专利名称：一种微生物利用甘油厌氧发酵生产1,3－丙二醇的方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，涉及利用单一微生物将可发酵的甘油碳源生物转化为1，3-丙二醇的方法。
背景技术：
众所周知，1，3-丙二醇是重要的化工原料和医药中间体，是一种在生产聚酯纤维中和在制造聚亚胺酯及环状化合物中具有潜在应用价值的单体。
目前工业上主要采取化学合成法来进行1，3-丙二醇的生产。已经知道有很多种化学途径能够生产1，3-丙二醇，但化学法副产物多，产品分离提纯较困难，生产成本相应较高。相比之下，生物转化法生产1，3-丙二醇以其利用再生资源、对环境污染小等特点越来越受到人们的重视。
目前生产1，3-丙二醇的微生物法大致可分为三类一是用肠道细菌将甘油歧化为1，3-丙二醇(USP5254467和EP0373230 A1)；二是以葡萄糖为底物用基因工程菌生产1，3-丙二醇(PCT/US 96/-6705、USP5599689、WO 96/35796、WO 9821340及WO 9821339)；三是将生产甘油和1，3-丙二醇的两株菌混合培养(USP 5599689)。这些方法各有优缺点第一种方法的转化率和产物浓度均较高，但是甘油价格偏高，影响1，3-丙二醇的生产成本；第二种方法可以降低原料成本，但基因工程菌的生产能力及其稳定性还不太理想；第三种方法有助于减少两步发酵的时间，但由于两种菌的生长条件不尽相同，如产甘油菌通常在好氧条件下生长，而产1，3-丙二醇菌通常在厌氧条件下生长，因此很难取得较为理想的效果。
就目前情况来看，甘油转化1，3-丙二醇的技术最为成熟，效果也最好。比较理想的方法是利用甘油做底物，以克雷伯氏菌(Klebsieblla penumoniae)、非氏柠檬酸菌(Citrobacter freandii)和丁酸梭状芽孢杆菌(Clostridiumbutyricum)等厌氧或兼性厌氧菌为发酵菌种。这些发酵菌种已经解决了底物和产物高浓度耐受能力差的问题。它们利用甘油进行厌氧或兼性厌氧代谢生产1，3-丙二醇都是通过氧化和还原两个支路进行的，两个支路间通过生物体的能荷(由ATP提供)与氢荷(由NADH2提供)维持代谢通量分布。氧化途径主要步骤1)甘油经甘油脱氢酶(Glycerol dehydrogenase，GDH)催化生成2-羟基丙酮(DHA)，此酶为厌氧酶，以NAD+为辅酶，受到体系的氢荷水平的影响；2)DHA在ATP及2-羟基丙酮激酶(Dihydroxyacetone kinase)的作用下，生成磷酸二羟丙酮(DHAP)；3)DHAP进一步代谢生产丙酮酸。丙酮酸是代谢过程中很重要的中间产物，它进一步代谢为各种小分子产物，如乙酸、乳酸、乙醇、甲醇等，同时产生菌体生长和生产所必需的NADH2和ATP，这些小分子副产物再进行厌氧发酵。随着发酵的进行，它们的累积极大地影响了菌体生长与生产的能力。还原途径有两步酶反应1)甘油脱水酶(Glycerol dehydrogenase，GDHt)厌氧情况下(即反应体系处在较低的氧化还原电位)将甘油转化为中间产物3-羟基丙醛(3-HPA)；2)在NADH2存在下，3-HPA经1，3-丙二醇脱氢酶(1，3-Propanediol dehydrogenase，PDDH)催化生成1，3-丙二醇。氧化途径为还原途径提供足够的NADH2。
与化学合成法相比，目前的甘油转化法存在产物浓度低、生产周期长和甘油转化率低等问题，导致缺乏市场竞争力而无法实现工业化应用。其中，甘油转化率较低是导致其生产成本居高不下的一个重要因素。目前解决甘油转化率低的问题主要是采用双底物协同发酵的方法，例如CN 1434122A中以葡萄糖为辅助底物进行两段双底物集成发酵生产1，3-丙二醇，甘油转化率有所提高，但1，3-丙二醇的产量不高，在菌体利用甘油发酵后期生长能力较弱。Sylvie等人通过调节混合培养基中葡萄糖与甘油的比例来研究，也发现添加这些辅助底物虽然可以提高甘油转化率，但甘油向1，3-丙二醇的代谢通量不大，应用前景不甚明朗。CN 1446919A中利用1，3-丙二醇生物合成过程中需要消耗一定量还原当量的特性，在发酵培养基或在厌氧发酵过程中添加适量的还原剂，增强菌体中还原当量(NADH2)的积累，促进底物甘油沿还原途径代谢，以提高1，3-丙二醇的合成浓度和转化率。该方法的甘油转化率以及发酵效率提高幅度有限。
上述各种方法都没有很好地提高发酵效率。各种文献资料表明，添加少量多种有机物质进行有效代谢还未有报道。
发明内容
针对单一菌体利用甘油厌氧发酵转化率低的问题，本发明提供了一种甘油发酵合成1，3-丙二醇的改进方法，即在发酵培养基或厌氧发酵过程中添加适量的有机中间代谢分子，加强氧化代谢支路中丙酮酸以后的代谢过程，使丙酮酸的后续代谢流主要向着TCA循环进行，从而在提供给甘油还原支路中形成1，3-丙二醇时所需NADH的同时，削弱菌体在厌氧情况下较多生成乙酸、乳酸、乙醇、甲醇小分子副产物等代谢流的趋势，改善菌体代谢过程，增加菌体生长与生产的相互耦合性，提高发酵效率。
本发明技术方案为制备用于培养克雷伯氏杆菌的发酵培养基，并往上述培养基中接入克雷伯氏杆菌种子培养液，进行厌氧发酵以合成1，3-丙二醇，其特征在于，往所述发酵培养基中加入有机中间代谢分子。所述的有机中间代谢分子选自柠檬酸、琥珀酸、延胡索酸或苹果酸中的一种或几种，在发酵培养基中的浓度为0.1g/L～1.0g/L。
本发明另一种方案是制备用于培养克雷伯氏杆菌的发酵培养基，并往上述培养基中接入克雷伯氏杆菌种子培养液，进行厌氧发酵以合成1，3-丙二醇，其特征在于，在进行厌氧发酵合成1，3-丙二醇的过程中，在菌体生长的指数期添加有机中间代谢分子。所述的有机中间代谢分子选自柠檬酸、琥珀酸、延胡索酸或苹果酸中的一种或几种，其在发酵液中的浓度为0.1g/L～1.0g/L。
本发明方法通过添加有机中间代谢分子，实现了1，3-丙二醇发酵过程中底物与产物间理想的通量分布，进而实现高效的1，3-丙二醇发酵。这种方法的益处在于大大简化了微生物发酵生产1，3-丙二醇的工艺过程，突破了甘油生物法生产1，3-丙二醇甘油转化率低的瓶颈，提高了底物转化率，缩短了发酵时间，从而降低了生产成本，为微生物利用甘油发酵法生产1，3-丙二醇的工业化奠定了基础。
具体实施例方式
本发明方案的具体实施方式
按照现有技术的步骤进行，本发明方案一具体步骤为
(1)培养基制备基本培养基中必须含有菌体生长所需的营养成分，碳源为甘油，氮源为酵母膏或铵盐，另外还含有钠、钾、铵、镁、钙等阳离子和磷酸根、硫酸根、氯离子等阴离子，以及锌、铁、镍、铜、钴、硼和钼等微量元素。此外往培养基中添加适量的有机中间代谢分子，所述有机中间代谢分子选自柠檬酸、琥珀酸、延胡索酸或苹果酸中的一种或几种，其加入浓度为0.1g/L～1.0g/L。培养基在121℃、0.1MPa下灭菌20分钟使用。
(2)种子培养摇瓶中进行培养，温度为32℃～42℃，转速为100～200转/分钟，培养时间为15～30小时，氮气通入量为0.1～1升/分钟。
(3)发酵培养发酵罐中进行培养，接种量10v％～15v％，转速为100～300转/分钟，温度控制在32℃～42℃，pH控制在5.0～9.0之间。发酵罐保持厌氧条件，氮气通入量为2～4vvm。
发酵方式可以是间歇发酵、批式流加发酵或连续发酵。间歇或批式流加发酵时间为20～60小时，连续发酵的稳态时间为30～40小时，发酵液中1，3-丙二醇的最终浓度可达到20g/L～70g/L，底物的摩尔转化率可达到50％～80％。
间歇发酵时培养基中甘油的浓度为15g/L～30g/L，批式流加发酵时补加的甘油浓度为70g/L～90g/L，连续发酵培养基中甘油浓度为15g/L～30g/L。连续发酵时以20g/L的初始甘油浓度进行一级培养，直到菌浓超过2.0g/L后，开始连续流加新鲜的培养基进行稳态发酵过程，稀释率为0.5～1.0h-1。
本发明方案二的实施步骤为将方案一中添加的有机中间代谢分子改为在发酵过程中菌体生长的指数期加入，加入浓度不变。
本发明还可以同时在种子培养基中加入适量的有机中间代谢分子，所述有机中间代谢分子选自柠檬酸、琥珀酸、延胡索酸或苹果酸中的一种或几种，在种子培养基中的浓度为0.1g/L～1.0g/L。
除了加入适量的有机中间代谢分子，本发明还可以在发酵培养基或厌氧发酵过程中菌体生长的指数期添加适量的维生素C和/或维生素E还原剂，加入量为40mg/L～150mg/L。
以下通过实施例对本发明方案作进一步的阐述。本发明比较例和实施例中均采用批式流加发酵方式。
实施例1本发明实施例中所用的菌种为克雷伯氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)，来自中国石化抚顺石油化工研究院专利菌种，菌种在中国普通微生物菌种保藏中心(CGMCC)，菌种保藏号0798。
培养基分种子培养基和发酵培养基两种种子培养基组成(1L)K2HPO4 34gKH2PO4 13g(NH)4SO4 6g MgSO4·7H2O0.2gCaCl2·H2O0.02g CaCO32.0g酵母膏 1.0g甘油 60gFe2+溶液2.0mL 微量元素溶液I 1.0mL其中Fe2+溶液(FeSO45g/L HCl(37％)4.0mL)微量元素溶液I组成(mg/L)MgSO4·4H2O 100mg/L ZnCl270mg/LNa2MoO4·2H2O35mg/LH3BO3 60mg/LCoCl2·6H2O 200mg/L CuSO4·5H2O 29.28mg/LNiCl2·6H2O 25mg/L 37％HCl 0.9mL发酵培养基组成(1L)NH4Cl 5.35g KCl 0.75gNaH2PO4·H2O1.38g Na2SO4 0.28gMgCl2·6H2O 0.26g CaCl2·H2O0.0029g柠檬酸 0.2g 酵母膏 1.0g泡敌(稀)0.1mL甘油 40.0g微量元素溶液II 5mL其中微量元素溶液II组成(mg/L)FeCl3·6H2O5.0mg/L Na2MoO4·2H2O0.005mg/LZnCl2·6H2O0.68mg/L MnCl2·4H2O 0.17mg/LH3BO3 0.06mg/L CoCl2·6H2O 0.47mg/L
CuCl2·2H2O0.17mg/L 37％HCl1.0mL种子与发酵培养基在灭菌前均要把pH调节为7.0。
发酵过程分种子培养和发酵培养两步。
种子培养在500mL的带有挡板的三角摇瓶中进行，装液量为200mL，瓶口用橡皮塞密封，并在瓶塞上带有两个进出气口，进气口由导管通入底部，通入氮气流量为0.1～1升/分钟，摇床转速为150转/分钟，培养温度为37℃，培养时间为20小时。
发酵培养在全自动发酵罐中进行，发酵体积为6L，温度和转速恒定在37℃和150转/分钟，氮气通气量为3vvm，用5mol/L的氢氧化钠调节pH控制在7.0，发酵时间40～60小时。
具体的发酵实验结果如下起始甘油浓度为20g/L，有机中间代谢分子起始浓度为0.2g/L，完全厌氧发酵过程中甘油浓度维持在～40g/L。本发酵周期的时间为40小时，最终测得发酵液中1，3-丙二醇的浓度为54.5g/L，甘油摩尔转化率为52.1％。
比较例1为未添加有机酸时进行的发酵实验。
实施例2-5分别为添加不同有机酸和不同浓度有机酸进行的发酵实验，比较例1和实施例1-5所得的实验结果列于表1。
实施例6-10是在发酵过程中菌体生长的指数期(约第4-12小时)加入有机酸，在发酵培养基中不加有机酸，其它条件不变，实验结果列于表2。
由表1可见，在发酵培养基中加入0.1g/L～1.0g/L的有机中间代谢分子，在维持1，3-丙二醇的浓度相当的情况下，能使甘油的摩尔转化率提高2.0到15.4个百分点。而表2则显示，在发酵过程中菌体生长的指数期加入0.1g/L～1.0g/L的有机中间代谢分子，在维持1，3-丙二醇的浓度相当时，能使甘油的摩尔转化率提高4.3到31.5个百分点。
通过上述实验证明，本发明提出的添加有机中间代谢分子促进菌体合成1，3-丙二醇的方法，在保证菌体高产的同时，大幅提高了菌体生产产物的效率，降低了生产成本。
表1发酵培养基中添加有机中间代谢分子实验结果
表2菌体生长指数期添加有机中间代谢分子实验结果
权利要求
1.一种微生物利用甘油厌氧发酵生产1，3-丙二醇的方法，含有制备用于培养克雷伯氏杆菌的发酵培养基，并往上述培养基中接入克雷伯氏杆菌种子培养液，进行厌氧发酵合成1，3-丙二醇的步骤，其特征在于，在所述发酵培养基中加入浓度为0.1g/L～1.0g/L的有机中间代谢分子。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述有机中间代谢分子选自柠檬酸、琥珀酸、延胡索酸或苹果酸中的一种或几种。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述发酵培养基中加入维生素C和/或维生素E还原剂，加入量为40mg/L～150mg/L。
4.一种微生物利用甘油厌氧发酵生产1，3-丙二醇的方法，含有制备用于培养克雷伯氏杆菌的发酵培养基，并往上述培养基中接入克雷伯氏杆菌种子培养液，进行厌氧发酵合成1，3-丙二醇的过程，其特征在于，在进行厌氧发酵合成1，3-丙二醇的过程中，在菌体生长的指数期添加有机中间代谢分子，所述有机中间代谢分子在发酵液中的浓度为0.1g/L～1.0g/L。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述有机中间代谢分子选自柠檬酸、琥珀酸、延胡索酸或苹果酸中的一种或几种。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在菌体生长的指数期加入维生素C和/或维生素E还原剂，加入量为40mg/L～150mg/L。
全文摘要
本发明提供了一种添加有机中间代谢分子促进菌体合成1，3－丙二醇的方法，属于1，3－丙二醇生物合成技术领域。针对现有技术中单一菌体利用甘油厌氧发酵转化率低的问题，本发明通过在发酵培养基中或在菌体生长的指数期添加适量有机中间代谢成分，实现了1，3－丙二醇发酵过程中底物与产物间理想的通量分布，进而实现高效的丙二醇发酵。本发明方法突破了利用甘油生物法生产1，3－丙二醇转化率低的瓶颈，提高了底物转化率，缩短了发酵时间，从而降低了生产成本。
文档编号C12R1/22GK1955304SQ200510047540
公开日2007年5月2日 申请日期2005年10月26日 优先权日2005年10月26日
发明者王领民, 金平, 佟明友 申请人:中国石油化工股份有限公司, 中国石油化工股份有限公司抚顺石油化工研究院