专利名称：经tat和nls多肽修饰的φc31整合酶蛋白及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属转基因技术领域，具体涉及一种新的经修饰的ΦC31整合酶及其在基因转移中的应用。
背景技术：
利用基因转移技术有效地将目的基因位点特异性地整合到哺乳动物细胞的基因组中，从而避免外源基因随机插入基因组，这是基因治疗和转基因动物研究中的未解决的重要问题。近年来应用逆转录病毒载体，对严重的重度复合免疫缺陷症(SCID-XI)的临床治疗取得了成功。随后有接受治疗的患者发生白血病癌变，主要是由于病毒载体的基因转移技术造成外源基因随机插入细胞染色体中，引起基因突变的结果(S.Hacein-Bey-Abina，et al.A serious adverse event after successful gene therapy for X-linked severe combinedimmunodeficiency.N.Engl.J.Med.2003，346，1185-1193)。为了增加基因转移的安全性，外源基因最好能特异性的定点整合到细胞基因组中安全的位点。目前存在的几种基因操作的方法，在基因转移途径的安全性方面都存在许多不足。病毒载体如腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒以及慢病毒载体，可以随机整合到宿主基因组中导致插入突变；非病毒载体如裸DNA载体也有随机整合的现象(J.Kimmelman.Recent developments in gene transferriskand ethics.B.M.J.2005，330，79-82)。非病毒载体如裸DNA质粒载体被认为是相对比较安全的，制备和应用简单的基因转移方法，但是也有潜在的载体DNA随机整合到细胞染色体引起基因突变的可能性，以及载体基因长期表达而造成对细胞的毒性；另外，质粒DNA的基因转移受不同细胞类型的影响，在有些细胞中只有很低的基因转移效率。
在哺乳动物细胞中，链霉菌噬菌体ΦC31整合酶被证明是可以与基因组DNA中特异性的序列进行反应的整合酶，它可以将外源基因稳定地整合到哺乳动物细胞基因组的那些特定的序列位点上，从而极大的降低了由于外源基因随机插入造成的基因突变风险。已被发现的ΦC31整合酶识别的细胞基因组特异性位点有一百多个，对整合位点的生物信息学分析表明它们有较好的安全性(T.W.Chalberg，et al.Integration specificity of phage phiC31integrase in the human genome.J Mol Biol.2006，357，28-48)，提示其作为在哺乳动物细胞中进行基因操作和基因治疗的一个有用的工具。有报道用裸DNA质粒载体的ΦC31整合酶的细胞学实验中发现，融合一段SV40病毒大T抗原的核定位信号(NLS，氨基酸序列为PKKKRKV，记为SEQ.NO4)，能够很好的提高ΦC31整合酶在哺乳动物细胞中的整合功能(S.Andress，et al.Enhanced efficiency through nuclear localization signal fusion 0n phage ΦC31-integraseactivity comparison with Cre and FLPe recombinase in mammalian cells.NucleicAcids Res.2002，30，2299-2306)，因而，为了更好地在哺乳动物细胞中应用ΦC31整合酶，对其进行修饰是必要的。
近年来新出现了一种利用有蛋白转导功能的多肽，如HIV-1病毒Tat蛋白的47-57位氨基酸组成的多肽(TAT，氨基酸序列为YGRKKRRQRRR，记为SEQ.NO5)，HSV病毒的VP22蛋白等，形成与目的基因融合的蛋白产物，直接转移进入细胞的蛋白转导技术。这种蛋白转导技术因为转移一个瞬时存在的，进入细胞中可降解的活性蛋白形式，因而极大的降低了其他基因转移途径的不利方面，如随机整合造成的插入突变和长期表达引起的毒性问题，因而具有更好的安全性。已有报道证明利用TAT融合的蛋白转导，几乎不受细胞类型的限制，能够以密度依赖性的方式进入所有的哺乳动物细胞和组织，甚至能够通过小鼠的血脑屏障(A.Ho，et al.Synthetic protein transduction domainsenhanced transduction petentialin vitro and in vivo.CancerRes.2001，61，474-477)。所以蛋白转导是一种新的可用于哺乳动物细胞中基因操作和基因治疗的新方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种经TAT和NLS多肽修饰的ΦC31整合酶蛋白及其制备方法和在细胞中的应用。
本发明一方面提供了一种具有表达载体并利用Ni离子亲和柱层析制备的ΦC31整合酶蛋白，其氨基酸序列为SEQ.NO1。
本发明另一方面设计并制备了经TAT修饰的ΦC31整合酶融合蛋白，其氨基酸序列为SEQ.NO2。
本发明再一方面是设计并制备了经TAT和NLS共同修饰的ΦC31整合酶融合蛋白，其氨基酸序列为SEQ.NO3。
本发明将上述三种蛋白与检测ΦC31整合酶功能的真核细胞系293-PB[EGFP]分别共同作用，构成检测修饰的ΦC31整合酶的蛋白转导功能和整合酶活性的系统。
本发明还提供了使用细胞免疫组织化学方法，对修饰的ΦC31整合酶进行亚细胞定位的分析系统。
本发明还提出了使用TAT和NLS修饰的ΦC31整合酶的蛋白作为在哺乳动物细胞中应用ΦC31整合酶的新途径，由于TAT融合ΦC31整合酶蛋白使其能够进入所有共同孵育的哺乳动物细胞中，从而大大提高了目的基因的转移效率。这种瞬时存在的蛋白形式和其特有的密度依赖性的作用方式，提高了它在哺乳动物细胞中的应用的安全性。利用NLS融合ΦC31整合酶蛋白促进更多的融合蛋白向细胞核内分布，提高了它在细胞基因组中定点整合的功能。本发明改进了应用ΦC31整合酶的其他基因转移途径的不足，是应用于基因操作和基因治疗领域的新的工具。
本发明提出的融合蛋白的制备和应用的方法，具体描述如下1.ΦC31整合酶蛋白的制备。
将ΦC31整合酶基因利用PCR反应扩增出来，以pCMV-ΦC31质粒为模板，在上游和下游的引物中分别加上限制性内切酶Nhe I和Xho I的识别序列，PCR产物经过这两个酶消化后，回收连接到同样经过酶切消化后的原核表达载体pET28b(+)上，得到pET28b-ΦC31重组质粒；重组质粒经过DNA测序分析正确后，转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株中，挑选5-8个阳性的菌落克隆在卡那霉素抗性的LB培养基中，用IPTG预诱导表达ΦC31整合酶蛋白；表达后的全菌蛋白用SDS-PAGE，考马斯亮兰R250染色，确定诱导表达的条件和阳性菌落克隆，然后在16-22℃，0.2mM IPTG条件下大量表达蛋白；诱导表达蛋白的细菌经过超声破碎菌体，释放出目的蛋白后，经过Ni离子鳌合的亲和层析柱纯化，纯化后的蛋白经过超滤浓缩为2mg/ml，存放在-70℃的冰箱中，经蛋白免疫印记实验和蛋白质N端测序证明，其氨基酸序列如SEQ.NO1所示。
2.TAT-ΦC31融合蛋白的制备。
TAT的核苷酸序列与ΦC31整合酶基因在PCR反应中被拼接在一起，然后如上述1所说的同样的方法克隆到原核表达载体pET28b(+)上，在测序鉴定正确以后，转化到BL21(DE3)菌株中，进行和上述1所说相同步骤的大量诱导表达纯化，最终得到TAT-ΦC31融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ.NO2所示。
3.TAT-ΦC31-NLS融合蛋白的制备。
NLS的核苷酸序列与TAT-ΦC31的序列在PCR反应中被拼接在一起，按照上述1所说的同样的方法，克隆，表达，纯化，浓缩制备得到TAT-ΦC31-NLS蛋白，其氨基酸序列如SEQ.NO3所示。
所有上述的制备三种ΦC31蛋白能够经ΦC31的抗体的蛋白免疫印记实验进一步证实(图1)。
4.不同的ΦC31蛋白分别与ΦC31整合酶功能检测细胞系293-PB[EGFP]共同孵育，检测它们的蛋白转导功能和整合酶的活性。
把来源于人类胚胎肾细胞的检测细胞系293-PB[EGFP]细胞接种在12孔细胞培养板上，当细胞密度达到50-70％时，分别在不同的孔中加入经0.2μM滤器过滤的ΦC31，TAT-ΦC31，TAT-ΦC31-NLS融合蛋白与细胞共同孵育3个小时，每组蛋白做3个孔的细胞平行实验，留一组3个孔的细胞作为阴性对照。孵育完毕后，除去培养液，用1倍的PBS溶液清洗细胞，加入正常的细胞培养液继续培养36个小时，然后荧光显微镜下观察，绿色荧光的细胞数目的多少代表ΦC31融合蛋白转导进入细胞后，催化细胞染色体上的特异性序列的重组反应的活性大小。为了定量说明ΦC31融合蛋白在哺乳动物细胞中的活性，我们用胰蛋白酶的溶液把各个样品细胞消化下来，经流式细胞仪分析每个样品中绿色荧光的细胞的比例，从而计算出不同ΦC31融合蛋白的重组效率和在哺乳动物细胞中的活性。
实验结果说明本发明的TAT融合ΦC31蛋白能够以密度依赖性的方式，经蛋白转导在哺乳动物细胞中表现整合酶的活性，在融合NLS后，这种功能得到进一步的增强(图2)，显示TAT融合ΦC31的蛋白是一个有效的，安全的，能在哺乳动物细胞染色体水平上进行基因操作的工具。
5.免疫组织化学分析证实TAT-ΦC31融合蛋白进入每一个孵育的细胞，融合NLS的TAT-ΦC31蛋白进入细胞核的水平明显增多。
把哺乳动物非洲绿猴肾细胞系COS-7细胞接种在铺有盖波片的12孔细胞培养板中，当细胞在波片上密度达到30-50％时，把ΦC31-TAT和ΦC31-TAT-NLS蛋白加入到细胞培养基中共同孵育3小时后，除去培养基，PBS清洗后换正常培养基培养细胞24小时，用免疫组织化学方法制备细胞标本。用4％多聚甲醛固定，0.2％TritonX-100处理细胞，马血清封闭后，以ΦC31专一性抗体反应，罗丹明标记的第二抗体显色ΦC31融合蛋白在细胞中的分布，最后用DAPI对细胞核染色，标本在蔡司公司的双光子激光共聚焦显微镜上观察照相，图像用Photoshop软件处理。结果说明TAT融合ΦC31的蛋白进入到每一个与其共孵育的细胞中，融合NLS的TAT-ΦC31蛋白进入细胞核的水平明显增多(图3)。
利用TAT融合ΦC31蛋白转导应用于哺乳动物细胞中DNA重组。包括融合蛋白的制备，及其在报告细胞系中细胞学效应的检测和细胞中的亚细胞定位，说明经TAT和NLS修饰的ΦC31整合酶将会应用在哺乳动物细胞中进行基因操作和基因治疗等领域的前景。考虑到病毒载体和质粒裸DNA载体在携带ΦC31整合酶应用方面存在潜在的不足，本发明提供的这种非病毒、非核酸形式，可以快速有效进入细胞发挥功能的经过修饰的TAT-ΦC31-NLS融合蛋白，是一个有效的，安全的，能在哺乳动物细胞染色体水平上进行基因操作的工具。
图1，设计修饰ΦC31融合蛋白及其纯化蛋白示意图。A为不同修饰的ΦC31融合蛋白的概括图；B为ΦC31融合蛋白的表达与纯化的SDS-PAGE检测图；C为制备的不同修饰的3种ΦC31融合蛋白；D为利用ΦC31的专一性抗体对3种ΦC31融合蛋白的免疫印记的结果。
图2，3种ΦC31融合蛋白在细胞系293-PB[EGFP]中应用与功能检测示意图。A为293-PB[EGFP]检测整合酶活性的系统示意图；B为不同浓度的TAT-ΦC31-NLS蛋白转导细胞后，荧光显微镜下的结果，其中打印显示的灰色细胞代表细胞是有绿色荧光的细胞；C为不同浓度的3种ΦC31融和蛋白转导细胞后，流式细胞仪检测绿色荧光阳性细胞的结果。
图3，在哺乳动物细胞COS-7中，TAT和NLS修饰的ΦC31蛋白转导的细胞定位情况。A为激光共聚焦显微镜检测TAT-ΦC31蛋白在细胞中分布；B为TAT-ΦC31与TAT-ΦC31-NLS蛋白转导的细胞定位比较图。其中打印显示的灰色部分代表ΦC31融合蛋白在细胞中的分布。
具体实施例方式
下面结合具体实例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，又如David等人，细胞实验指南(New YorkCold Spring HarborLaboratory Press，1998)中所述的条件。
1. 3种ΦC31融合蛋白的构建，表达，纯化3种ΦC31的融合蛋白的表达纯化采用基本相同的亲和层析方法，对它们不同的修饰表现在图1-A所示的标志中，其中6个组氨酸的多肽主要是为了Ni亲和下面主要其中一种为例说明其制备方案。
以pCMV-ΦC31(pCMVint)为模板，ΦC31的PCR扩增反应的条件引物1， (记为SEQ.NO6)，引物 (记为SEQ.NO.7)。此两段引物的5’端分别含有NheI和XhoI酶切位点(方框表示)，其后分别为目的基因5’端和3’端的编码序列，在50μl的反应体积中含有50mmol/LKCl，10mmol/L Tris-Cl，(pH8.5)，1.5mmol/L MgCl2，200μmol/L dNTP，10pmol引物，1U的pyrobest DNA聚合酶(TaKaRa公司产品)。在DNA热循环仪(Eppendorf公司)上按下列条件反应35个周期94℃，30秒；55℃，30秒；72℃，2分钟。扩增产物用博大泰克公司的DNA片断快速胶回收试剂盒纯化，用TaKaRa公司的DNA连接试剂盒连接到表达载体质粒pET-28b(+)(Novagen公司产品，Cat.No.69865.3)。用限制性内切酶NheI和XhoI分别对扩增的PCR产物和质粒pET-28(+)进行双酶切消化后，分别回收DNA片段，并用T4连接酶在16℃连接16小时后，连接产物用转化大肠杆细菌DH5α，在含卡那霉素(终浓度30μg/ml)的LB培养基的平板过夜后，对筛选的阳性克隆酶切鉴定后，并进行测序。DNA序列分析结果表明PCR产物代表的翻译后的氨基酸序列与SEQ.NO1.所示完全相同。然后将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)(Novagen公司产品)。在含卡那霉素(终浓度30μg/ml)的LB液体培养基中，宿主菌BL21(pET-28b-ΦC31)在37℃培养至对数生长期，加入IPTG到终浓度为0.2mM，18℃继续培养30小时。离心收集菌体，用超声波破菌仪破坏菌体，离心收集上清，用能与组氨酸多肽(6His-Tag)结合的亲和层析柱His-Bind Quick Cartridge(Novagen公司产品)进行亲和层析，得到了纯化的ΦC31融合蛋白。经SDS-PAGE电泳，在大约70kDa处得到一单一的条带(图1-B)。收集纯化的蛋白样品，利用Millipore公司的超滤柱浓缩ΦC31融合蛋白到2mg/ml，储存在-70℃冰箱中。
同样的方法被分别应用和制备TAT-ΦC31和TAT-ΦC31-NLS的融合蛋白。分别以pCMV-ΦC31(pCMVint)为模板，TAT-ΦC31的PCR反应的引物是 (记为SEQ.NO8)和 (记为SEQ.NO9)。TAT-ΦC31-NLS的PCR反应的引物是 (记为SEQ.NO10)和 (记为SEQ.NO11)。引物序列中的方框分别表示限制性内切酶NheI和XhoI位点。构建的pET-28b-TAT-ΦC31和pET-28b-TAT-ΦC31-NLS表达质粒，经DNA序列分析结果表明其中基因的翻译后的氨基酸序列与SEQ.NO2和SEQ.NO3所示完全相同。分别表达，纯化和浓缩得到TAT-ΦC31和TAT-ΦC31-NLS融合蛋白。
3种ΦC31的融合蛋白的SDS-PAGE检测结果如图1-C所示，利用ΦC31的专一性抗体的免疫印记结果如图1-D所示。
2. TAT-ΦC31融合蛋白转导哺乳动物报告细胞系293-PB[EGFP]人胚胎肾细胞293-PB[EGFP]单克隆报告细胞系由我们制备，在ΦC31整合酶作用下的反应过程见图2-A所示。接种细胞在含有1O％小牛血清的DMEM细胞培养液的12孔细胞培养板中，37℃，5％CO2细胞培养箱中培养。当细胞密度达到50-70％时，分别用5uM，10uM，15uM的三种ΦC31融合蛋白加入细胞培养液中与细胞共孵育3小时，PBS清洗后换上正常细胞培养液，36小时后观察。在荧光显微镜下有绿色荧光细胞则定性说明ΦC31融合蛋白转导在哺乳动物细胞中的DNA重组功能。荧光显微镜下的结果，其中打印显示的灰色细胞代表细胞是有绿色荧光的细胞(见图2-B)。用胰蛋白酶消化细胞，经流式细胞仪检测有绿色荧光的细胞数目，可以定量检测出ΦC31融合蛋白的活性和重组效率(见图2-C)。
3.细胞免疫组织化学方法检测TAT-ΦC31蛋白转导在哺乳动物细胞内的定位。
把哺乳动物非洲绿猴肾细胞系COS-7细胞接种在铺有盖波片的12孔细胞培养板中，当细胞在波片上密度达到30-50％时，把ΦC31-TAT和ΦC31-TAT-NLS蛋白加入到细胞培养基中共同孵育3小时后，除去培养基，PBS清洗后换正常培养基培养细胞24小时，用免疫组织化学方法制备细胞标本。用4％多聚甲醛固定，0.2％TritonX-100处理细胞，马血清封闭后，以ΦC31专一性抗体反应，罗丹明标记的第二抗体显色ΦC31融合蛋白在细胞中的分布，最后用DAPI对细胞核染色，标本在蔡司公司的双光子激光共聚焦显微镜上观察照相，图像用Photoshop软件处理。其中打印显示的灰色部分代表ΦC31融合蛋白在细胞中的分布，图3-A结果说明TAT融合ΦC31的蛋白进入到每一个与其共孵育的细胞中。免疫组织化学分析证实融合NLS的TAT-ΦC31蛋白进入细胞核的水平明显增多(图3-B)。
序列表SEQ.NO1.(ΦC31)MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMASRRVADMTQGVVTGVDTYAGAYDRQSRERENSSAASPATQRSANEDKAADLQREVERDGGRFRFVGHFSEAPGTSAFGTAERPEFERILNECRAGRLNMIIVYDVSRFSRLKVMDAIPIVSELLALGVTIVSTQEGVFRQGNVMDLIHLIMRLDASHKESSLKSAKILDTKNLQRELGGYVGGKAPYGFELVSETKEITRNGRMVNVVINKLAHSTTPLTGPFEFEPDVIRWWWREIKTHKHLPFKPGSQAAIHPGSITGLCKRMDADAVPTRGETIGKKTASSAWDPATVMRILRDPRIAGFAAEVIYKKKPDGTPTTKIEGYRIQRDPITLRPVELDCGPIIEPAEWYELQAWLDGRGRGKGLSRGQAILSAMDKLYCECGAVMTSKRGEESIKDSYRCRRRKVVDPSAPGQHEGTCNVSMAALDKFVAERIFNKIRHAEGDEETLALLWEAARRFGKLTEAPEKSGERANLVAERADALNALEELYEDRAAGAYDGPVGRKHFRKQQAALTLRQQGAEERLAELEAAEAPKLPLDQWFPEDADADPTGPKSWWGRASVDDKRVFVGLFVDKIVVTKSTTGRGQGTPIEKRASITWAKPPTDDDEDDAQDGTEDVAASEQ.NO2.(TAT-ΦC31)MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMASRRVADYGRKKRRQRRRMTQGVVTGVDTYAGAYDRQSRERENSSAASPATQRSANEDKAADLQREVERDGGRFRFVGHFSEAPGTSAFGTAERPEFERILNECRAGRLNMIIVYDVSRFSRLKVMDAIPIVSELLALGVTIVSTQEGVFRQGNVMDLIHLIMRLDASHKESSLKSAKILDTKNLQRELGGYVGGKAPYGFELVSETKEITRNGRMVNVVINKLAHSTTPLTGPFEFEPDVIRWWWREIKTHKHLPFKPGSQAAIHPGSITGLCKRMDADAVPTRGETIGKKTASSAWDPATVMRILRDPRIAGFAAEVIYKKKPDGTPTTKIEGYRIQRDPITLRPVELDCGPIIEPAEWYELQAWLDGRGRGKGLSRGQAILSAMDKLYCECGAVMTSKRGEESIKDSYRCRRRKVVDPSAPGQHEGTCNVSMAALDKFVAERIFNKIRHAEGDEETLALLWEAARRFGKLTEAPEKSGERANLVAERADALNALEELYEDRAAGAYDGPVGRKHFRKQQAALTLRQQGAEERLAELEAAEAPKLPLDQWFPEDADADPTGPKSWWGRASVDDKRVFVGLFVDKIVVTKSTTGRGQGTPIEKRASITWAKPPTDDDEDDAQDGTEDVAASEQ.NO3.(TAT-ΦC31-NLS)MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMASRRVADYGRKKRRQRRRMTQGVVTGVDTYAGAYDRQSRERENSSAASPATQRSANEDKAADLQREVERDGGRFRFVGHFSEAPGTSAFGTAERPEFERILNECRAGRLNMIIVYDVSRFSRLKVMDAIPIVSELLALGVTIVSTQEGVFRQGNVMDLIHLIMRLDASHKESSLKSAKILDTKNLQRELGGYVGGKAPYGFELVSETKEITRNGRMVNVVINKLAHSTTPLTGPFEFEPDVIRWWWREIKTHKHLPFKPGSQAAIHPGSITGLCK
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权利要求
1.一种ФC31整合酶蛋白，其特征在于氨基酸序列为SEQ.NO1。
2.一种经TAT修饰的ФC31整合酶蛋白，其特征在于氨基酸序列为SEQ.NO2。
3.一种经TAT和NLS多肽修饰的ФC31整合酶蛋白，其特征在于氨基酸序列为SEQ.NO3。
4.一种如权利要求1所述ФC31整合酶蛋白的制备方法，其特征在于具体步骤如下将ФC31整合酶基因利用PCR反应扩增出来，以pCMV-ФC31质粒为模板，在上游和下游的引物中分别加上限制性内切酶Nhe I和Xho I的识别序列，PCR产物经过这两个酶消化后，回收连接到同样经过酶切消化后的原核表达载体pET28b(+)上，得到pET28b-ФC31重组质粒；重组质粒经过DNA测序分析正确后，转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株中，挑选5-8个阳性的菌落克隆在卡那霉素抗性的LB培养基中，用IPTG预诱导表达ФC31整合酶蛋白；表达后的全菌蛋白用SDS-PAGE，考马斯亮兰R250染色，确定诱导表达的条件和阳性菌落克隆，然后在16-22℃，0.2mM IPTG条件下大量表达蛋白；诱导表达蛋白的细菌经过超声破碎菌体，释放出目的蛋白后，经过Ni离子鳌合的亲和层析柱纯化，纯化后的蛋白经过超滤浓缩为2mg/ml，存放在-70℃的冰箱中，经蛋白免疫印记实验和蛋白质N端测序证明，其氨基酸序列如SEQ.NO1所示。
5.一种如权利要求2所述的经TAT修饰的ФC31整合酶蛋白的制备方法，其特征在于具体步骤如下TAT的核苷酸序列与ФC31整合酶基因在PCR反应中被拼接在一起，以pCMV-ФC31质粒为模板，在上游和下游的引物中分别加上限制性内切酶Nhe I和Xho I的识别序列，PCR产物经过这两个酶消化后，回收连接到同样经过酶切消化后的原核表达载体pET28b(+)上，得到pET28b-TAT ФC31重组质粒；重组质粒经过DNA测序分析正确后，转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株中，挑选5-8个阳性的菌落克隆在卡那霉素抗性的LB培养基中，用IPTG预诱导表达ФC31整合酶蛋白；表达后的全菌蛋白用SDS-PAGE，考马斯亮兰R250染色，确定诱导表达的条件和阳性菌落克隆，然后在16-22℃，0.2mM IPTG条件下大量表达蛋白；诱导表达蛋白的细菌经过超声破碎菌体，释放出目的蛋白后，经过Ni离子鳌合的亲和层析柱纯化，纯化后的蛋白经过超滤浓缩为2mg/ml，存放在-70℃的冰箱中，经蛋白免疫印记实验和蛋白质N端测序证明，其氨基酸序列如SEQ.NO2所示。
6.一种如权利要求3所述的TAT和NLS修饰的ФC31整合酶蛋白的制备方法，其特征在于具体步骤如下NLS的核苷酸序列与TAT-ФC31的序列在PCR反应中被拼接在一起，以pCMV-ФC31质粒为模板，在上游和下游的引物中分别加上限制性内切酶Nhe I和XhoI的识别序列，PCR产物经过这两个酶消化后，回收连接到同样经过酶切消化后的原核表达载体pET28b(+)上，得到pET28b-TAT-ФC31-NLS重组质粒；重组质粒经过DNA测序分析正确后，转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株中，挑选5-8个阳性的菌落克隆在卡那霉素抗性的LB培养基中，用IPTG预诱导表达ФC31整合酶蛋白；表达后的全菌蛋白用SDS-PAGE，考马斯亮兰R250染色，确定诱导表达的条件和阳性菌落克隆，然后在16-22℃，0.2mM IPTG条件下大量表达蛋白；诱导表达蛋白的细菌经过超声破碎菌体，释放出目的蛋白后，经过Ni离子鳌合的亲和层析柱纯化，纯化后的蛋白经过超滤浓缩为2mg/ml，存放在-70℃的冰箱中，经蛋白免疫印记实验和蛋白质N端测序证明，其氨基酸序列如SEQ.NO3所示。
7.一种如权利要求2所述的经TAT修饰的ФC31整合酶蛋白在哺乳动物细胞染色体水平上作为基因操作工具的应用。
8.一种如权利要求3所述的经TAT和NLS修饰的ФC31整合酶蛋白在哺乳动物细胞染色体水平上作为基因操作工具的应用。
全文摘要
本发明属转基因技术领域，具体为一种新的经TAT和NLS修饰的ΦC31整合酶蛋白及其应用。其中包括经TAT修饰的ΦC31整合酶蛋白TAT－ΦC31，以及经TAT和NLS共同修饰的ΦC31整合酶蛋白TAT－ΦC31－NLS，实验表明这些融合蛋白可作为有效的、安全的能在哺乳动物细胞染色体水平上进行基因操作工具。
文档编号C12N15/09GK1896230SQ20061002802
公开日2007年1月17日 申请日期2006年6月22日 优先权日2006年6月22日
发明者张茂祥, 朱焕章, 陈金中, 薛京伦 申请人:复旦大学