专利名称：巨细胞病毒的检测和定量方法
技术领域：
本发明涉及到利用特定核酸序列进行CMV的检测和定量方法。
背景技术：
巨细胞病毒(CMV)是属于β人疱疹病毒科的正20面体DNA病毒，日本成年人90％都感染该病毒。通常刚出生后感染，但由于大多是无症状性感染，所以没有特别病状出现。后天感染有以尿、唾液、母乳、精液作为感染原的接触感染和由于输血或器官移植引起的医原性感染。CMV的特征是在整个生存期间都潜伏在生物体内，可以由于宿主的生理变化由潜伏感染状态活化(再活化)，反复地周期性发病。在恶性肿瘤、AIDS患者、器官移植患者中，免疫缺陷状态成了CMV再活化的起因，往往会发生间质性肺炎、肝炎、网膜炎、脑炎、肾炎。特别是尽管器官移植成功了，但移植后由于间质性肺炎等丧命成了很大的问题。因此，对于成为致命原因的CMV感染的再活化，确立快速高灵敏度的诊断方法对早期治疗非常重要。
以往作为CMV感染的诊断方法，有从患者的体液分离CMV后进行鉴定的方法，但需要2～3周，在迅速性上欠缺。另外，如果利用检测患者血清中抗CMV抗体的血清诊断方法，存在着产生抗体非特异性反应的问题，以及难于获得高灵敏度，由于抗体效价变化难于捕获病毒的消长等缺点。
最近，已经可以利用实时PCR(聚合酶链反应)对来自CMV的DNA进行检测。这是一种利用对来自CMV的DNA特异的引物，通过PCR对病毒DNA进行扩增、检测的方法，具有灵敏度高的特征。然而，由于CMV潜伏感染多种器官，所以仅靠通过PCR法检测DNA难以区别再活化和潜伏感染。另外，也有人想出了对CMV再活化时出现的mRNA进行扩增、检测的RT-PCR(反转录-聚合酶链反应)法，但需要将mRNA转换为cDNA的步骤，操作需要熟练，直至获得检测结果需要很长时间。而且，存在着如果DNA以微量存在而mRNA即使不存在时，判定为阳性的危险性。
另一方面，人们已知以下的方法。
所述方法与对RNA进行逆转录，变换为cDNA后，对反应液进行升降温，对DNA实施所谓PCR扩增的RT-PCR法不同，对反应液不进行升降温，将RNA作为RNA进行扩增、检测的方法(例如，专利文献2所述的NASBA法、专利文献3所述的TMA法、专利文献4所述的扩增·检测法等)。在这些方法中，包括例如通过转录生成特定序列的RNA转录产物、合成含有RNA聚合酶的启动子序列的双链DNA的方法。
更具体讲，例如，对于存在于任一RNA中的可将该RNA与其它RNA区别开的特定序列，(1)使用与该特定序列3’端互补的DNA引物和RNA依赖的DNA聚合酶(逆转录酶)，以RNA作为模板，产生与特定序列互补的DNA，(2)对于通过逆转录生成的RNA-DNA双链，使用具有核糖核酸酶H活性的酶作用而分解RNA，生成单链DNA，(3)使用与该单链DNA的3’端互补的、在其5’端含有RNA聚合酶启动子序列的DNA引物并使用DNA依赖的DNA聚合酶，合成含有上述启动子序列的双链DNA，(4)使RNA聚合酶作用于该双链DNA，可生成转录产物(特定序列的RNA)。由于RNA转录产物是特定序列的RNA，所以成为上述(1)反应中的模板，与在上述(1)反应中使用的DNA引物结合，进行(2)以后的反应，引起RNA扩增的链反应。
这些方法的特征在于不需要像PCR那样对反应液进行升降温，也不将RNA的逆转录和其后的链式扩增反应分开实施。专利文献1的方法是将专利文献2的方法应用于来自CMV的mRNA的扩增、检测的例子。然而，该方法是使被扩增的RNA被吸附于或结合于固相载体的捕捉探针捕捉后，使之与检测用探针杂交，将未反应的检测用探针分离后，对捕捉探针、扩增的RNA、检测用探针的复合体进行检测，在迅速性方面欠缺。在这方面，使可特异结合所扩增特定序列的用嵌入性荧光色素标记的寡核苷酸探针(专利文献5所述)在反应液中共存，在对特定序列或与其互补的序列扩增的同时对其扩增可以进行监测的专利文献4所述的扩增、检测法是在一定温度、通过一步操作可以实施，是迅速性方面优越的定量法。
然而，适合于该专利文献4方法的来自CMV的mRNA扩增用的引物和检测用探针还不知道。这是由于认为专利文献4的方法是在一定温度下进行mRNA的扩增、检测，作为靶的mRNA形成高级结构后阻碍寡核苷酸的结合，所以扩增、检测效率变差的缘故。因此，需要在一定温度下结合效率不降低，且可以进行mRNA的扩增和检测的寡核苷酸。
专利文献1特开平9-289900专利文献2专利第2650159号专利文献3专利第3241717号专利文献4特开2000-014400号专利文献5特愿2000-154431号发明内容发明要解决的课题因此本发明的目的在于提供对于由CMV感染的细胞得到的样品，通过适用于专利文献4那样的方法，对来自CMV的mRNA进行扩增、检测，在一定温度、通过一步操作可迅速对再活化的CMV量进行检测、定量的方法。
用于解决课题的手段为了达到上述目的而完成的本申请权利要求1的发明是特征如下的对存在于来自CMV的mRNA的特定序列的扩增方法对于由CMV感染的细胞得到的样品，针对存在于来自CMV的β2.7基因的mRNA中的特定序列，使用含有与特定序列的一部分互补的序列的第1引物(其特征是含有序列编号6、7或8所示的任一碱基序列或其互补链中的至少10个连续的核苷酸序列)以及含有与特定序列的一部分同源的序列的第2引物(其特征是含有序列编号3、4或5所示的任一碱基序列或其互补链中的至少10个连续的核苷酸序列。其中第1或第2引物中任一方是在其5’末端侧附加有RNA聚合酶的启动子序列的引物)，进行(1)以单链RNA为模板，利用具有RNA依赖的DNA聚合酶活性的酶合成与特定序列互补的cDNA，(2)利用具有核糖核酸酶H活性的酶分解RNA-DNA双链中的RNA(生成单链DNA)，(3)利用以单链DNA作为模板的、具有DNA依赖的DNA聚合酶活性的酶合成含有特定序列或与特定序列互补的序列和可转录RNA的启动子序列的双链DNA，以及(4)利用具有RNA聚合酶活性的酶合成以双链DNA为模板的RNA转录产物(该RNA转录产物成为上述(1)的反应模板)。
本申请权利要求2的发明是通过在用嵌入性荧光色素标记的序列9或10所示的任一碱基序列或其互补链中至少10个连续碱基构成的寡核苷酸(以下称为寡核苷酸探针)存在下，实施权利要求1的扩增，与该寡核苷酸探针不与上述RNA转录产物互补结合形成复合体的情况相比，利用荧光特性变化的现象，测定反应液荧光强度，从而对来自CMV的mRNA进行检测以及定量的方法。
本申请权利要求3的发明是以在权利要求1的扩增方法中，在上述特定序列的5’末端切割来自CMV的mRNA时，使用序列编号1或2所示的寡核苷酸为特征的扩增方法。
本申请权利要求4的发明是含有序列编号6、7或8所示的碱基序列或其互补链中的至少10个连续核苷酸序列的、对来自CMV的β2.7基因的mRNA特异的寡核苷酸。
本申请权利要求5的发明是含有序列编号3、4或5所示的碱基序列或其互补链中的至少10个连续核苷酸序列的、对来自CMV的β2.7基因的mRNA特异的寡核苷酸。
本申请权利要求6的发明是含有序列编号9或10所示的任一碱基序列或其互补链中的至少10个连续核苷酸序列的、对来自CMV的β2.7基因的mRNA特异的寡核苷酸。
本申请权利要求7的发明是由序列编号1或2所示的任一碱基序列构成的、对来自CMV的β2.7基因的mRNA特异的寡核苷酸。
本申请权利要求8的发明是含有权利要求4、5、6或7所述任一寡核苷酸的CMV检测及定量试剂盒。
以下，对本发明进行详细说明。
本发明通过采用以RNA作为RNA进行扩增的方法，在一定温度、通过一步操作可迅速对来自CMV的mRNA进行检测。特别是如果预先在反应液中使对转录产物可特异结合的、用嵌入性荧光色素标记的寡核苷酸探针共存，那么在特定序列或与其互补的序列扩增的同时可对该扩增的情形进行检测。检测中使用的探针是与特定序列或其互补的序列可特异结合的寡核苷酸结合了嵌入性荧光色素的探针，其中对所述寡核苷酸与转录产物互补结合和不结合的状态进行比较，存在荧光特性的变化，在实施本发明中，上述检测是最优选的方式。另外，嵌入性荧光色素对寡核苷酸的标记方法虽然没有特别限定，但优选由磷原子借助于接头进行结合的方法。作为结合方法，例如首先将氨基等官能团导入寡核苷酸的链内或末端，只要是对嵌入性荧光色素需要，也可导入与导入到寡核苷酸的官能团反应或可结合的官能团，使双方的官能团之间结合。更详细地讲如专利文献5或Ishigur，T(1996)Nucleic Acids Res.24(24)4992-4997所述。
本发明虽然在一定温度下可以实施，但该温度是35℃至50℃(优选43℃)比较低的低温。
在实施本发明时，首先决定存在于来自CMV的mRNA中的特定序列。在本发明中，将在CMV的潜伏状态下不表达，而只在再活化时大量表达的来自CMV的β2.7基因的mRNA作为靶mRNA。然后，根据该靶mRNA内的特定序列设计本发明实施中使用的第1以及第2引物等序列。例如，至少含有序列编号3～8所示碱基序列或其互补链中的10个连续核苷酸序列的多核苷酸就象实施例所述的那样，是作为来自CMV的β2.7基因的mRNA扩增用引物给出的合适序列的一个例子，至少含有序列编号9或10所示的碱基序列或其互补链中的10个连续核苷酸序列的多核苷酸是作为检测用探针特别合适序列的一个例子。
其中，所谓样品指的是含有mRNA的核酸样品。在本发明中，将CMV感染的人细胞作为材料，例如使用特开平7-59572号等所述的方法制备的样品，通过将上述列举的mRNA作为直接的扩增·检测对象，进行作为该样品来源的人细胞中的CMV的检测和定量。
以下对本申请发明进行更具体说明。对于样品中作为扩增·检测对象存在来自CMV的β2.7基因的mRNA的场合，通过进行(1)以该mRNA中存在的特定序列作为模板，第1引物(与特定序列的3’末端区域互补的序列)进行互补结合，通过RNA依赖的DNA聚合酶进行延伸反应而生成cDNA，形成由RNA-DNA构成的双链，(2)然后利用具有核糖核酸酶H活性的酶分解RNA-DNA双链中的RNA，生成单链DNA，然后(3)对该单链DNA，第2引物(是与靶RNA的5’末端区域同源的序列，其5’末端附加有RNA聚合酶的启动子序列)进行互补结合，通过具有DNA依赖的DNA聚合酶活性的酶生成具有启动子的双链DNA，其中所述启动子可转录由与上述靶RNA序列同源的序列构成的RNA。以及(4)该双链DNA在具有RNA聚合酶活性的酶的存在下，生成由与上述特定序列同源的序列构成的RNA转录产物，该RNA转录产物由于是由特定序列构成的RNA，所以成为(1)反应的模板，结果由上述(1)至(4)的反应应当在生成RNA或DNA时消耗尽酶底物，或连锁生成直至上述各种酶失活。
上述例子是作为第2引物使用在其5’末端附加RNA聚合酶的启动子序列的例子(以下称为第1方式)。在本发明中，也可以使用在第1引物的5’末端附加RNA聚合酶的启动子序列(以下称为第2方式)。按照第1方式实施本发明时，为了提高特定序列的扩增效率，使其检测灵敏度提高，在上述(1)的反应之前，最好是在特定序列的5’末端预先切割含有特定序列的RNA(参照例如专利文献4)。
作为切割RNA的方法，可以列举，例如使具有与特定序列5’末端重叠并相邻的区域互补的序列的寡核苷酸(切割用寡核苷酸)共存，使在下面的反应中也使用的具有核糖核酸酶H活性的酶作用而进行切割的方法。该寡核苷酸优选由序列编号1或2所示的序列构成的寡核苷酸。其中切割用寡核苷酸的3’末端最好是预先对该寡核苷酸实施使其不具有引物作用的处理，例如氨基化等处理。
为了对来自CMV的β2.7基因的mRNA进行检测和定量，需要对如上所述扩增的特定序列的存在进行检测，确认其是否存在，或需要由扩增的特定序列的量(RNA拷贝数)推定存在于样品中的特定序列量(作为对象的RNA拷贝数)。特定序列的检测，例如对于在一定时间进行了上述反应的反应液中特定序列的检测，也可以运用与特定序列互补结合的固定化和标记化探针的夹心分析法，如上所述，优选使用与特定序列特异结合的用嵌入性荧光色素标记的寡核苷酸探针。另外，该探针由于不抑制上述(1)至(4)的反应，所以特别优选在该探针存在下，实施上述特定序列的扩增后，对特定序列的扩增情形进行监测。另外，当在嵌入性荧光色素标记的寡核苷酸探针共存下进行特定序列扩增时，为了使它的探针部分不作为延伸反应的引物起作用，优选在其3’末端预先附加例如乙醇酸或生物素等。而且，通过荧光检测仪对在扩增反应中嵌入性荧光色素标记的寡核苷酸探针与特定序列结合后发出的荧光信号进行测定，通过由该测定曲线获得的信息(例如，荧光色素发出的荧光强度达到一定强度时所需要的扩增反应时间等)与有关已知量的标准RNA的测定曲线得到的信息进行比较，可以确认其是否存在，或从扩增的特定序列的量(RNA拷贝数)推定存在于样品中的特定序列量(作为对象的RNA拷贝数)。作为该寡核苷酸探针的碱基序列，优选序列编号9或10所示的序列中至少10个连续碱基构成的序列。
以上所述的本发明方法通过使用预先准备的检测试剂盒，可以极简单地实施。检测试剂盒优选地是包括第1和第2引物、(只要是按照第1方式实施本发明的)切割用引物、用嵌入性荧光色素标记的寡核苷酸探针、具有RNA依赖的DNA聚合酶活性的酶、具有核糖核酸酶H活性的酶、具有DNA依赖的DNA聚合酶活性的酶、具有RNA聚合酶活性的酶、这些酶的底物等用于扩增、检测特定序列的所有必需试剂的试剂盒，要特别指出的是可将所有的试剂都封入到单一的容器中。即只要实施将一定量的样品分注到这样的单一容器的操作，此后可以自动地对来自CMV的β2.7基因的mRNA进扩增、检测。该容器为了能够由外部可测定例如荧光色素发出的信号，特别优选至少其一部分要由透明材料构成，而且在分注样品后可密封以防止污染。
就象以上说明的那样，通过本发明可以在比较低的低温和一定温度(35℃～50℃，优选43℃)条件下，从扩增反应到检测通过一阶段的操作在短时间内对来自CMV的β2.7基因的mRNA进扩增、检测、定量。
在本发明中，以样品中的靶RNA(来自CMV的β2.7基因的mRNA)为基础，可以合成在末端带有DNA依赖的RNA聚合酶的启动子区域的双链DNA，该双链DNA成为大量单链RNA的合成源，进一步合成的单链RNA量飞跃增大，在嵌入性荧光色素标记的探针与生成的单链RNA互补结合引起的荧光增加进行测定的步骤中，通过对荧光强度增加的过程进行解析，可以简便、而且在短时间内决定初期RNA量。
通过提供一步操作的用于检测来自CMV的β2.7基因的mRNA的寡核苷酸的组合，即提供来自CMV的β2.7基因的mRNA扩增用的寡核苷酸引物、以及检测用的寡核苷酸探针组合，可以将利用这些组合的简便、迅速而且高灵敏度的CMV检测和定量方法以及检测和定量试剂盒提供给医疗领域。
以下通过实施例对本发明进行更详细说明。表1给出了使用的第1引物、第2引物、切割用引物的组合。在实施例中显示的是其中扩增效率最高的表1的第9号组合。但是本发明并不限于这些实施例。
表1
实施例1制备嵌入性荧光色素标记的寡核苷酸探针。
对从序列编号9所示序列中5’末端开始的第4位碱基(G)和第5位碱基(C)间的磷原子标记作为嵌入性荧光色素众所周知的色素唑黄，制备唑黄标记的寡核苷酸探针(序列编号9)(参照Ishiguro，T(1996)Nucleic Acids Res，24(24)4992-4997)。
实施例2使用本申请发明的寡核苷酸引物组合，检测β2.7RNA的多种初始拷贝数。
(1)进行β2.7RNA的制备所谓β2.7RNA是对来自CMV的β2.7基因的碱基序列(国家生物技术信息中心的登录号X17403的184889位～187359位的2471个碱基)中的2154个碱基的双链DNA进行克隆后，作为模板通过体外转录合成、纯化的RNA。
将β2.7RNA(2154mer)作为样品，根据260nm的紫外吸收定量后，使用RNA稀释液(10mMTris-HCl(pH8.0)，0.1mM EDTA，0.5U/μl核糖核酸酶抑制剂、5.0mMDTT)稀释成1.0×106个拷贝/5μl～30个拷贝/5μl。在对照试验区(nega)中只使用RNA稀释液。
(2)将以下组成的反应液20.0μl分注到0.5ml容量的PCR用管(基因扩增用的薄壁反应管，Perkin Elmer制造)，向管中添加上述RNA样品5μl。
反应液组成(浓度为酶溶液添加后的反应体系的最终浓度)60.0mM Tris-盐酸缓冲液(pH8.6)18.0mM氯化镁100.0mM氯化钾1.0mM DTT每种dATP，dCTP，dGTP，dTTP各0.25mM每种ATP，CTP，UTP各3.0mM2.25mM GTP3.6mM ITP第1寡核苷酸引物(序列编号8)和第2寡核苷酸引物(序列编号5)各1.0μM。另外在第2寡核苷酸引物的碱基序列的5’末端附加序列编号11(T7聚合酶的启动子序列)后使用。
0.16μM的切割用寡核苷酸引物(序列编号2；用于在可结合第2引物的位置切割β2.7RNA的寡核苷酸。3’末端氨基化)6单位核糖核酸酶抑制剂(Takarabio公司生产)13.0％DMSO调容量用蒸馏水12.0nM嵌入性荧光色素标记的寡核苷酸探针(实施例1中制备的探针)(3)将上述反应液于43℃下保温5分钟后，添加按照以下组成，而且预先在43℃下保温2分钟的酶液5.0μl。
酶液的组成(反应时的最终浓度)2.0％山梨糖醇6.4单位AMV逆转录酶(Takarabio公司生产)
142单位T7RNA聚合酶(GIBCO)3.6μg牛血清白蛋白调容量用蒸馏水(4)接下来使用可直接测定PCR管的带有调温功能的荧光分光光度计，于43℃下保温后，在激发波长470nm、荧光波长510nm下，测定反应液随时间推移的荧光强度。
将添加酶时的时刻定为0分钟，
图1给出了样品的荧光强度比(所定时刻的荧光强度值÷背景的荧光强度值)随时间的变化。RNA样品浓度是1.0×106个拷贝/30μl至30个拷贝/30μl。由图1得到依赖于β2.7RNA初始浓度的荧光曲线，表明可以检测未知样品中存在的来自CMV的β2.7基因的mRNA量。
附图简述图1在初始β2.7RNA量为106个拷贝/30μl至30个拷贝/30μl范围内，随着反应时间和RNA的生成而增大的荧光增加率图。Ca130为β2.7RNA 30拷贝/5μl、Ca1 10^2为β2.7RNA 102拷贝/5μl、Ca1 10^3为β2.7RNA 103拷贝/5μl、Ca1 10^4为β2.7RNA 104拷贝/5μl、Ca1 10^5为β2.7RNA 105拷贝/5μl、Ca1 10^6为β2.7RNA 106拷贝/5μl。Nega为使用RNA稀释液代替RNA样品。
序列表<110>东曹株式会社<120>巨细胞病毒的检测和定量方法<130>PA211-1465<160>11<170>PatentIn版本3.2<210>1<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>CBS3<400>1gattaaggaa aggagaagat aa 22<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>CBS32<400>2ccgagattaa ggaaaggaga20<210>3<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>CBF3
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<223>CBF5<400>4atctcggatt atcatttccc t 21<210>5<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>CBF4<400>5tcggattatc atttccctct cct23<210>6<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>CBR1<400>6tttgaattct tcgagtt 17<210>7<211>17<212>DNA
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<223>CBR2<400>7gtcgactttg aattctt 17<210>8<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>CBR3<400>8cttgttggga atcgtc16<210>9<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>CBINAF1<400>9tctgcgattc gtggtagg 18<210>10<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>CBINAF2<400>10ctttttaccc tcttgtttat20
<210>11<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>T7<400>11aattctaata cgactcacta tagggaga 28
权利要求
1.对来自CMV的mRNA的扩增方法，其特征是使用具有与来自样品中的巨细胞病毒(cytomegalovirus，以下缩写为CMV)的mRNA中特定序列的一部分互补的序列的第1引物以及具有与特定序列的一部分同源的序列的第2引物(这里第1或第2引物中的任一引物是在其5’末端侧附加RNA聚合酶的启动子序列的引物)，进行(1)以单链RNA为模板，利用具有RNA依赖的DNA聚合酶活性的酶合成与特定序列互补的cDNA、(2)利用具有核糖核酸酶H活性的酶分解RNA-DNA双链中的RNA(生成单链DNA)、(3)以单链DNA作为模板，利用具有DNA依赖的DNA聚合酶活性的酶生成具有特定序列或与特定序列互补的序列和可转录RNA的启动子序列的双链DNA，以及(4)利用具有RNA聚合酶活性的酶生成以双链DNA为模板的RNA转录产物(该RNA转录产物变成了上述(1)的反应中的模板)，在对前期样品中CMV进行扩增的方法中，上述mRNA是来自CMV的β2.7基因的mRNA，上述第1引物是由序列编号6、7或8所示的任一碱基序列或其互补链中的至少10个连续碱基构成的寡核苷酸，上述第2引物是由序列编号3、4或5所示的任一碱基序列或其互补链中的至少10个连续碱基构成的寡核苷酸。
2.对来自CMV的mRNA的检测和定量方法，其特征是在嵌入性荧光色素标记的由序列编号9或10所示的任一碱基序列或其互补链中的至少10个连续碱基构成的寡核苷酸(以下称为寡核苷酸探针)存在下，实施权利要求1的扩增，通过将该寡核苷酸探针不与上述RNA转录产物互补结合形成复合体的情况相比，利用荧光特性变化的现象，测定反应液的荧光强度。
3.权利要求1所述的扩增方法，其特征是在权利要求1的mRNA的扩增方法中，当在第2引物附加启动子序列时，在具有与来自CMV的β2.7基因的mRNA中上述特定序列的5’末端重叠并相邻的区域互补的序列的寡核苷酸存在下，实施扩增，所述寡核苷酸是由序列编号1或2所示的任一序列构成的寡核苷酸。
4.对来自CMV的β2.7基因的mRNA特异的寡核苷酸，其特征在于包含序列编号6、7或8所示的任一碱基序列或其互补链中的至少10个连续的核苷酸序列。
5.对来自CMV的β2.7基因的mRNA特异的寡核苷酸，其特征在于包含序列编号3、4或5所示的任一碱基序列或其互补链中的至少10个连续的核苷酸序列。
6.对来自CMV的β2.7基因的mRNA特异的寡核苷酸，其特征在于由序列编号9或10所示的任一碱基序列或其互补链中的至少10个连续的碱基组成。
7.对来自CMV的β2.7基因的mRNA特异的寡核苷酸，其特征在于由序列编号1或2所示的任一碱基序列组成。
8.包含权利要求4、5、6或7所示的任一寡核苷酸的CMV检测以及定量试剂盒。
全文摘要
提供了CMV的检测和定量方法，其特征是在一定温度下，通过一步操作，可迅速地对来自CMV的β2.7基因的mRNA进行扩增、检测。对来自CMV的β2.7基因的mRNA，通过使用可特异扩增的寡核苷酸引物的组合，由这些寡核苷酸引物组合构成的RNA扩增步骤，使用嵌入性荧光色素标记的寡核苷酸探针进行测定的检测法，解决上述课题。
文档编号C12Q1/68GK1888074SQ20051008075
公开日2007年1月3日 申请日期2005年6月30日 优先权日2004年6月30日
发明者大仲悟, 林俊典 申请人:东曹株式会社