Sirt1在预防、控制或治疗肥胖中的用途的制作方法

专利名称：：Sirt1在预防、控制或治疗肥胖中的用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及生物技术和医药领域，具体涉及一种新的可作为预防、控制或治疗肥胖的耙点的蛋白。
背景技术：
：目前肥胖的发病率正在逐年增加，据统计全球目前有3亿人患肥胖症，13亿人超重。肥胖是体内脂肪堆积过多和/或分布异常的一种状态。1997年，世界卫生组织(WHO)将肥胖明确宣布为一种疾病。肥胖症作为一种全身内分泌代谢疾病，不但影响体态和活动，而且与高脂血症、动脉粥样硬化、冠心病、糖尿病、癌症、痛风、脂肪肝、内分泌失调、肺泡低换气综合征、胆囊炎等密切相关，以及抵抗力低下而易感染，故有损健康和有碍延寿。一般来说，能量的获得大于消耗时促进发胖。体内有许多调节机制促进进食与产热，进而调节体脂量，使人们保持正常体重。当这些调节机制异常时，能量平衡状态被打破，导致肥胖发生。经过研究目前有近200个肥胖相关基因被发现。所述的机制主要包括以下几个方面①主要作用于下丘脑的生物因子:神经内分泌递质神经肽Y(NPY)、阿片促黑激素皮质素原(POMC)、黑色素细胞刺激素(a-MSH)、AgRP、增食因子(orexin)、5-羟色胺、肠道分泌的脑肠肽，脂肪细胞分泌的痩素等；交感神经、下丘脑-垂体-肾上腺轴等反馈机制均能调节机体能量平衡。②主要作用于外周脂肪细胞的调节因子有肿瘤坏死因子a、解偶联蛋白(UCP)、还可通过激活或抑制脂肪细胞上的e3-肾上腺素受体和过氧化物酶增殖物激活受体Y(PPAR-Y)及其转录共激活因子(PGC-1)调节体脂目前开发的减肥药物分为三大类抑制食欲的药物、增加能量消耗的药物和抑制肠道消化吸收的药物。减肥西药的研究集中在肾上腺素能药物，该药物直接作用于中枢神经系统(CNS)，起到抑制食欲减少摄食的作用；5-羟色胺受体激动剂，这类药物作用于CNS的5-羟色胺受体，增加饱腹感而起到抑制食欲的作用；单胺再摄取抑制剂，西部曲明是该类药物的代表，它能减少摄食，增加产热；脂酶抑制剂，奥利司他是该类药物的代表，它能抑制胰腺和胃肠中的羧基脂酶及磷脂酶A2活性，从而抑制肠道对脂肪的吸收，降低体内脂肪储存而减轻体重。然而，目前市场上很多减肥药物在药物疗效和安全性方面还无法保证。目前对减肥药的开发主要集中在干扰中枢神经系统的正常通路，因而极易引起副作用。因此，需要寻找新的减肥作用靶点，最好是通过直接作用于脂肪细胞因子来实现减肥。目前鉴于PfAR激动剂的研究开发也是减肥药筛选的新思路，开发了AD9677、CP-331、679等二十余种药物，它们对P3-AR具有高度选择性，在动物模型中效果肯定。另外，多酚类物质减肥作用的研究也小有成果，现已经开发出减肥保健品茶多酚(EGCG)。研究发现，长期服用茶多酚(4g/d)不仅可以减少体内脂肪的积累，而且对促进肝脏中脂质的代谢都有促进作用。但其缺点是作用时间长。综上所述，现在仍然缺少一种理想的减肥作用靶点以及针对该靶点的有效的、作用时间短、安全性好的减肥药物。
发明内容本发明的目的在于提供白藜芦醇的用途，用于提高脂肪组织或脂肪细胞中Sirtl蛋白、PGC-1蛋白、或UCP-l蛋白的表达量。本发明的另一目的在于提供一种组合物，所述的组合物含有有效量的白藜芦醇，以及食品学或药学上可接受的载体。本发明的另一目的在于提供Sii"tl基因或蛋白的用途，用于制备减肥的食物或药物；或筛选减肥的食物或药物。在本发明的第一方面，提供白藜芦醇的用途，用于制备提高Sirtl蛋白、PGOl蛋白、或UCP-1蛋白的表达量的组合物。在本发明的一个优选例中，所述的组合物同时提高Sirtl蛋白、PGC-l蛋白、和UCP-1蛋白的表达量。在本发明的另一优选例中，所述的表达量的提高为比正常表达量提高10%;更优选的，比正常表达量提高20%;进一步优选的，比正常表达量提高30%;最优选的，比正常表达量提高50%或更高。在本发明的另一优选例中，所述的组合物含有0.01—49.9mg白藜芦醇/剂。在本发明的第二方面，提供一种组合物，所述的组合物含有有效量的白藜芦醇，以及食品学或药学上可接受的载体。在本发明的另一优选例中，所述的组合物为单元剂型，含有白藜芦醇0.01—49.9mg/剂。在本发明的另一优选例中，所述的组合物的剂型为口服制剂，更佳地为颗粒剂、胶囊、片剂、粉末剂、口服液、混悬液、或乳剂。在本发明的另一优选例中，所述的药学上或食品上学可接受的载体或赋形剂选自填充剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、泡腾剂、矫味剂、包覆材料、膳食制品、或缓/控释剂。在本发明的另一优选例中，含有白藜芦醇0.01-4.9mg/剂；更优选的，含有白藜芦醇0.05—4.0mg/剂；进一步优选的，含有白藜芦醇0.1—3.0mg/剂；最优选的，含有白藜芦醇0.2—2.0mg/剂；比如，可含有白藜芦醇0.5mg/剂，0.8mg/剂，1.0mg/剂，1.5mg/剂，1.8mg/剂，或2.0mg/剂。在本发明的另一优选例中，含有白藜芦醇6-49.9mg/剂；更优选的，含有白藜芦醇8—45mg/剂；进一步优选的，含有白藜芦醇12—35mg/剂；进一步更优选的，含有白藜芦醇15—30mg/剂；最优选的，含有白藜芦醇18—25mg/剂；比如，可含有白藜芦醇20mg/剂，22mg/齐IJ，24mg/剂，或25mg/剂。在本发明的另一优选例中，每天服用1剂、2剂、或3剂本发明组合物。在本发明的第三方面，提供所述的组合物的用途，其特征在于，用于提高Sirtl蛋白、PGC-l蛋白、或UCP-l蛋白的表达量。在本发明的另一优选例中，所述的组合物用于同时提高Sirtl蛋白、PGC-1蛋白、和UCP-1蛋白的表达量。在本发明的第四方面，提供一种减肥的方法，给予受试者有效量的白藜芦醇。在本发明的另一优选例中，给予受试者0.01—49.9mg/剂的白藜芦醇。在本发明的第五方面，提供一种Sirtl基因或蛋白的用途，用于(i)制备预防、控制或治疗肥胖或肥胖相关疾病的食物或药物；或(ii)筛选预防、控制或治疗肥胖或肥胖相关疾病的食物或药物。在本发明的另一优选例中，所述的肥胖相关疾病包括但不限于体内脂肪积累导致的疾病、糖尿病、脂肪肝、肝脏肥大、脂质代谢异常等。在本发明的第六方面，提供一种筛选增加Sirtl蛋白表达的物质(进而作为减肥候选物质)方法，包括步骤(a)在测试组中，向表达Sirtl蛋白的体系中添加待筛选的候选物，并检测Sirtl蛋白的表达情况；(b)将步骤(a)测试组中Sirtl蛋白的表达情况与添加所述候选物的对照组中Sirtl蛋白的表达情况进行比较，如果测试组中Sirtl蛋白的表达在统计学上多于(优选明显多于，比如多10%,更优选地多20%，最优选的多30%或更多)对照组，就表明该候选物是增加Sirtl蛋白表达的物质。在本发明的另一优选例中，所述的表达Sirtl蛋白的体系为细胞，动物模型、或溶液体系。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。图1显示了白藜芦醇(RV)对小鼠体重的影响。其中，低脂表示低脂肪词料对照组；高脂表示高脂肪饲料对照组；RV(L)表示白藜芦醇给药浓度为2.5mg/kg/d;RV(H)表示白藜芦醇给药浓度为25mg/kg/d。图2显示了高脂组小鼠与高脂+低剂量白藜芦醇组小鼠的对比照片。图3显示了HPLC检测反式或顺式白藜芦醇含量示意图，并且随着天数的不同而不同。图4显示了低剂量和高剂量的反式白藜芦醇含量的量化统计比较。图5显示了低脂组、高脂组、高脂低剂量白藜芦醇组和高脂高剂量白藜芦醇组小鼠体内脂肪含量的变化。图6显示了低脂组、高脂组、高脂低剂量白藜芦醇组和高脂高剂量白藜芦醇组小鼠体内脂肪率的变化。图7显示了高脂组、高脂低剂量白藜芦醇组小鼠的腹部解剖图，可见高脂低剂量白藜芦醇组小鼠的白色脂肪组织明显比高脂对照组有明显减少。图8显示了在高倍镜(X200)下观察褐色脂肪(BAT)切片，可见高脂白藜芦醇干预组小鼠脂肪细胞比高脂组明显变小。图9显示了在高倍镜(X200)下观察腹部脂肪(IWAT)切片，显示高脂且白藜芦醇干预组小鼠的脂肪细胞比高脂组明显变小。图IO显示了在高倍镜(X200)下观察附睾脂肪(EWAT)切片，显示高脂且白藜卢醇干预组小鼠的脂肪细胞比高脂组明显变小。图ll显示了低脂组、高脂组、高脂低剂量白藜芦醇组和高脂高剂量白藜芦醇组小鼠能量摄入量的比较。图12显示了正常状态下低脂组、高脂组、高脂低剂量白藜芦醇组小鼠的体温变化。图13显示了饥饿状态下低脂组、高脂组、高脂低剂量白藜芦醇组的小鼠体温变化。图14显示了低脂组、高脂组、高脂低剂量白藜芦醇组小鼠的褐色脂肪细胞线粒体电镜图(X8400倍)。图15显示了低脂组、高脂组、高脂低剂量白藜芦醇组小鼠的白色脂肪细胞线粒体电镜图(X8400倍)。图16显示了低脂组、高脂组、高脂低剂量白藜芦醇组小鼠的褐色脂肪线粒体面积统计。图17显示了低脂组、高脂组、高脂低剂量白藜卢醇组小鼠的白色脂肪线粒体面积统计。图18显示了小鼠脂肪组织中，SIRT1、PGC-1、PTP-1B和UCP1蛋白的表达情况。图19显示了低脂组、高脂组、高脂低剂量白藜芦醇组、高脂高剂量白藜芦醇组小鼠的脂肪组织中，SIRT1、PGC-1、PTP-1B和UCP1蛋白的灰度的统计。图20显示了3T3-L1细胞中，SIRT1、PGC-l蛋白的变化。图21显示了原代脂肪细胞中，SIRT1、PGC-1蛋白的变化。具体实施例方式本发明人经过广泛的研究，发现白藜芦醇能够显著地提高脂肪组织或脂肪细胞中Sirtl(sirtuin1)蛋白、过氧化物酶体增殖物激活受体Y共激活因子-1(PGC-1)蛋白、和解偶联蛋白-1(UCP-l蛋白)的表达量。此外，本发明人还首次发现，低剂量的白藜芦醇就可显著提高Sirtl蛋白、PGC-1蛋白、或UCP-1蛋白的表达量，进而提供良好的减肥效果，并且低剂量的效果明显好于高剂量。基于此完成了本发明。白黎卢醇(Resveratrol，Res)，化学名称为芪三酚(3，4，，5，-三羟基芪)，分子式CmH,203，分子量228.25，反式白黎芦醇(有活性)如式(I)所示，顺式白黎芦醇(无活性)如式(II)所示。目前己知有70多种植物中含有白藜芦醇，其中在葡萄、花生、桑椹以及中药虎帐中含量特别丰富。它是一种活性非黄酮类多酚化合物，呈白色针状晶体，难溶于水，能溶于乙醇、乙酸乙酯，丙酮等极性强的溶剂中；以游离态(顺式、反式)和糖苷结合态(顺式、反式)两种形式存在，反式白藜芦醇在光照条件下容易变成顺式白藜芦醇。因此，可将白藜芦醇或含有白藜芦醇的制剂装在具有避光作用的容器中，比如棕色瓶中。迄今为止的研究表明，白藜芦醇具有抗肿瘤、抗氧化、抗心血管疾病、抗细菌、抗炎、抑制血小板凝集、调节免疫、化学预防等作用。白藜芦醇可以降低血清中胆固醇及甘油三酯的含量。但是，白藜芦醇的以往的研究集中于降低心血管疾病发病率、抗肿瘤、抗氧化等方面的研究，目前还没有其关于减肥方面的研究报道。且由于它是一种天然植物中含有的物质，因此安全性高。本发明证实了白藜芦醇具有良好的减肥效果，因此其可以作为一种安全可靠的减肥制品。在本发明中，对于制备白藜芦醇的方法没有特别的限制，比如其可以提取自植物，或者可以采用化学合成的方法来制备。一种优选的方法是从植物中提取白藜芦醇，所述的植物包括但不限于葡萄、花生、桑椹、或中药虎杖。为了研究白藜戸醇的减肥效果，本发明人首先利用高脂食物诱导肥胖小鼠，建立肥胖模型。通过给水口服方式用白藜芦醇对肥胖鼠进行干预。经过喂养后，对给药组与高脂肪对照组进行外形、体重、生理生化等指标的比较，验证白藜卢醇的减肥效果。进一步地，本发明人还研究了白藜芦醇减肥的机制。首先验证白藜芦醇干预后的小鼠体重减轻的部位为脂肪组织，之后在能量摄入和能量消耗两方面进行了减肥效果的研究。排除了减肥作用是由于抑制食欲而引发后，进一步通过检测体温的变化，发现给药后的小鼠产热增加。继而通过检测脂肪组织中产能细胞器线粒体的增加、生热相关蛋白的变化进一步验证了小鼠产热确实有所增加。根据上述试验结果证实白藜芦醇通过促进脂肪组织中Sirtl、PGC-1、UCP1蛋白表达，提高小鼠产热，加快能量消耗，提高脂肪代谢率，从而达到减肥的效果。因此，本发明提供了白藜芦醇的用途，用于提高脂肪组织或脂肪细胞中Sirtl蛋白、PGC-l蛋白、或UCP-l蛋白的表达量。本发明人首次发现，白藜芦醇可以提高脂肪组织或脂肪细胞中Sirtl蛋白、PGC-1蛋白、或UCP-1蛋白的表达量。而Sirtl蛋白、PGC-1蛋白、或UCP-1蛋白是脂肪代谢相关的蛋白，因此，白藜芦醇可通过提高这些蛋白的表达来促进脂肪的代谢，从而达到减肥的目的。在本发明的一种优选方式中，白藜芦醇能够同时提高Sirtl蛋白、PGC-1蛋白、和UCP-l蛋白的表达量。在本发明的一种优选方式中，白藜芦醇通过提高Sirtl蛋白的表达，从而增加了PGOl蛋白的表达，从而引起动物产热增加，达到减肥的效果。本发明还提供了一种组合物，所述的组合物含有有效量的白藜芦醇，以及食品学或药学上可接受的载体。如本文所用，术语"含有"或"包括"包括了"包含"、"基本上由......构成"、和"由......构成"。如本文所用，术语"药学上可接受的"或"食品学上可接受的"的成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即有合理的效益/风险比的物质。如本文所用，术语"有效量"是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。如本文所用，术语"药学上可接受的载体"指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟矢口的。在Remington'sPharmaceuticalSciences(MackPub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、泡腾剂、润湿剂或乳化剂、矫味剂、pH缓冲物质等。本发明的组合物中，白藜芦醇也可以以"生理学可接受的盐"或"生理学可接受的酸或碱衍生的盐"形式使用。此外，还可以使用含有白藜芦醇的提取物或混合物。如本文所用，术语"本发明的组合物"包括药物组合物、食物组合物和/或膳食添加剂。如本文所用，术语"单元剂型"是指为了服用方便，将本发明的组合物制备成单次服用所需的剂型，包括但不限于各种固体剂(如片剂)、液体剂、胶囊剂、缓释剂。所述的单元剂型中含有对于提高Sirtl蛋白、PGC-1蛋白、或UCP-l蛋白的表达量有效的本发明的组合物；或者含有对于减肥有效的本发明的组合物。本发明中，当将所述的组合物制备成单元剂型时，含有白藜芦醇0.01—49.9mg/剂；在本发明的一种优选方式中，含有白藜芦醇0.01-4.9mg/剂；更优选的，含有白藜芦醇0.05—4.0mg/剂；进一步优选的，含有白藜戸醇0.1—3.0mg/剂；最优选的，含有白藜芦醇0.2—2.0mg/剂；比如，可含有白藜芦醇0.5mg/剂，0.8mg/剂，1.0mg/齐U，1.5mg/剂，1.8mg/剂，或2.0mg/剂。在本发明的另一种优选方式中，所述的单元剂型含有白藜芦醇6-49.9mg/剂；更优选的，含有白藜芦醇8—45mg/剂；进一步优选的，含有白藜戸醇12—35mg/剂；进一步更优选的，含有白藜芦醇15—30mg/剂；最优选的，含有白藜芦醇18—25mg/剂；比如，可含有白藜芦醇20mg/剂，22mg/剂，24mg/剂，或25mg/剂。所述的组合物每天服用的剂量在1-5剂为宜；优选的为1剂、2剂、或3剂；最优选的，每天服用的剂量为l剂。上述剂量可根据体重进行适当增减。本发明的组合物可直接用于预防、缓解或治疗肥胖，或可与其它药物或膳食添加剂共同使用。本发明还提供了一种Sirtl基因或蛋白的用途，用于制备减肥的食物或药物；或筛选减肥的食物或药物。在本发明的一种方式中，可釆用通过基因工程手段制备的重组的Sirtl基因或蛋白。本发明也可采用经修饰或改良的Sirtl基因或蛋白，比如，可采用为了促进其半衰期、有效性、代谢、和/或蛋白的效力而加以修饰或改良的Sirtl蛋白。所述经过修饰或改良的Sirtl蛋白可以是一种共轭物，或其可包含被取代的或人工的氨基酸。所述经过修饰或改良的Sirtl蛋白可以是与天然存在的Sirtl蛋白具有较小的共同点，但也能预防、控制或治疗哺乳动物的肥胖，且不会带来其它不良影响或毒性。也就是说，任何不影响Sirtl基因或蛋白的生物活性的变化形式都可用于本发明中。在本发明一种方式中，可将所述的Sirtl蛋白直接给药于哺乳动物(比如人)，或者，可将编码Sirtl蛋白的基因通过常规的方法克隆到适当的载体中，将所述的载体导入到可表达所述Sirtl蛋白的细胞中，使所述的细胞表达Sirtl蛋白。优选的，可将编码Sirtl蛋白的基因或携带所述基因的载体通过常规的方法引入到靶细胞中实现Sirtl蛋白的表达。所述的靶细胞包括但不限于脂肪细胞、前脂细胞等。由于本发明人第一次将Sirtl蛋白表达的升高与肥胖相关联，因此，本发明还提供了一种筛选增加Sirtl蛋白表达的物质方法，即建立Sirtl蛋白表达系统，在该系统中加入候选物质，判断候选物质对于Sirtl蛋白表达量的影响。如果Sirtl蛋白的表达在统计学上多于对照组，就表明该候选物是增加Sirtl蛋白表达的物质。所述物质可作为一种有潜力的减肥药物。因此，本发明还包括通过所述筛选方法获得的增加Sirtl蛋白表达的物质。本发明还提供了一种减肥的方法，给予受试者有效量的白藜芦醇。在本发明的一种优选方式中，给予受试者白藜芦醇的量为0.01—4.9mg/60kg体重/天；更优选的，给予受试者白藜芦醇的量为0.05—4.0mg/60kg体重/天；进一步更优选的，给予受试者白藜芦醇的量为0.1—3.0mg/60kg体重沃；最优选的，给予受试者白藜芦醇的量为0.2—2.0mg/60kg体重/天；比如，每剂可给予受试者白藜芦醇的量为0.5mg/60kg体重/天、0.8mg/60kg体重/天、l.Omg/60kg体重/天、或1.5mg/60kg体重/天。在一天中，可以将所述的量单次给予或多次给予。在本发明的另一种优选方式中，给予受试者白藜芦醇的量为6—49.9mg/60kg体重/天；更优选的，给予受试者白藜芦醇的量为8—45mg/60kg体重/天；进一步更优选的，给予受试者白藜芦醇的量为12—35mg/60kg体重/天；最优选的，给予受试者白藜芦醇的量为15—30mg/60kg体重/天；比如，每剂可给予受试者白藜芦醇的量为20mg/60kg体重/天、22mg/60kg体重/天、或24mg/60kg体重/天。在一天中，可以将所述的量单次给予或多次给予。本发明的主要优点在于-(1)首次提出并证实白藜芦醇可用于减肥，发现低剂量的白藜芦醇就具有良好的减肥效果，并且低剂量的效果明显好于高剂量。(2)首次提出SIRT1可以作为预防、控制或治疗肥胖的靶蛋白，白藜芦醇可以上调SIRT1蛋白的表达水平。(3)由于白藜芦醇是一种非常昂贵的物质，因此，本发明的低剂量的白藜芦醇大大降低了减肥药物或减肥食品的成本。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室指南(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。实施例l白藜芦醇的配制采用的白藜芦醇原料购自Sigma公司，商品号R5010。1.配制用于后续试验的25mg/L白藜芦醇溶液将25mg白藜戸醇配制于1L的洁净水中。2.配制用于后续试验的250mg/L白藜芦醇溶液将250mg白藜戶醇配制于1L的洁净水中。3.配制用于人类的白藜卢醇的食物组合物、保健品或药物组合物。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>采用常规的配制组合物的方法配制上述的白藜芦醇的食物组合物或药物组合物。实施例2白藜芦醇的减肥作用本实施例的目的是要验证白藜芦醇的减肥效果，因此本发明人建立了肥胖鼠模型，一般用于实验研究的肥胖动物模型按照病因主要分为5类遗传性肥胖、营养性肥胖、缺少活动性肥胖、内分泌性肥胖和下丘脑性肥胖模型。在人类，肥胖患者多为单纯性肥胖(约占肥胖人群总数的95%)，而目前所建立的遗传性肥胖模型如ob/ob，db/db，fa/fa等基因突变的动物模型在人类仅有个例报道，本实施例通过建立营养性肥胖小鼠模型以模拟人类肥胖的主要模式，从而对单纯性肥胖的药物治疗进行研究。首先利用高脂食物诱导肥胖小鼠，建立肥胖模型。通过给水口服方式用白藜芦醇对肥胖鼠进行干预。经过18周喂养后，对给药组与高脂肪对照组进行外形、体重、生理生化等指标的比较，验证白藜芦醇的减肥效果。实验动物雄性C57BL/6J小鼠，购自中国科学院上海实验动物中心(斯莱克实验动物有限公司)。饲料配方低脂肪含量饲料脂肪4.3gm%(10kcal%);高脂肪含量饲料脂肪24gm%(45kcal%)。1.髙脂饮食诱导肥胖小鼠模型的建立32只小鼠按照体重随机分为四组①低脂对照组8只，平均体重18.65g;②高脂对照组8只，平均体重18.31g;③高脂低浓度给药组8只，平均体重18.99g;④高脂高浓度给药组8只，平均体重18.46g。四组小鼠平行饲养。小鼠三周断奶后进入实验室，均给予普通饲料。适应环境一周后按照下述给水和喂食方法饲养。低脂对照组给予低脂饲料、洁净水，能够自由取食、饮水。高脂对照组及高脂给药组均给予高脂饲料，高脂对照组的饮水给予洁净水，高脂低浓度给药组的饮水给予含白藜芦醇25mg/L的洁净水、高脂高浓度给药组的饮水给予含白藜芦醇250mg/L的洁净水。每组动物均可以自由取食、饮水。实验室温度2125T:，相对湿度4070%，昼夜比12:12。每周三次投食，记录投食量和撤食量，每周称体重一次，并记录。喂养18周。2.干预用药白藜芦醇分子式(:14仏203，购自sigma公司，批号R5010。干预剂量及方法低浓度2.5mg/kg/d，高浓度25mg/kg/d各干预组小鼠将药物溶于适量纯净水(每只小鼠日摄水量约为3mL)。采用自然饮水口服给药方法，经过HPLC检测验证，两天换药一次，可以保持药效不失活。对照组小鼠仅给予洁净水。3.动物取血及组织样品采集实验前动物禁食12小时，实验时首先称量动物体重，测量肛门体温；依照体重值注射适量戊巴比妥钠(40mg/kg)，待麻醉后取血lmL/只，血样离心(14000rpm，10min，4。C)取血清，每份血清各分两管，一部分用于测量血脂等生化指标，一部分-8(TC保存用于测胰岛素含量；之后解剖腹腔，灌注生理盐水剥离四组小鼠的腹部白色脂肪组织(IWAT)、附睾脂肪组织(EWAT)、褐色脂肪组织(BAT)，生理盐水冲洗后将各组织块分为两份，一份用于冰冻切片的组织固定准备切片，另一份直接液氮速冻后-8(TC保存。4.冰冻切片将所取小块脂肪组织分别用4y。多聚甲醛(PFA)固定，PBS冲洗后依次用10%、20%、30%浓度的蔗糖溶液脱水，最后经OCT包埋后冻存准备进行切片。切片厚度为5uM，切片后晾干、苏木精伊红(HE)染色，每个标本取2-4张切片，在200倍显微镜下观察视野中脂肪细胞的大小。结果1.白藜芦醇可抑制高脂饮食诱导的小鼠体重增加本实施例参考国内外报道的高脂、高能词料喂养小鼠(参见Hildebrandt，A.L.等，AntiobesityeffectsofchroniccannabinoidCBlreceptorantagonisttreatmentindiet-inducedobesemice.EuropeanJournalofPharmacology2003.462:125-132;或Chen,L等，Nyomba.GlucoseIntoleranceandResistinExpressioninRatOffspringExposedtoEthanolinUtero:ModulationbyPostnatalHigh-FatDiet.Endocrinology.2003,144:500-508;或Bagnasco,M.等，LeptinExpressionInHypothalamicPvnReversesDietaryObesityAndHyperinsulinemiaButStimulatesGhrelin.ObesRes.2003.11:1463-1470)。按照实验方法所述饲养18周，得到体重变化曲线如图l所示。从高脂对照组和高脂低浓度给药组中各取得体重接近组内平均体重的小鼠拍照，结果如图2，可以看到外形上的变化。由图l可以看出，低脂对照和高脂对照组相比，喂养四周后体重有明显差异，说明模型建立是成功的。而高脂对照组与给药组相比，喂养10周时低浓度组开始出现显著性差异(P〈0.05):高脂肪对照组平均体重增加14.83克，低浓度给药组增加10.63克；此时，高浓度给药组体重增加12.39克，和高脂肪对照组无明显差异。低脂对照组中平均体重增加7.71克。高浓度给药组在喂养14周时开始有显著性差异高脂肪对照组平均体重增加17.69克，高浓度给药组体重增加13.79克；此时，低浓度给药组增加13.50。低脂对照组中平均体重增加7.71克。由此说明，白藜卢醇具有良好的减肥效果，并且低剂量的减肥效果好于高剂量。2.白藜卢醇的给药方式可以有效减缓其变性白藜芦醇是一种见光易变性的多酚类化合物，其有效形式为反式结构(trans-resveratrol)，当反式结构的白藜芦醇受光照10小时后，80%都变性为顺式结构(cis-resveratrol)，而顺式结构没有药力效果。因此，本发明人在实验中对白藜卢醇的处理方式进行检测。采用铝箔包裹装有含白藜芦醇的饮用水，然后通过饮用水给药。本发明人通过HPLC的方法检测经过避光处理的白藜芦醇在第2天和第3天的有效成分。结果如图3，图4。图3所示HPLC测定结果表明，在实验条件下，经过避光处理后的白藜芦醇可以减缓反式结构变为顺式结构的速度。图4的量化统计发现，白藜芦醇分别放置2天和3天后，低浓度白藜芦醇中反式结构的残余量仍高达97.68%和95.41%，与原液浓度相比没有显著性差异；高浓度白藜芦醇中的残余量也达到92.06%和74.73%，与原液浓度的比值分别出现显著性差异，*P<0.05，**P<0.01。由此说明，试验中对白藜芦醇的处理是有效的，可以保证实验的可靠性。3.白藜芦醇通过抑制脂肪的积累达到防治肥胖的效果本发明人还进一步检测了小鼠体重减轻是由哪个或哪些组织的重量减轻引起的，以及减少的成份是脂肪、其它器官还是体液。本发明人利用核磁共振仪检测了活体小鼠体内脂肪含量的变化。结果如图5，图6所示。由图5和图6可见，与高脂对照组与低脂对照组相比，脂肪含量有显著性的增加，再次证明实验中建立的肥胖小鼠模型是可靠的。低浓度给药组与高脂对照组相比，脂肪含量减少约5g，且有显著性差异(P〈0.01)。结合图l显示体重的变化可以看出，低浓度给药组的体重变化量较高脂对照组大约也是5g左右。提示白藜芦醇的体重减轻部位是在脂肪组织，证实了它的减肥效果。图6所示的脂肪率的变化趋势与图5所示的脂肪含量变化趋势相同。此外，喂养18周后，进行腹部解剖发现，腹部脂肪以及内脏大网膜脂肪都有明显减少，其他组织器官未见明显变化，如图7所示。由图7可见，低浓度给药组的白色脂肪组织明显较高脂对照组有明显减少，为了进一步确认脂肪细胞是否发生变化，进一步作了白色脂肪组织和褐色脂肪组织的冰冻切片HE染色，高倍镜(X200倍)下观察腹部脂肪(IWAT)、附睾脂肪(EWAT)、褐色脂肪(BAT)细胞数目和体积的变化，结果如图8、图9、图10所示。图8、图9、图10中不同组间脂肪细胞的大小和数目存在明显差异(HEX200)，高脂对照组的大型脂肪细胞数明显多于低脂对照组，小型及中型细胞少；白藜芦醇的高、低两浓度给药组中观察到的肥胖小鼠大型脂肪细胞数明显减少，小型和中型细胞数增加；低浓度变化趋势与高浓度相同，且比高浓度的变化更显著。与前面关于脂肪含量测定结果相符。此外，本发明人还采用了比2.5mg/kg/d更低剂量(如1.0mg/kg/d、L5rag/kg/d)的白藜芦醇试验肥胖小鼠，结果发现，低剂量的白藜芦醇具有良好的降脂、减肥的作用。本实施例中，选用断奶后的C57BL/6J小鼠分别用高脂饲料喂养三组和低脂饲料喂养一组，其中白藜芦醇(高、低两种浓度分别采用给水口服的方式)干预其中两组高脂喂养组。通过十八周的喂养，发现白藜芦醇干预后可降低肥胖小鼠体重，而通过对脂肪含量的检测发现，减重的部位就是脂肪组织，且从脂肪细胞的冰冻切片图可以看出，脂肪细胞大小也有显著变化。同时，白藜芦醇干预后对血清总胆固醇、血清低密度脂蛋白等指标均有明显的影响，以上结果均显示出白藜卢醇有较好的减肥作用。从实验结果来看，白藜芦醇的干预浓度为2.5mg/kg/d或该浓度以下时对于鼠的减肥效果较好。根据一般的换算规律，换算为人用量，则服用药量为约在0.1-15mg/60kg/d。与以往报道的减肥药物茶多酚、脂酶抑制剂CT-II等比较而言，白藜戸醇可以通过较少的使用量达到减肥效果(其中，茶多酚(EGCG)减月巴齐lj量为4g/d(JonesJR等，DeletionofPPARgammainadiposetissuesofmiceprotectsagainsthighfatdiet-inducedobesityandinsulinresistance.PNAS.2005，102(17):6207-12);脂酶抑制剂CT-II减肥剂量为50g/d(MYamamoto.Anti-obesityeffectsoflipaseinhibitorCT-II，anextractfromedibleherbs,NomameHerba，onratsfedahigh-fatdiet.Internationaljournalofobesity.2000,24:758-764);大麻的CBl受体抑制剂Rimonabant的减肥剂量为0.5g/d(B.Poirier等，Theanti-obesityeffectofrimonabantisassociatedwithanimprovedserumlipidprofile.Diabetes,obesityandmetabolism.2005,7:65-72))。动物实验中发现小鼠服用白藜芦醇后除以上检测指标变化外，其它表型均未发现不正常，由此证实白藜芦醇浓度安全性的假设即白藜芦醇来源于植物中，是一种天然化合物，产生副作用的可能性很低。目前常用的减肥药副作用较大、治疗周期长、减肥效果一般(一般减重不超过体重的5%)而且价格昂贵，所以白藜芦醇作为一种新型的副作用小、服用剂量低(因而可有效降低成本)的减肥药，有很广阔的市场开发前景。试验中白藜芦醇干预浓度选用两种，其中低浓度为在自然状态下水溶液中的溶解值，高浓度为10倍于低浓度的浓度。从试验结果上看，低浓度的减肥效果反而优于高浓度，如体重变化、脂肪含量、脂肪细胞大小等。从而证实药物效果并非浓度越大越好。随着年龄增加，人类体内的总体脂量及相对脂量增加，肥胖的发病率增高。在本实施例中，从造模开始到小鼠处死共18周，随着鼠龄的增加，高脂对照组小鼠发生肥胖的趋势也逐渐增加，因此在肥胖的发病过程中，年龄也是一个不可忽视的因素。白藜芦醇的干预可以抑制高脂肪饮食诱导产生的肥胖，但随着鼠龄的增长，体重仍会继续增加，但增加幅度较高脂肪对照组有明显减缓。实施例3白藜戸醇减肥机理通过体内和体外试验对白藜戸醇的减肥机理进行初步研究。肥胖是由于能量摄入与消耗不平衡所导致的，因此本实施例主要集中在白藜芦醇干预后的小鼠在能量摄入和消耗的变化。通过体内试验观察能量摄入、产热、线粒体变化以及体内体外试验检测产能相关蛋白PGC-1和UCP1的变化，结果表明，白藜芦醇的减肥作用不是通过影响能量摄入，而是通过增加SIRT1、PGC-1或UCP1的表达，进而提高能量消耗而实现的。实验动物雄性C57BL/6J小鼠32只，3周龄，体重1619克，购自中国科学院上海实验动物中心(斯莱克实验动物有限公司)。主要仪器AL104型电子天平，Mettler公司DT-1TB型电子体温计，上海华辰医用仪表有限公司LKB-I型超薄切片机，LEICA公司CM-120透射电镜，PHILIPS公司主要试剂白藜芦醇购自Sigma公司，商品号R5010一抗Anti-PGC-l(H-300)，购自SANTACRUZ公司，货号sc-13067Anti-UCP1，购自CHEMICON公司，货号AB3038Anti-PTP-1B，购自UPSTATE公司，货号07-088Anti-Sirtl，购自UPSTATE公司，货号05-707二抗Anti-Mouse、Anti-Rabbit,购自Jackson公司主要方法1.摄能统计每周三次投食，记录投食量与撤食量以计算摄食量，根据食物热量含量可换算出摄能量。2.体温的测定体温计测量肛温，测定方法如MasakiT等，Peripheral,butnotcentral,administrationofadiponectinreducesvisceraladiposityandupregulatestheexpressionofuncouplingproteininagoutiyellow(Ay/a)obesemice.Diabetes.2003,52(9):2266-73中的相关方法。3.电镜观察线粒体实验方法参考《细胞试验指南》，科学出版社，黄培堂等译(2003)中第1161-1194页所述的方法。4.Western检测蛋白含量实验方法参考《抗体技术实验指南》，科学出版社，沈关心、龚非力等译(2002)中第161-184页所述的方法。结果1.小鼠能量摄入与消耗的检测(1)白藜戸醇不影响小鼠能量的摄入营养物质能量的吸收、储存和消耗构成了一个十分复杂的体内平衡系统，从而保持相对恒定的能量储备和体重。当能量摄入大于能量消耗即产生脂肪堆积，引起肥胖。因此，首先本发明人通过记录小鼠摄食量，比较四组实验小鼠的能量摄入情况，见图11。如图11所示，实验观察小鼠试验后14周能量摄入情况。通过将14周的摄能累计进行比较，可以看到低脂对照组的摄能量少于高脂饲料喂养的三组。高脂对照组与给药组相比摄能量几乎相同。说明给药干预并未影响小鼠饮食及摄能情况。(2)白藜芦醇增加小鼠的产热由于减肥的同时不影响能量摄入，那么必定与增加能量消耗有关。因此实验继续对小鼠产热能力进行了检测，采用测量体温的方法测试产热变化。结果如图12、图13所示。图12中检测了小鼠在正常状态下的体温，柱状图可以看出低脂对照组和高脂对照组的体温相差不大；给药组体温较高脂对照组升高约0.8°C，有显著性变化(P<0.02)。进一步检测白藜芦醇干预后对适应性产热的影响，试验中将小鼠禁食12小时如图13所示，检测体温发现，四组小鼠的体温比照正常状态时均有所下降。其中高脂对照组比低浓度给药组的体温大约低rC(P〈0.02)。结果显示白藜芦醇干预后小鼠的产热较对照组有显著性增加，此外还增加了适应性产热。提示其减肥作用是通过增加能量消耗产生减肥效果。结合前面发现减肥作用位置在脂肪组织，因此下面试验观察小鼠脂肪细胞中提供能量的细胞器一一线粒体的变化。(3)白藜芦醇干预后小鼠线粒体增多电镜观察小鼠白色脂肪和褐色脂肪细胞中线粒体的变化，如图14、图15。统计视野中线粒体所占面积比例，作柱状图量化线粒体体积的变化，如图16、图17所示。从电镜照片观察可见，褐色脂肪和白色脂肪在各组间的变化趋势相同。低脂肪对照组线粒体数目多、总面积大，而高脂对照组的线粒体数目少，总面积小，同时脂滴面积及数目较低脂对照组有明显增加，与冰冻切片结果相符。低浓度给药组的线粒体数目比低脂对照组少，但比高脂对照组明显增多。统计线粒体面积可见，白藜芦醇低浓度干预后的给药组，褐色脂肪线粒体的面积较高脂对照组增加一倍(P〈0.05),白色脂肪线粒体面积增加约一倍(P〈0.05)。结果提示，给药后的小鼠脂肪细胞中的产能细胞器一一线粒体有显著增加，进一步证明了白藜芦醇可能增加高脂肪饲养小鼠的产能功能。2.检测与产能相关蛋白的变化(1)白藜芦醇促进脂肪组织产能蛋白的表达肥胖从根本上讲是能量相对摄入量与能量消耗间平衡失调的结果。造成机体能量失调的原因非常复杂，随着分子生物学技术的发展，目前已经发现多个与肥胖相关的基因，目前研究热点集中在PGC-1、UCP1等蛋白。本试验为进一步探讨产能可能的分子机制，检测了脂肪组织中很多相关蛋白表达。如图18所示。图18中用Western检测四组小鼠脂肪组织中Sirtl、PGC-1、UCP1、PTP-IB蛋白的表达，结果发现，白藜芦醇干预后Sirtl、PGC-1、UCP1的表达较高脂对照组有升高，统计条带灰度可以量化比较条带灰度的变化，如图19所示Sirtl、PGC-1、UCP1在给药组的表达较高脂对照组变化P〈0.05。结果提示白藜芦醇干预后的小鼠可以增加与生热相关蛋白的表达，这是它的减肥效果通路。即白藜芦醇通过激活Sirtl，从而增加了PGC-1的表达。PGC-1表达的增加在脂肪组织中可以促进解偶联蛋白UCP1的表达，从而引起动物产热增加达到减肥的效果。(2)脂肪细胞中与生热相关的蛋白变化为在细胞水平上进一步验证试验的设想，试验选用了3T3-L1前体脂肪细胞和原代培养的脂肪细胞，检测白藜芦醇刺激后Sirtl、PGC-1的变化，如图20和图21所示。如图所示，3T3-LI前体脂肪细胞和原代培养的脂肪细胞在不同浓度白藜芦醇刺激后，Sirtl和PGC-1蛋白表达量有相同的变化趋势随白藜芦醇的加入蛋白表达增多，在O.luM浓度时蛋白表达达到峰值；继续加大浓度到luM时，蛋白表达量急剧减少，甚至低于对照细胞中的表达量。根据常规的方法，将0.luM的浓度换算成人体(约60kg)的用量，则白藜芦醇的用量约在1.0mg-2mg之间效果较佳，可见低剂量的白藜芦醇通过促进Sirtl的表达，可达到良好的减肥效果。由此说明，白藜芦醇干预脂肪细胞在一定浓度范围内可以使Sirtl和PGC-1的表达量同步增加；同时并非浓度越大蛋白表达越多，低剂量效果反而更佳。本实施例以高脂饮食诱导的肥胖小鼠为基础，验证白藜芦醇的减肥效果。通过实施例2证实白藜芦醇在减轻体重、抑制脂肪积累、以及改善胰岛素敏感型等方面有作用。与以往报道有关白藜芦醇可以防止心血管疾病等报道相吻合。本实施例集中讨论白藜芦醇减肥作用的原因，一般来讲肥胖主要是由于能量摄入与能量消耗的不平衡引起的，因此本实施例主要检査了白藜芦醇干预后对能量摄入和消耗的影响。结果如图ll所示，白藜芦醇并不影响能量的摄入，若不影响能量摄入的同时还能产生体重减轻的现象则必然涉及到能量消耗的增多。为了验证上述论点，继续检测正常状态和饥饿条件下小鼠体温的变化，发现白藜芦醇干预后的小鼠产热增加，同时，观察电镜下脂肪细胞中线粒体的变化，发现其数目及体积也有显著的增加，因此提示白藜芦醇的减肥作用是通过诱导线粒体的生物合成增加而达到增加产热效果的。进一步研究白藜芦醇可能作用的靶蛋白时，选择了与产热相关的PGC-1、UCP1蛋白进行研究，WesternBlot实验证明脂肪组织中Sirtl、PGC-1、UCPl蛋白表达在受到白藜芦醇刺激后有明显增加。根据以往报道PGC-1在脂肪组织中的作用是促进线粒体的生物合成，且有增加产热和UCPl表达量的作用，此外，Sirtl和PGC-1在肝脏组织中曾经被证明有相互作用。因此提示白藜芦醇通过促进脂肪组织中Sirtl、PGC-1、UCPl蛋白表达，以提高产热，增加能量消耗，提高代谢率，从而起到减肥效果。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。权利要求1.白藜芦醇的用途，其特征在于，用于制备提高Sirt1蛋白、PGC-1蛋白、或UCP-1蛋白的表达量的组合物。2.如权利要求l所述的用途，其特征在于，所述组合物同时提高Sirtl蛋白、PGC-1蛋白、和UCP-l蛋白的表达量。3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的组合物含有0.01—49.9mg/剂白藜戸醇。4.一种组合物，其特征在于，所述的组合物含有0.01—49.9mg/剂的白藜芦醇，以及食品学或药学上可接受的载体。5.如权利要求4所述的组合物，其特征在于，含有白藜芦醇0.01—4.9mg/剂。6.如权利要求4所述的组合物，其特征在于，含有白藜芦醇6—49.9mg/剂。7.权利要求4-6任一所述的组合物的用途，其特征在于，用于提高Sirtl蛋白、PGC-1蛋白、或UCP-l蛋白的表达量；或用于制备预防、控制或治疗肥胖或肥胖相关疾病的食物或药物。8.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述组合物同时提高Sirtl蛋白、PGC-l蛋白、和UCP-l蛋白的表达量。9.一种Sirtl基因或蛋白的用途，其特征在于，用于(i)制备预防、控制或治疗肥胖或肥胖相关疾病的食物或药物；或(ii)筛选预防、控制或治疗肥胖或肥胖相关疾病的食物或药物。10.—种筛选增加Sirtl蛋白表达的物质方法，其特征在于，包括步骤(a)在测试组中，向表达Sirtl蛋白的体系中添加待筛选的候选物，并检测Sirtl蛋白的表达情况；(b)将步骤(a)测试组中Sir11蛋白的表达情况与添加所述候选物的对照组中Sirtl蛋白的表达情况进行比较，如果测试组中Sirtl蛋白的表达在统计学上多于对照组，就表明该猴选物是增加Sirtl蛋白表达的物质。全文摘要本发明公开了白藜芦醇的用途，用于提高脂肪组织或脂肪细胞中Sirt1蛋白、PGC-1蛋白、或UCP-1蛋白的表达量。本发明还公开了一种含有白藜芦醇的组合物。本发明首次提出并证实白藜芦醇可用于减肥。并且首次提出SIRT1可以作为预防、控制或治疗肥胖的靶蛋白，白藜芦醇可以上调SIRT1蛋白的表达水平。文档编号A23L1/30GK101095665SQ200610028219公开日2008年1月2日申请日期2006年6月27日优先权日2006年6月27日发明者史香林,芳张,翟琦巍申请人:中国科学院上海生命科学研究院