一种基因工程菌、制备及其用途的制作方法

专利名称：一种基因工程菌、制备及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种基因工程菌，尤其是一种能够高效表达人谷氨酸脱羧酶65或者硫氧还蛋白—人谷氨酸脱羧酶65融合蛋白的基因工程菌，以及该基因工程菌的制备方法及其用途，属于生物工程技术领域。
背景技术：
糖尿病是一种严重的世界性疾病，发病率一直居高不下，目前全世界糖尿病患者总数近2亿，估计到2010年将上升到2.2亿，2025年将超过3亿。在这庞大的糖尿病人群中，约有10％是I型糖尿病病人，并且大多数是青年人。其余90％的II型糖尿病人群中也有一部分是成人隐匿性自身免疫糖尿病患者(LADA)，这些患者有从II型糖尿病转变为I型糖尿病的倾向，从II型糖尿病人群中诊断出这些LADA患者将有助于患者进行早期的干涉治疗。
谷氨酸脱羧酶65(Glutamate Decarboxylase 65，以下用略写为“GAD65”)是特异性催化L-谷氨酸脱羧生成γ-氨基丁酸的一种酶，由585个氨基酸组成，分子量约为65KD，广泛存在于中枢和周围神经系统中，在胰岛、睾丸、卵巢、胸腺和胃中也有表达，而在人类胰岛中只有GAD65表达。研究发现I型糖尿病是一种遗传易感个体通过自身抗原介导的免疫反应所引起胰岛β细胞破坏的自身免疫性疾病，GAD65是此免疫反应关健的始动靶抗原，针对GAD65的抗体GAD65-Ab早在I型糖尿病临床发作前几年或十几年就已经出现。迄今为止，GAD65-Ab是诊断I型糖尿病免疫指标中最有效和特异的一个。
所以，用GAD65来检测GAD65-Ab的存在可作为T1DM的预测和诊断手段；可应用于从T2DM患者中鉴别出隐匿性T1DM患者，使患者能够进行早期干预治疗；也可作为一种普查手段，用来发现T1DM的高危人群。
目前，采用从天然组织中分离纯化以及人工化学合成的方法获得大量人GAD65蛋白质是不现实的。国外已经有研究者尝试在兔网织红细胞、酵母细胞、昆虫细胞以及大肠杆菌等表达体系中尝试表达天然重组人GAD65，但发现存在以下几个缺点(1)人GAD65表达量很低，并且GAD65-Ab检测方法设备要求高，仅能用于实验室分析；(2)人GAD65的表达主要以包涵体形式表达，且很难进行正确的复性，导致蛋白质没有酶学活性和特异的针对I型糖尿病的免疫活性；(3)耗时费力，花费巨大，不适合中国国情。基于以上几个方面，迫切需要研制国产化的高效低价的能够广泛应用的制备人GAD65的方法。

发明内容
本发明的目的在于提供一种能用于制备人GAD65或者硫氧还蛋白—人谷氨酸脱羧酶65融合蛋白的基因工程菌。
本发明的另一目的在于提供成本低廉、高效表达的能用于制备人GAD65或者硫氧还蛋白—人谷氨酸脱羧酶65融合蛋白的基因工程菌的制备方法。
本发明的再一目的在于提供能生产人GAD65的基因工程菌的用途，并提供该基因工程菌生产人GAD65或者硫氧还蛋白—人谷氨酸脱羧酶65融合蛋白的方法。
本发明所述的能用于制备人GAD65或者硫氧还蛋白—人谷氨酸脱羧酶65融合蛋白的基因工程菌由重组质粒和宿主菌构成，其中宿主菌指的是大肠杆菌DH5α、BL21(DE3)或Rosetta-gami(DE3)中的任意一种，重组质粒指的是含GAD65基因的质粒pET-32a(+)。
本发明提供的基因工程菌的进一步特征在于所述的重组质粒是pET-32a(+)-PT7-TrxA-6×His-GAD65，其中，PT7是所述质粒pET-32a(+)的启动子；TrxA是硫氧还蛋白；6×His是组氨酸纯化标签。
本发明提供的一种高效表达重组人GAD65的基因工程菌的构建方法，包括设计Nest-PCR上游和下游引物，用PCR从人胰腺cDNA库中扩增人GAD65基因片断，并通过表达载体转化到大肠杆菌，其特征在于设计的PCR引物含肠激酶酶切位点，用PCR扩增的人GAD65基因片段经过限制型内切酶酶切，克隆到表达质粒pET-32a(+)中，构建成重组质粒pET-32a-GAD65，转化大肠杆菌BL21(DE3)中，获得高效表达重组人GAD65的基因工程菌。
具体说来，本发明的基因工程菌的构建方法，具体操作步骤如下第一步 引物的设计与合成根据已知人GAD65的cDNA序列，设计特异性的Nest-PCR上游引物A1、A2和下游引物B1，其中上游引物A2中引入KpnI限制性内切酶酶切位点和肠激酶酶切位点，下游引物B1中引入BamHI限制性内切酶酶切位点。
上游引物A15’-GCGACCTGCTCCAGTCTCCAAAG-3’上游引物A25’-TTAGGTACCGACGACGACGACAAGGCATCTCCGGGCTCT-3’KpnI 肠激酶酶切位点下游引物B15’-GCTGGATCCTGGAACAGCTTGGTGAGCA-3’BamHI
第二步 Nest-PCR扩增人GAD65DNA片段以人胰腺cDNA文库(购自Clontech)为模板，用高保真Pfu DNA聚合酶扩增GAD65，先用上述初级引物A1、B1进行PCR扩增得到初级扩增产物，再以初级扩增产物作模板，用上述次级引物A2、B1进行PCR扩增得到人GAD65DNA片段，电泳检测，纯化并回收备用。
第三步 构建含人GAD65基因序列的基因工程菌用两种限制性内切酶双酶切第二步获得的人GAD65 DNA片段，所述的两种限制性内切酶是KpnI和BamHI，纯化回收小片段，用同样两种限制性内切酶双酶切质粒pET-32a(+)，纯化回收大片段，连接上述回收的小片段和大片段，得含人GAD65DNA片段的重组质粒pET-32a-GAD65，将重组质粒pET-32a-GAD65转化到大肠杆菌DH5α，制得含人GAD65基因序列，即人GAD65 DNA基因工程菌，将该基因工程菌委托专业的生物技术公司测序，证实该基因工程菌含完整的重组人GAD65基因片段；第四步 构建高效表达人GAD65的基因工程菌从第三步构建好的基因工程菌抽提重组质粒pET-32a-GAD65，转化到大肠杆菌BL21(DE3)或Rosetta-gami(DE3)，得到高效表达的人谷氨酸脱羧酶65的基因工程菌。
上述构建涉及到的人胰腺cDNA文库、质粒pET-32a(+)，大肠杆菌DH5α、BL21(DE3)、Rosetta-gami(DE3)、限制性内切酶BamHI、KpnI和高保真Pfu DNA聚合酶均可从市场购得。委托合成所述得的引物序列和测序的生物技术公司是上海华诺生物技术有限公司。
本发明提供的高效表达重组人GAD65的基因工程菌的用途为用于生产可溶的具有活性的硫氧还蛋白—人谷氨酸脱羧酶65融合蛋白。本发明通过以下的技术方案解决上述技术问题，具体操作步骤如下第一步 液体培养将上述构建好的高效表达人谷氨酸脱羧酶65的基因工程菌在LB液体培养基中培养至OD600nm＝0.4～1.0时，加入终浓度为0.4～1.0mM的IPTG进行低温16℃诱导表达约12小时，生产和积累可溶性表达的硫氧还蛋白-人谷氨酸脱羧酶65融合蛋白；第二步 纯化制得硫氧还蛋白-人谷氨酸脱羧酶65融合蛋白离心收集菌体，用缓冲液重悬菌体，超声破菌后，离心收集上清，进行His.Tag亲和层析，收集硫氧还蛋白-人谷氨酸脱羧酶65融合蛋白组分，用截留分子量为5KD的Millipore Amicon Ultra-15超滤管将蛋白浓缩至2mg/mL；本发明提供的高效表达重组人GAD65的基因工程菌的用途为用于生产可溶的具有活性的重组人GAD65。具体技术方案是在上述生产可溶的具有活性的硫氧还蛋白—人谷氨酸脱羧酶65融合蛋白的基础上，用肠激酶酶解硫氧还蛋白-人谷氨酸脱羧酶65融合蛋白，25℃下酶解过夜，终止反应，再次进行His.Tag亲和层析，收集穿透峰，冷冻干燥，得到重组人谷氨酸脱羧酶65。
本发明与已有技术相比较显著效果在于(1)通过基因工程技术的方法让人谷氨酸脱羧酶65基因与硫氧还蛋白一起融合表达，提高了可溶性人谷氨酸脱羧酶65的表达量。
(2)通过在人谷氨酸脱羧酶65基因的DNA序列的N端加入His.Tag纯化标签，只要进行一次His.Tag亲和层析，便可从发酵液中得到较纯的人谷氨酸脱羧酶65基因融合蛋白，纯化步骤简便，比传统技术的多次层析更易于操作。
(3)只要进行一次酶解便能得到不含有额外氨基酸的重组人谷氨酸脱羧酶65，纯化极为简便，得率高。
(4)纯化的硫氧还蛋白-人谷氨酸脱羧酶65融合蛋白有生物活性，可以选择不经过肠激酶酶解去除硫氧还蛋白直接应用，避免了肠激酶价格昂贵的缺点。
因而用本发明提供的基因工程菌可用于生产重组人谷氨酸脱羧酶65或硫氧还蛋白-人谷氨酸脱羧酶65融合蛋白，产量高，纯化工艺简便，生产成本较低。


图1是重组质粒pET-32a-GAD65的构建示意图。
图2是基因工程菌表达重组人谷氨酸脱羧酶65的SDS-PAGE电泳图。
图3是重组人谷氨酸脱羧酶65的分离纯化和酶切结果图。
其中1为标准蛋白质分子质量；2为硫氧还蛋白-人谷氨酸脱羧酶65融合蛋白；3为硫氧还蛋白-人谷氨酸脱羧酶65融合蛋白经肠激酶酶解，4为纯化后的重组人谷氨酸脱羧酶65。
图4是硫氧还蛋白—人谷氨酸脱羧酶65融合蛋白酶学活性检测图。
其中1为L-谷氨酸钠(L-MSG)和γ-氨基丁酸(γ-GABA)对照；2为硫氧还蛋白—人谷氨酸脱羧酶65融合蛋白催化L-谷氨酸钠脱羧反应的反应液；3为L-谷氨酸钠脱羧反应底物液对照。
具体实施例方式
下面结合附图，通过实施例，进一步说明本发明。说明书和实施例中凡未注明具体条件的实验方法，按常规条件进行。
实施例1基因工程菌的制备第一步 引物设计根据已知人GAD65的cDNA序列，设计特异性的Nest-PCR上游引物A1、A2和下游引物B1，其中上游引物A2中引入KpnI限制性内切酶酶切位点和肠激酶酶切位点，下游引物B1中引入BamHI限制性内切酶酶切位点。
上游引物A15’-GCGACCTGCTCCAGTCTCCAAAG-3’上游引物A25’-TTAGGTACCGACGACGACGACAAGGCATCTCCGGGCTCT-3’KpnI 肠激酶酶切位点下游引物B15’-GCTGGATCCTGGAACAGCTTGGTGAGCA-3’BamHI第二步 Nest-PCR扩增人GAD65DNA片段以人胰腺cDNA文库(购自Clontech)为模板，用高保真Pfu DNA聚合酶扩增GAD65，先用上述初级引物A1、B1进行PCR扩增得到初级扩增产物，按下列条件进行PCR扩增94℃，40s；54℃，40s；72℃，2min，循环28次后72℃延伸5min，获得初级扩增产物。再以初级扩增产物作模板，用上述次级引物A2、B1进行PCR扩增得到人GAD65DNA片段，PCR反应体系中包含1μl模板，即初级扩增产物，2μl 10X Pfu buffer，1μl Pfu DNA聚合酶，1μl dNTP(2.5mmol/L each)，引物A2和B1各1μl，12μl无菌水。PCR扩增条件为94℃预变性5min，然后94℃40s，55℃40s，72℃2min，循环28次后72℃延伸5min。反应产物用DNA Gel Extraction Kit回收。电泳检测，纯化并回收备用。
第三步 构建含人GAD65基因序列的基因工程菌用两种限制性内切酶双酶切第二步中获得的人GAD65 DNA片段，所述的两种限制性内切酶是KpnI和BamHI，纯化回收小片段，用同样两种限制性内切酶双酶切质粒pET-32a(+)，纯化回收大片段，连接上述回收的小片段和大片段，得含人GAD65DNA片段的重组质粒pET-32a-GAD65，将重组质粒pET-32a-GAD65转化到大肠杆菌DH5α，制得含人GAD65基因序列，即人GAD65DNA基因工程菌，将该基因工程菌委托专业的生物技术公司测序，证实该基因工程菌含完整的重组人GAD65基因片段；第四步 构建高效表达人GAD65的基因工程菌从第三步构建好的基因工程菌中抽提重组质粒pET-32a-GAD65，转化到大肠杆菌BL21(DE3)或Rosetta-gami(DE3)中，得到高效表达的人谷氨酸脱羧酶65的基因工程菌。
实施例2利用本发明的基因工程菌制备硫氧还蛋白-人谷氨酸脱羧酶65融合蛋白一种高效表达人谷氨酸脱羧酶65的基因工程菌的应用，即用所述的基因工程菌生产人谷氨酸脱羧酶65。下述的亲和层析介质为Ni-NTA His.Bind或His.Bind树脂，购自Novagen公司，下述的肠激酶，购自MERCK公司。
第一步 液体培养将实施例1中构建好的基因工程菌接种于20mL含100mg/mL Amp的LB液体培养基中，37℃，210rpm，培养至OD600＝0.6-1.0。5000rpm，4℃，离心5min，收集沉淀的菌体，4℃保存过夜。第二天用20mL含100mg/mL Amp的LB培养基重悬菌体，4％体积接种于400mL含100mg/mL Amp的LB培养基中。37℃，210rpm，培养至OD600nm＝0.4～1.0。加入终浓度为0.4～1.0mM IPTG，16℃～20℃进行低温诱导表达过夜(约12h)。将摇瓶置于冰上冰浴5min后，6000rpm，4℃，离心5-10min收集菌体。加100mL NTA-0或IDA-0Buffer重悬菌体，同时加入终浓度为0.2mg/mL的溶菌酶和1mM的PMSF。冰上放置30min，超声波破碎菌体，12000rpm，4℃，离心30min，收集上清。
第二步 纯化制得硫氧还蛋白-人谷氨酸脱羧酶65融合蛋白上清用亲和层析柱Ni-NTA His.Bind或His.Bind树脂分离纯化得融合蛋白TrxA-GAD65。用5倍树脂体积的NTA-0或IDA-0Buffer平衡NTA/IDA-Resin。将样品加到NTA/IDA-Resin中，分别用2倍树脂体积的NTA/IDA-0，NTA/IDA-20，NTA/IDA-40，NTA/IDA-60，NTA/IDA-80，NTA/IDA-100，NTA/IDA-200，5倍树脂体积的NTA/IDA-1000Buffer洗脱，分别收集穿透部分和各个组分的洗脱液，用于SDS-PAGE分析蛋白质洗脱情况。经SDS-PAGE分析含有融合蛋白TrxA-GAD65组分的洗脱液用截留分子量为5KD-10KD的Millipore Amicon Ultra-15超滤管将蛋白脱盐和浓缩，浓缩至2mg/mL以上。蛋白浓度用Lowry法测定。
实施例3利用本发明的基因工程菌制备人谷氨酸脱羧酶65在实施例3的第二步的基础上制备人谷氨酸脱羧酶65。融合蛋白TrxA-GAD65用肠激酶酶切。每毫克融合蛋白加1个单位的肠激酶，25℃，振荡，酶切约16h。酶切产物用亲和层析柱Ni-NTA His.Bind或His.Bind树脂分离。收集穿透峰和NTA/IDA-0的洗脱峰。合并这两种组分，用5KD-10KD的MilliporeAmicon Ultra-15超滤管对GAD65脱盐和浓缩。蛋白浓度用Lowry法测定。
实施例4人谷氨酸脱羧酶65融合蛋白或人谷氨酸脱羧酶65蛋白酶学活性检测。
TrxA-GAD65或GAD65酶学活性检测采用测定由L-谷氨酸钠(L-MSG)脱羧生成γ-氨基丁酸(γ-GABA)的量的方法。10ul蛋白样品溶液加入到100ul反应底物溶液(50mM磷酸缓冲液，pH7.2，1mM EDTA，0.2mM 5’-PLP，20mML-MSG)中，混匀，37℃水浴，30分钟-1小时，然后取出20ul反应液，加入20ul50mM硼酸缓冲液，pH9.0，再加入4ul NBD-Cl(4mg/ml)，55℃水浴1小时，取3-4ul反应液点薄层层析硅胶板进行薄层层析，展层剂为正丁醇、乙酸和水的混合液体，其中正丁醇∶乙酸∶水＝4∶1.5∶1，展层完毕后置硅胶板于紫外灯下，L-MSG及γ-GABA处将显示绿色荧光。对荧光进行光度扫描可以对生成的γ-GABA进行定量。
实施例5采用人谷氨酸脱羧酶65融合蛋白或人谷氨酸脱羧酶65蛋白质进行I型糖尿病诊断检测(ELISA方法)利用人谷氨酸脱羧酶65融合蛋白或人谷氨酸脱羧酶65蛋白质免疫学活性检测。
利用人谷氨酸脱羧酶65融合蛋白或人谷氨酸脱羧酶65蛋白质能与I型糖尿病患者血清中的人谷氨酸脱羧酶65蛋白抗体特异性结合的性质，按以下步骤进行a)人谷氨酸脱羧酶65融合蛋白或人谷氨酸脱羧酶65蛋白质以CBS包被缓冲液做不同稀释度，100ul/孔点样与于酶标孔中，放入湿盒内，4℃包被过夜。
b)用PBST洗涤液(PBS pH7.4，0.05％Tween-20)300ul/孔振荡洗涤三次，每次3-5min，弃尽液体。
c)加封阻液(PBS pH7.4，0.05％Tween-20，2％BSA或5％脱脂奶粉)200ul/孔，37℃湿盒孵育1小时。
d)重复步骤b。
e)加I型糖尿病患者血清100ul/孔，37℃湿盒孵育1小时。
f)重复步骤b。
g)加辣根过氧化物酶标记的鼠抗人IgG，100ul/孔，37℃湿盒孵育1小时。
h)重复步骤b。
i)加OPD显色液(OPD 0.5g/L，溶于0.05mol/L柠檬酸缓冲液pH5.0，含0.06％H2O2v/v，现配现用)100ul/孔，25℃显色30min。
j)50ul/孔终止液(2mol/L H2SO4)终止反应，酶标仪490nm测量各孔吸光值。
以上ELISA测试中设置一个正常人血清对照。每个孔同时做两个复孔，各样品吸光值采用平均值以减少误差。
重组质粒pET-32a-GAD65的测序结果如下，可以证实该基因工程菌含完整的重组人GAD65基因片段KpnI1 ttaggt accgac gac gac gac aag gca tct ccg ggc tct ggcAsp Asp Asp Asp LysAla Ser Pro Gly Ser GlyEnterokinas43 ttt tgg tct ttc ggg tcg gaa gat ggc tct ggg gat tcc gagPhe Trp Ser Phe Gly Ser Glu Asp Gly Ser Gly Asp Ser Glu
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权利要求
1.一种基因工程菌，由重组质粒和宿主菌构成，其特征在于重组质粒指的是含GAD65基因的质粒pET-32a(+)，宿主菌指的是大肠杆菌DH5α、BL21(DE3)或Rosetta-gami(DE3)中的任意一种。
2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于重组质粒是pET-32a(+)-PT7-TrxA-6×His-GAD65，其中，PT7是质粒pET-32a(+)的启动子；TrxA是硫氧还蛋白；6×His是组氨酸纯化标签。
3.一种基因工程菌的制备方法，其特征在于通过设计的PCR引物含肠激酶酶切位点，用PCR扩增的人GAD65基因片段，经过限制型内切酶酶切，克隆到表达质粒pET-32a(+)中，构建成重组质粒pET-32a-GAD65，然后转化到宿主菌中，制得的基因工程菌。
4.如权利要求3所述的基因工程菌的制备方法，其特征在于包括如下步骤第一步引物的设计与合成根据人GAD65的cDNA序列，设计特异性的Nest-PCR上游引物A1、A2和下游引物B1，其中上游引物A2中引入KpnI限制性内切酶酶切位点和肠激酶酶切位点，下游引物B1中引入BamHI限制性内切酶酶切位点；上游引物A15’-GCGACCTGCTCCAGTCTCCAAAG-3’上游引物A25’-TTA GCATCTCCGGGCTCT-3’KpnI肠激酶酶切位点下游引物B15’-GCT TGGAACAGCTTGGTGAGCA-3’BamHI第二步Nest-PCR扩增人GAD65DNA片段以人胰腺cDNA文库为模板，用高保真Pfu DNA聚合酶扩增GAD65，先用初级引物A1、B1进行PCR扩增得到初级扩增产物，再以初级扩增产物作模板，用次级引物A2、B1进行PCR扩增得到人GAD65 DNA片段，纯化并回收备用；第三步构建含人GAD65基因序列的基因工程菌用两种限制性内切酶KpnI和BamHI双酶切第二步获得的人GAD65 DNA片段，纯化回收小片段，再用KpnI和BamHI双酶切质粒pET-32a(+)，纯化回收大片段，连接上述回收的小片段和大片段，得含人GAD65 DNA片段的重组质粒pET-32a-GAD65，将重组质粒pET-32a-GAD65转化到宿主菌制得人GAD65 DNA基因工程菌。
5.如权利要求3或者4所述的基因工程菌的制备方法，其特征在于宿主菌是大肠杆菌DH5α，BL21(DE3)或Rosetta-gami(DE3)中的任意一种。
6.基因工程菌在制备硫氧还蛋白-人谷氨酸脱羧酶65融合蛋白中的应用。
7.如权利要求6所述的基因工程菌在制备硫氧还蛋白-人谷氨酸脱羧酶65融合蛋白中的应用，其特征在于包括如下步骤第一步液体培养将制备好的基因工程菌在LB液体培养基中培养至OD600nm＝0.4～1.0时，加入终浓度为0.4～1.0mM的IPTG进行低温诱导表达约12小时，生产和积累可溶性表达的硫氧还蛋白-人谷氨酸脱羧酶65融合蛋白；第二步纯化制得硫氧还蛋白-人谷氨酸脱羧酶65融合蛋白离心收集菌体，用缓冲液重悬菌体，超声破菌后，离心收集上清，进行His.Tag亲和层析，收集硫氧还蛋白-人谷氨酸脱羧酶65融合蛋白组分，用截留分子量为5KD的Millipore Amicon Ultra-15超滤管将蛋白浓缩至2mg/mL；
8.基因工程菌在制备重组人谷氨酸脱羧酶65中的应用。
9.如权利要求8所述的基因工程菌在制备重组人谷氨酸脱羧酶65中的应用，其特征在于将硫氧还蛋白-人谷氨酸脱羧酶65融合蛋白用肠激酶酶解硫氧还蛋白-人谷氨酸脱羧酶65融合蛋白，25℃下酶解过夜，终止反应，再次进行His.Tag亲和层析，收集穿透峰，冷冻干燥，得到重组人谷氨酸脱羧酶65。
全文摘要
本发明涉及一种基因工程菌，以及该基因工程菌的制备方法及其用途，属于生物工程技术领域。该基因工程菌由重组质粒和宿主菌构成，其中宿主菌指的是大肠杆菌DH5α、BL21(DE3)或Rosetta－gami(DE3)中的任意一种，重组质粒指的是含GAD65基因的质粒pET32a(+)。该基因工程菌的构建方法包括设计Nest－PCR上游和下游引物，用PCR从人胰腺cDNA库中扩增人GAD65基因片断，并通过表达载体转化到大肠杆菌获得高效表达重组人GAD65的基因工程菌。本发明提供的基因工程菌的用途为用于生产可溶的具有活性的硫氧还蛋白－人谷氨酸脱羧酶65融合蛋白，以及具有活性的重组人GAD65。具有表达量高、成本低，表达获得的重组人谷氨酸脱羧酶融合蛋白直接就有酶学活性和免疫学活性，纯化步骤简便，易于操作，得率高等显著效果。
文档编号C12P21/02GK101054569SQ200610027929
公开日2007年10月17日 申请日期2006年6月21日 优先权日2006年6月21日
发明者马明浩, 吴自荣, 黄静, 胡荣章, 叶海峰, 金丽 申请人:华东师范大学