年10月14日
发明者杨凌, 程婕 申请人:中国科学院大连化学物理研究所