具有特定单核苷酸多态性的th基因及其检测方法和用途的制作方法

专利名称：具有特定单核苷酸多态性的th基因及其检测方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种具有特定单核苷酸多态性的基因及其检测方法和用途，特别涉及一种具有特定单核苷酸多态性的酪氨酸羟化酶(TH)基因及其检测方法和用途。
背景技术：
高血压病是一种危害人类健康的常见多发病，其引起的冠心病和脑卒现已成为人类因病致死的首要病因。目前迫切需要能够预防、诊断或治疗原发性高血压的有效方法和药物。虽然人类为高血压的研究投入了大量的人力和物力，但迄今为止关于高血压的发病机理尚未完全阐明，也没有有效的预防、诊断及治疗方法。既往的流行病学和临床研究表明高血压病具有明显的家族聚集倾向，说明高血压病与遗传因素密切相关。从分子生物学观点来看，一些基因结构异常和/或表达异常是高血压病的根本原因，其中基因突变、基因移位和基因调控异常起着相当大的作用。现人们认为肾素基因异常、血管紧张素、血管紧张素转换酶基因和原癌基因可能与高血压形成有关。
酪氨酸羟化酶，英文tyrosine hydroxylase，缩写TH，别名缩写TYH，蛋白产物见表1。
表1、酪氨酸羟化酶基因蛋白产物的4种异构体

已知酪氨酸羟化酶基因定位在人类染色体11p15.5，在人类基因组上只有1个拷贝，包含14个主要的外显子，长度大约为8K碱基对(请参见图1所示)。在基因表达中它的第一个内含子内发生的RNA可变剪接产生了至少3种不同的mRNA，这些不同的mRNA的差异在于12个碱基对和18个碱基对的插入或缺失。在神经系统的不同部分酪氨酸羟化酶的基因表达存在差异。
酪氨酸羟化酶催化苯丙氨酸(phenylalanine)转变为多巴胺(dopamine)，是儿茶酚胺(catecholamines)生物合成步骤中的限速酶，在肾上腺素激导性神经的生理过程中起着关键作用。酪氨酸羟化酶与神经系统疾病，例如精神分裂症、情感性精神障碍和尼古丁依赖症的关系已有了广泛的研究。目前针对高血压与酪氨酸羟化酶关联关系的研究并不多，有限的几个实验均只涉及了酪氨酸羟化酶基因第一个内含子内TCAT重复序列和位于第2个外显子里的Val81Met多态性位点，但是酪氨酸羟化酶基因其余多态性位点与原发性高血压间的关系，以及这些多态性位点的检测方法、试剂盒在国内外均没有专利或报道。

发明内容
针对上述问题，本发明的一个目的是提供一种内含子中具有特定单核苷酸多态性的TH基因。
本发明的一个目的是提供一种检测本发明的内含子中具有特定单核苷酸多态性的TH基因的方法。
本发明的一个目的是提供一种体外筛查原发性高血压相关基因的方法。
本发明的一个目的是提供一种体外检测待测样品中是否存在原发性高血压相关基因的易感位点的方法。
本发明的另一目的是提供一种体外预测待测个体原发性高血压危险性的方法。
本发明的另一目的是提供一种体外检测内含子中具有单核苷酸多态性的TH基因的试剂盒。


图1为人类TH基因的结构示意图。图中的数字1-13分别代表内含子1-13。
图2为TH基因rs2070762多态性位点及其侧翼序列。图中加黑的C/T为TH基因rs2070762多态性位点，前后序列分别为其侧翼序列。
图3为扩增后，TH基因rs2070762多态性位点的酶切图谱。其中，泳道1表示T/T基因型；泳道2表示T/C基因型；泳道3表示C/C基因型；M表示Marker，即标准电泳图谱。
具体实施例方式
本发明通过大量的实验研究，提供了一种内含子中具有特定单核苷酸多态性的TH基因(NCBI Gene数据库登记号为7054)，本发明的基因与在NCBI中登记号为7054的TH基因相比，为内含子中具有特定单核苷酸多态性的基因，具体地，rs2070762多态性位点的等位基因为C。此多态性位点已被世界权威的生物医学数据库-美国国立卫生研究院(NCBI，http://www.ncbi.nlm.nih.gov)收录，位于酪氨酸羟化酶基因第13个内含子内，为C/T的多态性，即位于SEQ ID NO1所示序列的6701个核苷酸处；另外，如图2所示，图中加黑的C/T为TH基因rs2070762多态性位点，前后分别为其侧翼序列，侧翼序列(flanking sequence)分别参见SEQ IDNO2和SEQ ID NO3。此多态性位点在人类基因组上能被唯一确定。此外由于该序列位于内含子区域，没有改变氨基酸的编码，因此它无氨基酸的改变编码。
本领域普通技术人员已知，所谓“基因多态性”指的是在人群中，各个体基因的核苷酸序列存在的差异。本领域普通技术人员已知，本发明所述的多态性位点为单核苷酸多态性(SNP)位点，即基因组序列中单个核苷酸发生改变；核苷酸序列的差异可以体现在DNA水平上或者RNA水平上，所以，本发明的TH基因可以体现在DNA水平，RNA水平上，优选DNA水平，更优选基因组DNA。
这里所说的“易感基因”是指决定易于罹患某种(某类)疾病的基因。原发性高血压易感基因的携带者表现为携带易感基因的个体患原发性高血压的危险因素增大。
本发明采用在遗传学研究中具有更大把握度的关联研究，其通过检测遗传标记在正常对照人群与疾病人群之间存在的频率分布差异，识别易感基因的位置。具体地，在本发明的一个实施方式中，单因素分析发现(参见实施例2)，rs2070762多态性位点C等位基因在病例组中的频率显著高于对照组(P＝0.005)，多态性位点rs2070762位于内含子区，可能参与酪氨酸羟化酶基因在细胞内表达的调节或与可变剪切有潜在的关联，因而在高血压疾病预测预报和针对酪氨酸羟化酶的新药开发中具有很大的应用。
本发明还提供了一种检测本发明的内含子中具有特定单核苷酸多态性的TH基因的方法。本领域技术人员已知，可以用多种技术在DNA水平上体外检测TH基因序列的多态性位点。可以经与用放射性标记的反义RNA或DNA探针与扩增后的DNA序列杂交，以鉴别点多态性。也可以基于已知的核苷酸顺序的改变，合成正常的和具有特定单核苷酸多态性的PCR引物，在聚合酶链式反应(PCR反应)的底物中加入荧光标记的核苷酸，根据反应产物中有无荧光出现，确定在扩增所用的引物中有无碱基变化，从而检测特定单核苷酸多态性。通过DNA直接测序可以直接揭示对照基因和携带具有特定单核苷酸多态性基因之间的序列差异。当与PCR结合使用时，这种方法的灵敏性大大提高。各种DNA及DNA片段的核苷酸序列的测定也可用常规方法如双脱氧链终止法(Sanger等人，PNAS，1977，745463-5467)。此外，核苷酸序列测定也可用商业测序试剂盒或自动测序仪等。常规的自动测序法用放射性标记或荧光标记来确定核酸序列。也可以采用限制性片段多态性分析(RFLP)来体外检测TH基因序列的多态性位点。
限制性片段长度多态性分析方法的原理为由于基因具有特定单核苷酸多态性，导致限制性内切酶酶切位点改变、消失或产生新的位点，若用某种限制性内切酶酶切基因组DNA，则酶切后产生与正常基因组不同长度的DNA片段，检测这DNA片段的大小和数量，判断是否具有特定单核苷酸多态性。优选该方法与PCR技术结合(PCR-RFLP)，方法是在设计PCR扩增实验时，引物位于基因多态性部位的两侧，先将目的基因扩增，使其易于检测，由于特定单核苷酸多态性引起已有的限制性内切酶位点改变，则可先用相应的限制性内切酶酶切扩增产物，再进行琼脂糖凝胶电泳观察，根据产物片段大小或数量与正常对照作出判断。本发明中优选检测所述TH基因rs2070762多态性位点的多态性的方法为聚合酶链式反应与限制性片段长度多态性分析相结合。
本发明同时也为获得原发性高血压相关基因提供了一个新的思路。目前寻找疾病相关疾病的方法多为寻找结构基因的变化。而本发明从一个侧面说明不仅基因的编码区具有特定多态性可以导致蛋白质水平具有特定多态性，进而导致患原发性高血压的危险因素增大，而且在非编码区的特定单核苷酸多态性，也可以导致患原发性高血压的危险因素增大。在本发明中就是TH基因的内含子中具有特定单核苷酸多态性。
本发明还提供了一种体外筛查原发性高血压相关基因的方法，该方法包括(1)针对潜在的功能性单核苷酸多态性位点，进行原发性高血压患者和对照组之间的关联研究；(2)确定统计学上具有显著差异的单核苷酸多态性位点。
为进一步从遗传学的角度探讨TH基因和原发性高血压发病之间的关系，并为国内外已有的同类研究提供遗传流行病学的证据，本实施例运用PCR-RFLP的国际通行的基因分型方法，在收集到的大样本原发性高血压病例(n＝503)对照(n＝490)研究中，体外检测来自待测个体的样品中rs2070762位点的多态性，从而分析rs2070762位点在原发性高血压患者和正常对照人群的分布差异。经过本发明的大量实验研究，本发明确定具有rs2070762多态性的TH基因为原发性高血压相关基因；而TH基因内含子区rs2070762多态性位点为C等位基因时的rs2070762多态性位点为原发性高血压的易感位点；rs2070762多态位点为C等位基因的TH基因为原发性高血压的易感基因。
另一方面，本发明还提供了一种体外检测待测样品中是否存在原发性高血压相关基因的易感位点的方法，该方法包括1)提取待测样品的DNA，针对TH基因rs2070762多态性位点设计引物进行PCR扩增；2)对所述的PCR产物进行分析；3)鉴定TH基因rs2070762多态性位点是否为C。
所述待测样品可以从来自试验者的细胞获得，如来自血液、尿、唾液、胃液、头发，活组织检查和尸体解剖材料的细胞。优选来自血液。
对所述的PCR产物进行分析的方法可以采用前述关于检测本发明的内含子中具有特定单核苷酸多态性的TH基因的方法中提到的任何一种方法，例如，包括但不限于，利用放射性标记进行检测，利用荧光标记进行检测，直接测序进行检测，采用限制性片段多态性分析(RFLP)进行检测。优选对所述的PCR产物进行分析的方法为聚合酶链式反应与限制性片段长度多态性分析相结合。
在一个实施方式中，对所述PCR产物进行分析的方法为聚合酶链式反应与限制性片段长度多态性分析相结合(PCR-RFLP)。将包含目的SNP位点的PCR产物用特定的限制性内切酶作酶切，则包含有该SNP位点的个体会产生切成两个或三个或切不动三种情况。在本发明中对于rs2070762多态性位点，采用PCR扩增后，获得了196个碱基长的PCR产物，对该196个碱基长的PCR产物选用PstI限制性内切酶进行酶切，因为rs2070762位点的等位基因为C时在产物序列上存在一个PstI酶切位点，当切割后会产生122bp和74bp两种长度的片段，而当rs2070762位点的等位基因为T时，产物序列上无PstI酶切位点，酶切后产物序列长度不变，仍然为196碱基。所以，当同时存在196、122和74bp三种长度的片段时，说明rs2070762位点的等位基因型为C/T杂合子；当只存在196bp片段时，说明rs2070762位点等位基因T；当只存在122bp和74bp片段时，说明rs2070762位点等位基因C。(具体参见实施例1)。
另一方面，本发明提供了一种体外预测待测个体原发性高血压危险性的方法，该方法包括体外检测来自待测个体的样品中rs2070762多态性位点的多态性，其中rs2070762位点C等位基因携带者原发性高血压的危险显著增加。优选所述待测个体为中国汉族。本发明通过大样本的统计分析，在排除实验误差的基础上，以确凿的实验证据证明了rs2070762多态性位点C等位基因在病例中的分布显著高于对照组(P＝0.005)，rs2070762多态性位点与高血压的紧密相关性(参见实施例2)；此外，rs2070762多态性位点C等位基因携带者患原发性高血压的风险平均为非携带者的2.66倍，也就是说，增加了一倍多。(参见实施例3)。
本领域普通技术人员已知，对所述的PCR产物进行分析的方法可以采用前述关于检测本发明的内含子中具有特定单核苷酸多态性的TH基因的方法中提到的任何一种方法，例如，包括但不限于，利用放射性标记进行检测，利用荧光标记进行检测，直接测序进行检测，采用限制性片段多态性分析(RFLP)进行检测。优选对所述的PCR产物进行分析的方法为聚合酶链式反应与限制性片段长度多态性分析相结合。
在本发明大样本的统计分析的基础上，可以单独使用本发明的方法，即检测来自待测个体的样品中rs2070762多态性位点的多态性，以体外预测待测个体患原发性高血压危险性。
另一方面，本发明提供一种体外检测内含子中具有单核苷酸多态性的TH基因的试剂盒。所述试剂盒内可以装有一个或多个容器，容器内装有用以检测含有rs2070762多态性位点的TH基因的一种或多种组分。按照具体检测方法及检测多态性位点的不同，试剂盒可含有不同组分。与之同时提供的可以是经政府药物管理机构审核的、有关药品或生物制品制造、使用及销售的信息。在本发明的一个实施方式中，提供一种体外检测内含子中具有单核苷酸多态性的TH基因的试剂盒，该试剂盒包含(1)扩增rs2070762多态性位点的引物；(2)PCR扩增酶及相应缓冲液；(3)检测rs2070762多态性位点的试剂。
本领域普通技术人员已知，所述扩增多态性位点的引物，可以依据本发明已知的核苷酸序列设计，通常为15-30个碱基，GC含量为45％-50％左右，在适当的温度下与模板特异性结合，其可以利用专门的计算机程序设计，例如(Oligo 6.53软件)。如本发明实施例1所示，提供一种扩增rs2070762多态性位点的引物引物序列 序列号正向5’CCTTCCTTCTGGCCTTGAGCAG 3’SEQ ID NO4反向5’TGTCAGCACCTCCAAGACTGG 3’ SEQ ID NO5本领域普通技术人员已知，PCR扩增的酶可以为Tag DNA聚合酶、Klenow片段、Tth DNA聚合酶、VENT DNA聚合酶等能够用于PCR扩增的酶。试剂盒中检测rs2070762多态性位点的试剂根据检测方法的不同而不同。例如，采用聚合酶链式反应与限制性片段长度多态性分析相结合方法来检测rs2070762多态性位点时，试剂盒中可以含有限制性内切酶和相应的酶切图谱，例如PstI限制性内切酶和相应的酶切图谱。
本发明的检测内含子中具有单核苷酸多态性的TH基因的试剂盒可以用于体外检测原发性高血压相关基因的多态性。
为了更清楚地理解本发明，现参照下列实施例及附图进一步描述本发明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。实施例中未注明具体条件的实验方法为本领域熟知的常规方法和常规条件，例如参见Sambrook等人，《分子克隆实验手册》(New YorkCold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造商所建议的条件。
实施例1、rs2070762多态性位点的检测方法rs2070762多态性位点可通过PCR与限制性片段长度多态性方法结合进行检测。
1.rs2070762多态扩增片段的获得使用聚合酶链反应(PCR)获得rs2070762多态扩增片段(196bp)，PCR反应在ABI公司的9700型PCR仪上完成；每板PCR加待测样品DNA模板(取自被检测的对象，按照常规方法将白细胞内的DNA用苯酚-氯仿法或者用盐析法提取出来即可)对照反应以及不加DNA样本的空白对照反应各2例。扩增所用引物和扩增条件见表2和表3，其中所用Taq酶为宝生物公司出品的HotStart Taq酶，适宜于Touch-down方法。
表2、rs2070762多态性位点检测引物

表3、rs2070762多态性位点PCR扩增体系和扩增条件

2.限制性片段长度多态性方法鉴定rs2070762多态基因型成功扩增含有rs2070762多态性位点的DNA片段后，首先使用商品PCR产物纯化板(例如Millipore MultiScreenTMPCR，Millipore公司)按照厂家推荐步骤进行产物纯化。纯化后的产物用PstI限制性内切酶(MBI公司)进行酶切，从凝胶电泳图谱即可分辨出此位点的基因型。rs2070762多态酶切反应在37度恒温培养箱中进行，酶切体系和酶切条件见表4。
表4、rs2070762多态酶切体系和酶切条件

3.琼脂糖凝胶电泳检查酶切产物在浓度为2.5％的琼脂糖凝胶(称量普通琼脂糖粉7.5克，溶于300毫升0.5X的TB液中，加热至澄清透明，室温放置约2分钟，加入25微升EB，振荡混匀，室温放置晾干)中电泳酶切产物，电压180伏，电泳时间为1小时。
结果如图3所示，当rs2070762多态性位点出现T等位基因时，电泳为196bp的条带(泳道1)；出现C/T等位基因时，电泳为196、122、74bp三条带(泳道2)；出现C等位基因时，电泳为122bp和74bp的两条带(泳道3)。
实施例2、rs2070762多态性位点与人类原发性高血压的相关性1.病例对照样本临床特征描述，参见表5。
表5、病例对照样本临床特征描述

数值为均值±标准差。NS，无统计学意义；BMI，体重指数。
2.rs2070762多态性位点在病例对照样本中的频率分布采用实施例1中方法，分别对上述病例(n＝503)和对照(n＝490)的rs2070762多态性位点进行分析，并对结果进行统计分析，结果见表6。
表6、rs2070762多态在病例对照样本中的频率分布

结果如表6所示，rs2070762多态性位点C等位基因在病例中的分布显著高于对照组(P＝0.005)，由于本研究按照严格的标准挑选样本，在生活的地域环境，年龄，性别等方面进行了匹配，尽可能排除了非遗传因素对统计分析结果的影响，所以统计分析说明了rs2070762与人类原发性高血压密切相关。
实施例3、rs2070762多态性位点对于原发性高血压的相对危险性1.研究对象中rs2070762多态性位点对于原发性高血压的相对危险性采用实施例1中的方法对rs2070762多态性位点进行分析，并进一步进行统计分析(使用SAS软件包，多元logistic回归分析)，结果见表7。
表7、rs2070762多态对于原发性高血压的相对危险性

结论如表7所示，在调整了原发性高血压传统的危险因素BMI，甘油三酯和血糖后，rs2070762多态性位点C等位基因携带者发生原发性高血压的相对危险性显著升高，即在其它条件一样的情况下，此位点携带C等位基因患原发性高血压的风险平均为非携带者的2.66倍，也就是说，增加了一倍多。
实施例4体外检测TH基因rs2070762多态性位点的试剂盒体外检测TH基因的试剂盒，该试剂盒包含1.扩增rs2070762多态性位点的引物引物序列 序列号正向5’CCTTCCTTCTGGCCTTGAGCAG 3’SEQ ID NO4反向5’TGTCAGCACCTCCAAGACTGG 3’ SEQ ID NO52.PCR扩增酶及相应缓冲液Tag DNA聚合酶，10X缓冲液，dNTP；3.检测rs2070762多态性位点的试剂PstI内切酶及其缓冲液。
并在试剂盒的使用说明中指出可以按照实施例1所述的方法进行检测。
应理解，在阅读了本发明的上述描述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，但改动或修改的等价形式同样落在本申请权利要求书所限定的范围内。
序列表<110>北京诺赛基因组研究中心有限公司中国医学科学院阜外心血管病医院中国科学院生物物理研究所<120>具有特定单核苷酸多态性的TH基因及其检测方法和用途<130>GBI05CN0323<160>5<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>7876<212>DNA<213>智人<220>
<221>misc_feature<222>(6701)..(6701)<223>n＝c或t<400>1cggacctcca cactgagcca tgcccacccc cgacgccacc acgccacagg ccaagggctt 60ccgcagggcc gtgtctgagc tggacgccaa gcaggcagag gccatcatgg taagagggca120ggtaggtgcc cggcggccgc agtggaccgg agcccagggc tggtgccagc tgcctctgct180actccccagc ctggctggca gccccaggct cagggtccat gcaaacccct gggacgcggc240gtggatgtgg aggcctgggc acagcggcat cccctgtgcc tggtgtttga gtccctgttg300ggggagggtg aggtgatgcc tgtccctgtg tgtgcccctc ttaggccgac ctctctcggg360ggtcgtgtgg gtctctgtgt cttgtttcat cttgaatctt aacgatcgga atgtggaaac420aaatccatcc aaaaaatcca agatggccag aggtccccgg ctgctgcacc cagcccccac480cctactccca cctgcccctg cctccctctg ccccagctgc cctagtcagc accccaacca540gcctgcctgc ttggggaggc agccccaagg cccttcccag gctctagcag cagctcatgg600tggggggtcc tgggcaaata gggggcaaaa ttcaaagggt atctgggctc tggggtgatt660
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<223>引物<400>4ccttccttct ggccttgagc ag 22<210>5<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>5tgtcagcacc tccaagactg g 2权利要求
1.一种内含子中具有特定单核苷酸多态性的TH基因，该基因与在NCBI Gene数据库中登记号为7054的TH基因相比，rs2070762多态性位点的等位基因为C。
2.如权利要求1所述的内含子中具有特定单核苷酸多态性的TH基因，该基因为原发性高血压易感基因。
3.一种检测如权利要求1所述的内含子中具有特定单核苷酸多态性的TH基因的方法，该方法为聚合酶链式反应与限制性片段长度多态性分析相结合。
4.一种体外筛查原发性高血压相关基因的方法，该方法包括(1)针对潜在的功能性单核苷酸多态性位点，进行原发性高血压患者和对照组之间的关联研究；(2)确定统计学上具有显著差异的单核苷酸多态性位点。
5.如权利要求4所述的体外筛查原发性高血压相关基因的方法，所述原发性高血压相关基因为rs2070762位点具有单核苷酸多态性的TH基因。
6.一种体外检测待测样品中是否存在原发性高血压相关基因的易感位点的方法，该方法包括1)提取待测样品的DNA，针对TH基因rs2070762多态性位点设计引物进行PCR扩增；2)对所述的PCR产物进行分析；3)鉴定TH基因rs2070762多态性位点是否为C。
7.如权利要求6所述的体外检测待测样品中是否存在原发性高血压相关基因的易感位点的方法，其中步骤(2)中对所述的PCR产物进行分析的方法为聚合酶链式反应与限制性片段长度多态性分析相结合。
8.一种体外预测待测个体原发性高血压危险性的方法，该方法包括体外检测来自待测个体的样品中TH基因rs2070762位点的多态性，其中rs2070762位点C等位基因携带者患原发性高血压危险性比非携带者显著增加。
9.如权利要求8所述的体外预测待测个体原发性高血压危险性的方法，其中检测来自待测个体的样品中TH基因rs2070762位点的多态性的方法为聚合酶链式反应与限制性片段长度多态性分析相结合。
10.一种体外检测内含子中具有单核苷酸多态性的TH基因的试剂盒，该试剂盒包含1)扩增rs2070762多态性位点的引物；2)PCR扩增酶及相应缓冲液；3)检测rs2070762位点多态性的试剂。
全文摘要
本发明涉及一种内含子中具有特定单核苷酸多态性的TH基因及其检测方法。本发明还涉及检测原发性高血压相关基因的方法。本发明还涉及体外检测待测样品中是否存在本发明的原发性高血压相关基因的易感位点的方法及体外预测待测个体原发性高血压相对危险性的方法。本发明最后涉及检测内含子中具有单核苷酸多态性的TH基因的试剂盒。
文档编号C12N15/12GK1891822SQ200510080578
公开日2007年1月10日 申请日期2005年7月5日 优先权日2005年7月5日
发明者顾东风, 李彪, 陈恕凤, 陈润生, 张鹏华 申请人:北京诺赛基因组研究中心有限公司, 中国医学科学院阜外心血管病医院, 中国科学院生物物理研究所