专利名称：同步检测百合斑驳病毒、百合无症病毒和黄瓜花叶病毒的方法
技术领域：
本发明涉及一种同步检测侵染百合的百合斑驳病毒(LMoV)、百合无症病毒(LSV)以及黄瓜花叶病毒(CMV)三种主要病毒的多重RT-PCR方法，属植物保护领域。
背景技术：
百合是集观赏、食用、药用于一身的重要经济作物，尤其是切花百合颜色鲜艳、气质高雅，并带有独特的香味，已成为国际上最重要的观赏花卉之一，具有很高的经济价值。近年来，随着人民生活水平的不断提高，对鲜切花特别是百合的需求量不断增加，百合的种植规模日益扩大。然而由于不规范的生产方式及长期无性繁殖使病毒不断积累，百合的病毒病害发生日趋严重，极大的降低了百合的产量和品质，给百合种植业造成巨大的经济损失。据报道侵染百合的病毒有10多种，分布广，危害大，为害严重的主要有百合斑驳病毒(LMoV)、百合无症病毒(LSV)和黄瓜花叶病(CMV)等，而且这三种病毒常复合侵染，引起叶片花叶、坏死、畸形及花朵碎色等症状，严重地降低了百合的商品性和观赏性。通常百合病毒的感染率在30-40％，有的高达100％，给百合造成的危害更大。到目前为止，国际上尚无治疗病毒病害的特效药剂，因此百合病毒检测尤其是对三种主要病毒的检测和监测，对于识别病毒病害和防止病毒的传播流行具有重要的实际意义，是生产上对百合病毒病害进行综合治理的重要措施之一。
通常检测百合病毒的方法有指示植物法、电镜技术、酶联免疫吸附技术和分子生物学技术等。相比较而言，指示植物法虽然简单，但是检测周期长，最短也要10～20天，而且灵敏度非常低，还受到季节、环境以及病毒性质等方面的影响，因此已经很少用于百合病毒的检测。免疫电镜的出现极大的促进了电镜技术在百合病毒检测方面的应用，但是电子显微镜价格昂贵，制样技术复杂，不易掌握，不适合作为百合病毒检测的普通方法。目前应用最为广泛的检测百合病毒的方法是酶联免疫吸附法(ELISA)和分子生物学技术。较之指示植物法和电镜技术，ELISA方法检测周期较短，灵敏度高，可以检测到纳克(ng)级水平的病害。分子生物学技术，特别是RT-PCR技术不但操作简单，而且特异性、灵敏度较ELISA方法高，可以检测到飞克(fg)级水平的病毒。但是ELISA方法和普通RT-PCR的方法每次只能检测一种病毒，对于多种病毒复合侵染百合的情况，则需要针对每种病毒进行单独检测，既浪费时间，又加大了检测成本的投入。此外，普通的RT-PCR扩增过程中对于每种病毒都需要分别设计上游和下游引物，导致检测成本升高，而且提高了非特异性检测的发生几率。
发明内容
本发明克服了传统方法在检测多种病毒复合侵染百合的不足，提供了一种同步、快速、灵敏、特异的检测百合上发生的LMoV、LSV和CMV三种病毒的方法。
本发明的步骤是1)设计引物(a)设计检测LMoV、LSV两种病毒的下游通用引物LMSVLMSV 5-GATGGCTGACTGGATCCTTTTTTTTTTTTTTTTV-3 V＝A，C或G(b)设计检测LMoV、LSV的上游引物，引物序列如下
(c)设计检测CMV的上、下游引物，引物序列如下
(d)确定每对引物扩增片段大小
2)总RNA提取(a)称取百合叶片50mg，放入研钵中，加入1mL Trizol试剂研磨，研磨液倒入1.5mL离心管中；(b)加入400μL氯仿，混匀后静置5min；(c)12,000rpm离心10min；(d)上清移至一新1.5mL离心管中，加入等体积的异丙醇，混匀后静置5min；(e)12,000rpm离心10min；(f)弃上清，沉淀用1mL 70％乙醇洗涤，干燥10min；(g)沉淀用40μL DEPC处理水悬浮，-20℃保存备用；3)RT-PCR(a)RNA变性RNA 3μL，LMSV 1μL，CMV 1μL和7.5μL ddH2O混匀，70℃保温10min，之后迅速冰浴；(b)反转录向上述管中按以下体系加入试剂，振荡混匀，室温放置10min，42℃保温1hr，得到cDNA；
(c)PCR取一新PCR管，按下表体系加入各试剂
设置PCR程序为94℃4min，94℃1min、53℃～60℃1min、72℃2min，扩增25～40个循环，72℃延伸10min后4℃保存；4)电泳检测配制0.8％～2％的琼脂糖凝胶，在0.5×TBE缓冲液环境中，150V稳压电泳90min，之后取出凝胶浸泡在0.5μg/mL溴化乙锭中染色10min，然后在紫外灯下观察并记录结果；5)检测结果分析根据电泳胶上扩增条带的有无及大小确定百合感染的病毒种类；通过观察，若凝胶中存在大小为1153bp的核酸片段，则说明样品中含有LMoV；若凝胶中存在大小为736bp的核酸片段，则说明样品中含有LSV；若凝胶中存在大小为590bp的核酸条带，则说明样品中含有CMV。
其中，所述的PCR退火温度为53℃～60℃，也可以为56℃～58℃；所述的PCR循环可以为25～40个循环，也可以为26～29个循环；所述的琼脂糖浓度可以为0.8％～2％，也可以为0.9％～1.2％。
本发明的有益效果是能够极大的节约时间和成本。由于LMoV和LSV序列的3’端均带有一个poly(A)结构，因此可以据此设计一条带Oligo d(T)的引物作为同时检测LMoV和LSV共用的下游通用引物，减少了引物的数量，而且极大的降低了引物间的相互作用，而且增加了检测的特异性。此外，本发明克服了传统RT-PCR一个体系一次只能检测一种病毒的局限，在一个体系中可以同时检测三种病毒，与传统RT-PCR相比，最多能够节约三分之二的检测时间和试剂成本。
图1是百合斑驳病毒、百合无症病毒和黄瓜花叶病毒的电泳检测图。
具体实施例方式实例一以已知的复合感染了LMoV、LSV和CMV三种病毒的百合植株为材料，以健康百合植株为阴性对照，用本方法进行检测。
1)设计引物(a)设计检测LMoV、LSV两种病毒的下游通用引物LMSVLMSV 5-GATGGCTGACTGGATCCTTTTTTTTTTTTTTTTV-3 V＝A，C或G
(b)设计检测LMoV、LSV的上游引物，引物序列如下
(c)设计检测CMV的上、下游引物，引物序列如下
(d)确定每对引物扩增片段大小
2)总RNA提取(a)称取百合叶片50mg，放入研钵中，加入1mL Trizol试剂研磨，研磨液倒入1.5mL离心管中；(b)加入400μL氯仿，混匀后静置5min；(c)12,000rpm离心10min；(d)上清移至一新1.5mL离心管中，加入等体积的异丙醇，混匀后静置5min；(e)12,000rpm离心10min；(f)弃上清，沉淀用1mL 70％乙醇洗涤，干燥10min；(g)沉淀用40μL DEPC处理水悬浮，-20℃保存备用；3)RT-PCR(a)RNA变性RNA3μL，LMSV1μL，CMV1μL和7.5μL ddH2O混匀，70℃保温10min，之后迅速冰浴；(b)反转录向上述管中按以下体系加入试剂，振荡混匀，室温放置10min，42℃保温1hr，得到cDNA；
(c)PCR取一新PCR管，按下表体系加入各试剂
设置PCR程序为94℃4min，94℃1min、58℃1min、72℃2min，扩增29个循环，72℃延伸10min后4℃保存；4)电泳检测配制1.2％的琼脂糖凝胶，在0.5×TBE缓冲液环境中，150V稳压电泳90min，之后取出凝胶浸泡在0.5μg/mL溴化乙锭中染色10min，然后在紫外灯下观察并记录结果；5)电泳检测结果感染了LMoV、LSV和CMV三种病毒的百合叶片中检测出了1153bp、736bp和590bp的三条核酸条带，说明通过本发明可同步检测出LMoV、LSV和CMV三种病毒；健康对照中未检测到任何条带，说明不含有这三种病毒任何一种。
实例二以已知的分别感染了LMoV、LSV或CMV的百合植株进行检测，并以健康百合为阴性对照。
1)设计引物
(a)设计检测LMoV、LSV两种病毒的下游通用引物LMSVLMSV 5-GATGGCTGACTGGATCCTTTTTTTTTTTTTTTTV-3 V＝A，C或G(b)设计检测LMoV、LSV的上游引物，引物序列如下
(c)设计检测CMV的上、下游引物，引物序列如下
(d)确定每对引物扩增片段大小
2)总RNA提取(a)称取百合叶片50mg，放入研钵中，加入1mL Trizol试剂研磨，研磨液倒入1.5mL离心管中；(b)加入400μL氯仿，混匀后静置5min；(c)12,000rpm离心10min；(d)上清移至一新1.5mL离心管中，加入等体积的异丙醇，混匀后静置5min；(e)12,000rpm离心10min；(f)弃上清，沉淀用1mL 70％乙醇洗涤，干燥10min；(g)沉淀用40μL DEPC处理水悬浮，-20℃保存备用；3)RT-PCR(a)RNA变性RNA3μL，LMSV1μL，CMV1μL和7.5μL ddH2O混匀，70℃保温10min，之后迅速冰浴；(b)反转录向上述管中按以下体系加入试剂，振荡混匀，室温放置10min，42℃保温1hr，得到cDNA；
(c)PCR取一新PCR管，按下表体系加入各试剂
设置PCR程序为94℃4min，94℃1min、56℃1min、72℃2min，扩增26个循环，72℃延伸10min后4℃保存；4)电泳检测配制0.9％的琼脂糖凝胶，在0.5×TBE缓冲液环境中，150V稳压电泳90min，之后取出凝胶浸泡在0.5μg/mL溴化乙锭中染色10min，然后在紫外灯下观察并记录结果；5)电泳检测结果在单独感染了LMoV的百合中检测到了大小为1153bp的核酸条带，说明通过本发明可以特异的检测出LMoV；在单独感染了LSV的百合中检测到了大小为736bp的核酸条带，说明通过本发明可以特异检测出LSV；在单独感染了CMV的百合中检测到了590bp的核酸条带，说明通过本发明可以特异检测出CMV；健康对照中没检测出任何条带，说明该样品种不含这三种病毒任何一种。
实例三以已知的复合感染了LMoV和LSV的百合植株、复合感染了LSV和CMV的百合植株以及复合感染了LMoV和CMV的百合植株为材料，以健康百合植株为阴性对照，用本方法进行检测。
1)设计引物(a)设计检测LMoV、LSV两种病毒的下游通用引物LMSVLMSV 5-GATGGCTGACTGGATCCTTTTTTTTTTTTTTTTV-3 V＝A，C或G(b)设计检测LMoV、LSV的上游引物，引物序列如下
(c)设计检测CMV的上、下游引物，引物序列如下
(d)确定每对引物扩增片段大小
2)总RNA提取(a)称取百合叶片50mg，放入研钵中，加入1mL Trizol试剂研磨，研磨液倒入1.5mL离心管中；(b)加入400μL氯仿，混匀后静置5min；(c)12,000rpm离心10min；(d)上清移至一新1.5mL离心管中，加入等体积的异丙醇，混匀后静置5min；(e)12,000rpm离心10min；(f)弃上清，沉淀用1mL70％乙醇洗涤，干燥10min；(g)沉淀用40μL DEPC处理水悬浮，-20℃保存备用；3)RT-PCR(a)RNA变性RNA3μL，LMSV1μL，CMV1μL和7.5μL ddH2O混匀，70℃保温10min，之后迅速冰浴；(b)反转录向上述管中按以下体系加入试剂，振荡混匀，室温放置10min，42℃保温1hr，得到cDNA；
(c)PCR取一新PCR管，按下表体系加入各试剂
设置PCR程序为94℃4min，94℃1min、57℃1min、72℃2min，扩增28个循环，72℃延伸10min后4℃保存；4)电泳检测配制1％的琼脂糖凝胶，在0.5×TBE缓冲液环境中，150V稳压电泳90min，之后取出凝胶浸泡在0.5μg/mL溴化乙锭中染色10min，然后在紫外灯下观察并记录结果；5)电泳检测结果在复合感染了LMoV和LSV的百合中检测到了1153bp和736bp的两条核酸条带，说明通过本发明可以同步检测出LMoV和LSV两种病毒；在感染了LSV和CMV两种病毒的叶片中检测到了736bp和590bp的两条核酸条带，说明通过本发明可以同步检测出LSV和CMV两种病毒；在感染了LMoV和CMV两种病毒的百合叶片中检测到了1153bp和590bp的两条核酸条带，说明通过本发明可以同步检测出LMoV和CMV两种病毒；在健康对照中未检测到任何条带，说明该样品种不含有这三种病毒任何一种。
利用此方法在不同情况下对百合斑驳病毒(LMoV)、百合无症病毒(LSV)和黄瓜花叶病毒(CMV)进行了检测。从实验结果看出，无论是在一种病毒单独侵染，还是在两种或是三种病毒复合侵染的情况下，均能在电泳图中特定位置检测到相应的病毒扩增产物，而且阴性对照无非特异性结果发生，因此该方法可以被应用于百合植株上发生的LMoV、LSV和CMV三种主要病毒的同步检测。
权利要求
1.一种同步检测LMoV、LSV和CMV三种病毒的方法，其步骤如下1)设计引物(a)设计检测LMoV、LSV两种病毒的下游通用引物LMSVLMSV 5-GATGGCTGACTGGATCCTTTTTTTTTTTTTTTTV-3 V＝A，C或G(b)设计检测LMoV、LSV的上游引物，引物序列如下
(c)设计检测CMV的上、下游引物，引物序列如下
(d)确定每对引物扩增片段大小
2)总RNA提取(a)称取百合叶片50mg，放入研钵中，加入1mL Trizol试剂研磨，研磨液倒入1.5mL离心管中；(b)加入400μL氯仿，混匀后静置5min；(c)12,000rpm离心10min；(d)上清移至一新1.5mL离心管中，加入等体积的异丙醇，混匀后静置5min；(e)12,000rpm离心10min；(f)弃上清，沉淀用1mL 70％乙醇洗涤，干燥10min；(g)沉淀用40μL DEPC处理水悬浮，-20℃保存备用；3)RT-PCR(a)RNA变性RNA 3μL，LMSV 1μL，CMV 1μL和7.5μL ddH2O混匀，70℃保温10min，之后迅速冰浴；(b)反转录向上述管中按以下体系加入试剂，振荡混匀，室温放置10min，42℃保温1hr，得到cDNA；
(c)PCR取一新PCR管，按下表体系加入各试剂
设置PCR程序为94℃ 4min，94℃ 1min、53℃～60℃ 1min、72℃ 2min，扩增25～40个循环，72℃延伸10min后4℃保存；4)电泳检测配制0.8％～2％的琼脂糖凝胶，在0.5×TBE缓冲液环境中，150V稳压电泳90min，之后取出凝胶浸泡在0.5μg/mL溴化乙锭中染色10min，然后在紫外灯下观察并记录结果；5)检测结果分析根据电泳胶上扩增条带的有无及大小确定百合感染的病毒种类；通过观察，若凝胶中存在大小为1153bp的核酸片段，则说明样品中含有LMoV；若凝胶中存在大小为736bp的核酸片段，则说明样品中含有LSV；若凝胶中存在大小为590bp的核酸条带，则说明样品中含有CMV。
2.根据权利要求1所述的同步检测LMoV、LSV和CMV三种病毒的方法中所用的PCR扩增方法，其特征是退火温度为56℃～58℃。
3.根据权利要求1所述的同步检测LMoV、LSV和CMV三种病毒的方法中所用的PCR扩增方法，其特征是扩增26～29个循环。
4.根据权利要求1所述的同步检测LMoV、LSV和CMV三种病毒的方法中所用的电泳检测方法，其特征是配制的琼脂糖凝胶的浓度为0.9％～1.2％。
全文摘要
本发明提供了一种同步检测百合斑驳病毒(LMoV)、百合无症病毒(LSV)和黄瓜花叶病毒(CMV)的方法，属植物保护领域。其方案是，通过提取总RNA、多重RT－PCR以及电泳检测等步骤，在同一反应管及同一个热循环条件下对百合感染的LMoV、LSV和CMV三种病毒中的1～3种进行扩增，并通过凝胶电泳进行分离和检测。该方法除了具有普通RT－PCR具有的快速、特异、灵敏的优点外，主要是实现了三种病毒同步检测，降低了成本。
文档编号C12Q1/02GK1793858SQ20051004872
公开日2006年6月28日 申请日期2005年12月22日 优先权日2005年12月22日
发明者李凡, 孙健, 陈海如, 李正跃, 王钰丽, 刘云龙, 范静华, 姬广海, 孔宝华, 王扬, 杨斌, 蒋小龙, 白松, 蔡红, 胡先奇 申请人:云南农业大学