专利名称：鉴别分泌型蛋白标志物的系统及方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及一种鉴别分泌型蛋白标志物的系统及方法。
背景技术：
根据已有的研究发现，许多疾病(如肿瘤)的发生与发展都与由相关的细胞或组织中表达分泌特异性蛋白标志物相关。因此，发展生物学的标记分子对于尽早检测以及早期治疗多种相关疾病具有十分重要的意义。
如果能在病人血清中发现疾病的生物学标记分子，将会对于这些病人的治疗带来很重要的影响。这些生物学标记分子可以被医生用来作为确诊的测试，医生可以通过它们来监控单个疾病病例对于治疗的反应，来预测什么时候会有这个疾病的复发。医生可以通过一系列的疾病标记分子水平的测定来决定是否要开始，继续或者维持治疗。
目前，已经找到了多种疾病相关的标记分子，特别是肿瘤相关的标记分子。肿瘤中的血清标记分子可以被分为肿瘤相关的癌胚抗原，异常表达的激素，酶，以及癌症宿主代谢产物。癌胚蛋白，例如癌胚胎蛋白(AFP)，在胚胎的生命周期中以高水平循环，但在正常的成体的血清或体液中，只有很少量能被检测到。然而，在一些特定的癌细胞中，这些蛋白的合成会再次启动。在75％的包含卵黄囊成分的睾丸癌(比如畸胎瘤和胚胎细胞瘤)和80％的原发性肝细胞瘤中，AFP的水平都有上升。在高级胃癌和胰腺癌中，它的水平也有上升。另一个癌胚抗原是CA125，它能在上皮性的肿瘤特别是上皮性的卵巢癌中有上调。然而CA125的敏感性不是很大，因为它只能在50％的一级卵巢癌中和60％的二级卵巢癌中被检测到。其他的血清标志物分子还包括异常表达的激素，然而，只有很少的一部份癌症能稳定性的产生一种异常的激素，可以被用来作为病人的血清标志物分子，包括人类慢性促性腺激素(hCG)和人类促黄体激素(hLH)。hCG被经常用来检测和监控胎盘和睾丸癌症，但也在肝癌，肺癌，胃癌以及卵巢癌患者的血清中被发现。血清中的酶也可以被用来作为肿瘤的标志物分子，例如胎盘碱性磷酸酯酶和骨碱性磷酸酯酶。前列腺特异性抗原(PSA，一种丝氨酸蛋白酶)也许是最广泛使用的一种血清标志物分子。在血清中的高PSA水平显示其需要进一步的医学评价来确定是否有前列腺癌的存在。有数据表明，从1989年开始的PSA测试的使用与前列腺癌早期诊断的增加和晚期诊断的明显减少相关。然而假阳性和假阴性的PSA值也是有害的问题。例如，PSA在血清中的水平在一些良性的前列腺肿大，前列腺炎和尿道感染也有上升。少于10％的肺癌病人有产生异常激素的临床表现。目前，几乎没有肺癌的血清标志分子存在。在5％的迁移性的鳞癌或者大细胞肺癌中，高水平的甲状旁腺激素相关蛋白能被检测到。而小细胞肺癌则通常更和异常内分泌激素(例如促肾上腺皮质激素，诊断中的2％)的产生，抗利尿激素和黑素细胞刺激激素的上调相关，但可测量的内分泌性血清异常的发生率也少于所有病人的13％，病人血清中不定期的将会有CA125水平的升高。
迄今为止，对于包括肺癌在内的某一特定癌症的标志分子的特异性都不好，一方面是因为肿瘤细胞的代谢和免疫方面的特性和正常细胞非常相像。有相当一部份人虽然血清中有非正常水平的血清肿瘤标志物，但却是处在非恶性的情况下(假阳性)。同时，有许多恶性肿瘤血清测试方法的敏感性不强，导致了一些假阴性的情况发生。因此，频繁发生的假阳性和假阴性测试导致了肿瘤标志分子作为检测恶性肿瘤手段的局限性。由于这些假阳性和假阴性结果的发生频率是和在某一特定个体中单一肿瘤标志物分子的上升相关，因此，多种肿瘤标志物分子的使用将能够增强这种检测的特异性和敏感性。例如，一种前列腺癌的新肿瘤标志物分子—血清前列腺特异性膜抗原(PSMA)-已在最近进行一些测试，它的临床应用还有待探索(12-14)。血清中PSA和PSMA的同时测定，将能够减少假阳性和假阴性结果。
基于上述现有技术中存在的问题，本领域还需要寻找一些跟疾病的发生和发展相关的蛋白标志物，以能够及时地判断出疾病高危人群、进行疾病早期诊断、或对疾病的发生和发展作出准确的分析。
发明内容
本发明的目的在于提供一种鉴别分泌型蛋白标志物的系统及鉴别分泌型蛋白标志物方法。
在本发明的第一方面，提供一种鉴别分泌型蛋白或跨膜蛋白的系统，所述的系统包括(a)一种酵母细胞，所述的酵母细胞不表达有功能的分泌型蔗糖转化酶(SUC2)；和(b)一种表达载体，所述的表达载体含有蔗糖转化酶基因表达盒，所述的蔗糖转化酶基因表达盒含有缺失信号序列的蔗糖转化酶基因。
在本发明的另一优选例中，所述的表达载体可自我复制并且可转入所述的酵母细胞。
在本发明的另一优选例中，所述的蔗糖转化酶基因表达盒从5’至3’依次含有多克隆位点、缺失信号序列的蔗糖转化酶基因、和终止密码子。
在本发明的另一优选例中，所述多克隆位点包括HindIII位点和NotI位点。
在本发明的另一优选例中，所述的酵母细胞选自YT455/SUC2Δ9P。
在本发明的另一优选例中，所述的表达载体选自pRB576L/SUC2ΔSP，或pRB576/SUC2ΔSP在本发明的第二方面，提供一种鉴别编码分泌型蛋白或跨膜蛋白的cDNA的方法，所述的方法包括(1)将外源的cDNA片段插入到含有缺失信号序列的蔗糖转化酶基因的表达载体中；(2)将步骤(1)获得的表达载体导入不表达有功能的分泌型蔗糖转化酶的酵母细胞中，并在蔗糖作为唯一碳源的培养基上培养，从而获得能够生长的酵母细胞；(3)鉴定从步骤(2)获得的酵母细胞中的外源cDNA片段的信息，基于此获得编码分泌型蛋白或跨膜蛋白的cDNA。
在本发明的另一优选例中，在步骤(3)中，包括分离出插入了外源cDNA片段的表达载体，并分离所述cDNA片段，基于该片段获得全长cDNA，所述的全长cDNA即为编码分泌型蛋白或跨膜蛋白的cDNA。
在本发明的另一优选例中，所述的酵母转化酶基因表达盒从5’至3’依次含有多克隆位点、缺失信号序列的酵母转化酶基因、终止密码子；并且，将外源的cDNA片段插入所述的表达载体的多克隆位点中。
在本发明的另一优选例中，提供一种鉴别编码分泌型蛋白或跨膜蛋白的cDNA的方法，所述的方法包括(1)提供一种表达载体，所述的表达载体可自我复制并且可转入所述的酵母细胞，并且所述的表达载体含有SUC2基因表达盒，所述的SUC2基因表达盒从5’至3’依次含有多克隆位点、缺失信号序列的SUC2基因(SUC2Δsp)、终止密码子；(2)将cDNA文库的cDNA片段插入所述表达载体的多克隆位点，从而获得插入外源cDNA片段的表达载体；(3)用步骤(2)获得的表达载体，转化酵母细胞，所述的酵母细胞不表达SUC2基因，并在蔗糖作为唯一碳源的培养基上培养，从而获得能够生长的酵母细胞；(4)从所述酵母细胞中，分离出插入了外源cDNA片段的表达载体，并分离所述cDNA片段；(5)以步骤(4)获得的cDNA片段为探针，从cDNA文库中获得相应的全长cDNA；或者测定所述该cDNA片段的序列，并基于该序列获得相应的全长cDNA，所述的全长cDNA即为编码分泌型蛋白或跨膜蛋白的cDNA。
在本发明的另一优选例中，所述的cDNA片段来源于cDNA文库，并且所述的cDNA片段是富集了5’端cDNA的cDNA片段。
在本发明的另一优选例中，所述的cDNA文库为疾病相关的细胞或组织的cDNA文库。
在本发明的另一优选例中，所述的cDNA文库中富集疾病特异性或组织特异性cDNA。
另一方面，本发明还提供一种通过所述的方法获得的分泌型蛋白或跨膜蛋白的cDNA，以及由该cDNA编码的蛋白。
在本发明的第三方面，提供一种酵母细胞，所述的酵母细胞不表达有功能的分泌型酵母转化酶。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
图1为一组示意图。
其中，图1(a)显示了分泌形式的蔗糖转化酶将酵母细胞外的蔗糖水解为葡萄糖和果糖，葡萄糖和果糖被转运到酵母体内作为碳源，使细胞能够在YEP-SA培养基上生长的流程示意图。图1(b)显示了删除掉信号序列的SUC2基因(SUC2ΔSP)编码的蔗糖转化酶不能分泌到酵母细胞外，不能将蔗糖水解为葡萄糖和果糖，酵母细胞无法在YEP-SA培养基上生长。图1(c)显示了用含有信号序列的cDNA和删除掉信号序列的SUC2基因(SUC2ΔSP)的载体转化的酵母细胞能够在YEP-SA培养基上生长。
图2显示了载体pRB420、pRB576和pRB576L的结构示意图。其中，质粒pRB420中插入了野生型的SUC2基因，质粒pRB576中插入缺失信号序列(第3第20个密码子)的SUC2基因，将pRB576中的起始密码子删除，插入一个Not I酶切位点(pRB576L)。
图3显示了用肺癌细胞株H125建肺特异性cDNA富集的cDNA文库，用差减杂交的方法扣除M663细胞株的mRNA。
图4显示了富集5’端cDNA的PCR的方法cDNA的5’端和3’端分别接上Hind III和Not I的酶切位点。
图5显示了克隆cDNA的5’-端片段进入pRB576L上Hind III和Not I的酶切位点的过程。
图6显示了利用酵母筛选包含信号序列的cDNA。
图7显示了进一步筛选阳性克隆的方法。
图8显示了利用酵母系统捕获信号序列的实验。用野生型SUC2基因(SUC2Δsp)(A、B)，删除信号序列的SUC2基因(C、D)或者TGF-β信号序列(E、F)转化酵母菌株YT455(SUC2Δ9，ade2-101，ura3-52)，然后将酵母涂在SDA平板上估计转化效率(A、C、E)；将酵母涂在YEP-EA平板上观察蔗糖酶的能力(B、D、F)，平板在30℃条件下培养三天，拍照。在SUC2Δsp中引入TGF-β的信号序列就能使酵母在蔗糖培养基上生长(F)。
具体实施例方式
本发明人经过长期的研究，开发了一种利用改造的酵母细胞(即缺失SUC2基因或SUC2基因不表达的酵母细胞)作为宿主，筛选分泌蛋白或跨膜蛋白的方法。本发明人设计的方法比其它方法更简单，快速，并且具有高的检测灵敏度和特异性。因此，可以采用本发明的方法来鉴别出分泌蛋白或跨膜蛋白；尤其是可针对一些疾病，找出疾病特异性分泌型蛋白标志物。基于此完成了本发明。
如本文所用，术语“分泌型蛋白”是指一类蛋白，其能够在细胞中被表达，并且能够通过细胞膜，被分泌到细胞外。通常，分泌型蛋白的氨基(N)端带有一段长度不等(一般约几十到几百bp的核苷酸)的信号肽。
本发明的原理和应用本发明的系统包括(a)一种酵母细胞，所述的酵母细胞不表达有活性SUC2基因；和(b)一种表达载体，所述的表达载体可自我复制并且可转入所述的酵母细胞，并且所述的表达载体含有SUC2基因表达盒，所述的SUC2基因表达盒从5’至3’依次含有多克隆位点、缺失信号序列的SUC2基因(SUC2Δsp)、终止密码子。
可用于本发明的不表达SUC2基因的酵母细胞，可用常规方法制备。例如可通过基因破坏法对SUC2基因进行定位突变。在本发明中，表达无活性SUC2的酵母细胞仍视为不表达SUC2的酵母序列。
可用于本发明的含有SUC2基因表达盒的表达载体没有特别限制，可以是任何能够构建入所述含有SUC2基因表达盒，只要其能够自我复制，并且能够转入到酵母细胞中进行目的基因的表达。
在本发明中，鉴别分泌型蛋白或跨膜蛋白是基于利用酵母细胞内产生的蔗糖转化酶的分泌特性来实现的。
具体地，一些酵母细胞(如Saccharomyces cerevisiae)产生的蔗糖转化酶具有两种形式一种是包含信号肽的分泌形式，另一种是缺乏信号肽的胞内蛋白形式。所述的这两种形式的蛋白由酵母中的同一个基因SUC2编码。其中，分泌形式的蔗糖转化酶能将细胞外的蔗糖水解为葡萄糖和果糖，葡萄糖和果糖会被转运到酵母体内作为碳源，从而可作为酵母生长的能量来源(碳源)，如图1(a)所示。反之，如果酵母细胞产生的是胞内蛋白形式的蔗糖转化酶，没有产生分泌到细胞外的蔗糖转化酶，则酵母细胞外的蔗糖不能水解为葡萄糖和果糖，而酵母不能利用蔗糖作为碳源的，如图1(b)所示。
可用cDNA文库来替代SUC2中的信号序列，将cDNA文库中的各种cDNA片段连接到含有SUC2ΔSP表达载体的SUC2ΔSP基因的5’端位置(即对应于SUC2野生型序列的信号序列位置)，将所述表达载体转化入酵母细胞中，使酵母在以蔗糖为唯一碳源的培养基(如YEP-SA培养基)上生长。由此，只有包含有信号序列的cDNA片段转化的酵母才能在以蔗糖为唯一碳源的培养基上长出克隆，如图1(c)所示。通过上述步骤，可将包含有信号序列的cDNA片段从cDNA文库中分离出来。通过这部分cDNA片段为探针，通过如PCR方法，可在cDNA文库中得到全长的cDNA序列，所述序列编码的蛋白是分泌型蛋白或为跨膜蛋白。
因此，本发明的方法可用于针对多种疾病的相关细胞或组织，构建所述疾病相关的细胞或组织的cDNA文库，从中鉴定出编码分泌型蛋白或跨膜蛋白的cDNA。进而可进一步鉴定出疾病相关的特异性的分泌型蛋白标志物。
优选的，所述的cDNA文库中富集了疾病特异性cDNA，其中扣除了一些非该疾病特异性的cDNA。比如可通过差减杂交的方法来进行所述扣除。从这些疾病特异性的cDNA中找到能够编码分泌到细胞外的蛋白的cDNA，则该cDNA对应的蛋白很可能是一种疾病相关标志物。
所述的疾病可以是任何一种在正常个体与患病个体中蛋白表达呈现差异(优选显著差异)的疾病；更特别的，所述的疾病为肿瘤，比如肺癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌等。
分泌型蛋白的分析通过如上方法获得分泌型蛋白后，进一步的，可通过许多方法来对所述的分泌型蛋白进行分析，以从中找到有价值的蛋白标志物，用于临床诊断和分析。
优选的，可采用斑点印迹和Northern印迹分析，所述分析手段能够进一步验证基因表达是否属于相关组织(如肺组织)，或者是否具有相关组织或疾病(如肺癌)的特异性。此外，利用DNA测序和计算机搜寻同源序列，可以得知所获得的带有信号序列的cDNA是编码新的基因，还是编码已知基因，如图7所示。
如果cDNA编码新的基因，而且表达模式具有组织特异性，可分离全长的cDNA，进而获得其编码的蛋白。然后利用DNA和蛋白质的同源性搜索，寻找可能存在的模体以帮助鉴定蛋白质的功能。
另外，还可制备该基因产物的抗体。制备抗体的方法有好几种，可以通过在细菌中合成GST-cDNA融合蛋白，然后胶纯化或者按照cDNA序列直接合成肽链，将两种方法得到的蛋白送往商业公司由他们在家兔体内制备抗体。抗体将应用亲和纯化法进行纯化，并利用Western Blot和免疫组化检测，以估计组织(如肺组织)的特异性和相关疾病(如肺癌)的选择性。如果抗体可以用来鉴别组织(如肺组织)的特异性(作为理想中的组织特异性蛋白)，EILSA经过发展后就可以用来监测正常个体和患有疾病(如肺癌)的个体血清中的组织(如非组织)特异性蛋白。
此外，可用以上所描述的方法纯化蛋白质和抗体，并研究它们对细胞生长的影响。还可构建有义和反义哺乳动物表达载体，并将其稳定地转入相关的细胞系，以调控蛋白质的表达。用上述两个方法可以监测细胞生物功能的变化。可以通过一批放射杂交绘制基因图谱，这样可以判断该基因是否与相关疾病(如肿瘤)中的变化相一致。而且，在将来的实验中还可以研究敲除该基因的小鼠，也可以研究组织(如肺组织)特异性蛋白的编码序列的启动增强子区域，从而鉴定组织(如肺组织)的特异转录因子。
分泌型蛋白的应用这些通过本发明的方法初步获得的cDNA或其编码的蛋白也可构成一个筛选库，以便于人们最终可以从中筛选出能够用于临床疾病诊断和分析的有用的蛋白标志物。
经过鉴定，可从中找到疾病相关的特异性的cDNA或其编码的蛋白，它们可作为判断相关疾病的发生和发展的标志物，从而能够及时地判断出疾病高危人群、进行疾病早期诊断、或对疾病的发生和发展作出准确的分析。
针对一种疾病，通过本发明的方法可以找到多种相关的分泌型蛋白标志物。这些找到的分泌型蛋白标志物可单一地或复合地用于相关疾病的检测，以达到正确分析的目的。同时或先后对多个分泌型蛋白标志物进行检测，可更准确地反应疾病的状况，提高疾病诊断、预后的准确率，避免假阳性或假阴性的发生。
或者，通过本发明的方法获得的疾病相关的分泌型蛋白标志物，还能够用于对疾病进行辅助性地诊断或分析，便于医师能够对疾病的发生以及发展做出更准确的判断，提高临床方案的有效性。
肺癌特异性分泌蛋白的筛选在本发明的优选方式中，本发明人改造了酵母株YT455使其SUC2基因不表达；因此，改造后的酵母株不能生长在以蔗糖为唯一碳源的培养基(如YEP-SA培养基)中。将野生型的SUC2基因克隆到pRB420载体中，删除掉信号序列的SUC2基因(SUC2ΔSP)克隆到pRB576载体中，如图2所示。当包含SUC2基因的质粒pRB420转化酵母株YT455，酵母株能够在YEP-SA培养基中生长。但是当包含SUC2ΔSP的质粒pRB576转化酵母株YT455，酵母株则不能在YEP-SA培养基中生长，因为SUC2ΔSP不能合成分泌形式的蔗糖转化酶。
在本发明的优选方式中，本发明人用肺癌的cDNA文库替代SUC2中的信号序列，并用构建好的质粒转化酵母株YT455，这样就能从cDNA文库中筛选到大量的肺癌特异性的分泌蛋白和/或跨膜蛋白的序列。只有包含有信号序列的cDNA转化的酵母才能在YEP-SA培养基上长出克隆。接下来，本发明人可从阳性克隆中抽提质粒，质粒中包含的cDNA片段编码的蛋白要么是分泌蛋白要么是跨膜蛋白。用该cDNA片段作为探针，将分离出全长的cDNA用以检测其编码的蛋白表达的特异性。更特别的，还可制备抗该蛋白的抗体，从而在肺癌病人的血清中检测该蛋白表达的特异性和敏感性，从而可进一步筛选到具有临床应用价值的肺癌血清标志分子。
本发明的主要优点在于(1)本发明的方法可方便地鉴别出一些新的疾病特异性的分泌型蛋白；所述方法在简单，快速的同时，又具有很高的灵敏度和特异性。
(2)针对一种疾病同时找到多个疾病相关的分子标志物，拥有不只一个的蛋白标志物，从而可以大大的降低假阳性和假阴性的发生率。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室指南(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1酵母株的改造和载体构建采用定点突变的方法，对酿酒酵母株YT455(ade2-101，ura3-52)(购自ATCC，编号为208956)进行改造，改变SUC2基因中编码SUC蛋白第9位氨基酸的位点，经改变后，该酵母株不能表达蔗糖转化酶。本发明人将该酵母细胞株命名为YT455(SUC2Δ9P，ade2-101，ura3-52)。
以下实施例中采用的载体pRB420、pRB576和pRB576L的结构示意图见图2。
在质粒YCp50(购自ATCC编号87555)的EcoRI和Hind III位点中插入野生型的SUC2基因(GenBank登录号854644)，构成质粒pRB420/SUC2，见图2(a)。
在质粒YCp50(购自ATCC编号87555)的EcoRI和Hind III位点中插入缺失信号序列(第3-第20个密码子)的SUC2基因，构成质粒pRB576/SUC2Δsp，见图2(b)。
将pRB576/SUC2Δsp中的起始密码子删除，插入一个Not I酶切位点，构成pRB576L/SUC2Δsp，见图2(c)。
实施例2pRB576L/SUC2Δsp系统的有效性试验在本实施例中，本发明人将人类的转化生长因子TGF-β-1基因(GenBank登录号NM_000660)编码序列中含有信号序列的5’-区域(前述序列的前384个核苷酸)接入pRB576L/SUC2Δsp载体的Hind III/NotI酶切位点中，作为阳性对照。
当用前述构建的质粒转化酵母YT455时，酵母可在仅以蔗糖作为唯一糖源的YEP-SA培养基平板上生长。相反，转入没有TGF-β-1基因信号序列的pRB576L/SUC2Δsp质粒，则酵母不能够在蔗糖上生长，见图8。
用含有野生型SUC2基因，删除信号序列的SUC2基因(SUC2Δsp)或者TGF-β信号序列的载体转化酵母菌株YT455(SUC2Δ9P，ade2-101，ura3-52)，然后将酵母涂在SDA(0.66％酵母氮基，2％葡萄糖，200μg/ml腺嘌呤)平板上估计转化效率；将酵母涂在YEP-EA(1％酵母抽提物，2％蛋白胨，2％蔗糖，1μg/ml抗霉素A)平板上观察蔗糖酶的能力，平板在30℃条件下培养3天，拍照。在SUC2Δsp中引入TGF-β的信号序列就能使酵母在蔗糖培养基上生长。
图8中，A为用含野生型SUC2基因的pRB420载体转化酵母菌株YT455，将酵母涂于SDA平板上，酵母能够生长。
图8B为用含野生型SUC2基因的pRB420载体转化酵母菌株YT455，将酵母涂于YEP-EA平板上，酵母能够生长。
图8C为用含删除信号序列的SUC2基因(SUC2Δsp)的pRB576L/SUC2Δsp载体转化酵母菌株YT455，将酵母涂于SDA平板上，酵母能够生长。
图8D为用含删除信号序列的SUC2基因(SUC2Δsp)的pRB576L/SUC2Δsp载体转化酵母菌株YT455，将酵母涂于YEP-EA平板上，酵母不能生长。
图8E为用含TGF-β信号序列且含删除信号序列的SUC2基因(SUC2Δsp)的pRB576L/SUC2Δsp载体转化酵母菌株YT455，将酵母涂于SDA平板上，酵母能够生长。
图8F为用含TGF-β信号序列且含删除信号序列的SUC2基因(SUC2Δsp)的pRB576L/SUC2Δsp载体转化酵母菌株YT455，将酵母涂于YEP-EA平板上，酵母不能生长。
上述结果说明，利用pRB576L/SUC2Δsp的系统是有效的。
实施例3编码肺癌分泌型(或跨膜)蛋白的cDNA的鉴别肿瘤标志物通常具有两个特性组织特异性和肿瘤特异性。不过，所述特性对本实施例没有影响。肿瘤标志物通常不是特异地在某种肿瘤中存在，而是在组织的不同发育阶段特异地存在。胚胎细胞中可能合成大量的某种蛋白，但是在同种组织中的正常细胞有可能低表达这种蛋白。比如说，PSA并不是特异地表达在前列腺癌细胞中，而是特异地表达在前列腺组织的细胞中。
在本实施例中，本发明人选择来源于腺癌的H125细胞株(购自中国细胞库典藏细胞中心，编号QK10231)构建cDNA文库，从中筛选肺癌分泌型蛋白标志物。腺癌在北美是发病率最高的一种肺癌，占所有肺癌的40％，因此其是具有代表性的。
首先，采用常规的方法，用非小细胞肺癌细胞株H125构建一个cDNA文库，并用差减杂交的方法扣除骨肉瘤细胞株MG63(购自ATCC，编号CRL-142)、前列腺细胞株LNCaP(购自ATCC，编号CRL-1740)和粒细胞白血病细胞株HL60(购自ATCC，编号CCL-240)三株非肺癌细胞株的mRNA，以富集肺癌特异性的基因。
具体操作流程见图3。根据Invitrogen提供的差减杂交试剂盒(SubtractorKit，Invitrogen，CA)的使用说明，本发明人用反转录酶和随机引物从H125细胞株的mRNA合成cDNA的第一条链。用生物素标记的MG63、LNCaP和HL60细胞株的mRNA的混合物与合成的cDNA第一条链杂交，用酚/氯仿便可抽提掉与链霉亲和素结合的杂交混合物，从而扣除掉非肺癌特异性的cDNAs。
因为信号序列大多数定位于基因的氨基酸末端区域，所以本发明人采用PCR方法富集5’末端的cDNA，具体步骤见图4，简述如下将经减除的肺癌细胞系H125特异性的单链cDNA的3’末端加上dC-尾巴；然后将经减除的肺癌细胞系H125特异性cDNA与含Hind III位点的引物(5’ATGCTCGGACTGCAAGCTTCGAAGGGGGGGGGG 3’(SEQ ID NO1))退火；接着合成第二链；然后超声降解双链cDNA并钝化；接着在3’端连接Not I酶切位点(使用NotI的双链连接片断)；最后通过使用以下引物仅扩增cDNA文库的5’片段5’GCTCGGACTGCAAGCTTCGAA 3’(SEQ ID NO2)；5’CACCTCATTACCATGCGG CCGCCTCT 3’(SEQ ID NO3)。
基于上述PCR程序，本发明人在每条cDNA的5’-末端添加了Hind III酶切位点，3’-末端添加了Not I酶切位点，然后将各cDNA片断用Hind III/Not I酶切后，凝胶电泳分离400-1000bp的cDNA片段，将所述片段插入到质粒pRB576L/SUC2Δsp的相应Hind III/Not I酶切位点中，构建含有肺癌特异性cDNA的pRB576L/SUC2Δsp载体，具体见图5。
将上述构建的含有肺癌特异性cDNA的pRB576L/SUC2Δsp载体转化酵母细胞YT455(SUC2Δ9P，ade2-101，ura3-52)。将所述酵母细胞涂在以蔗糖作为唯一糖源的YEP-SA培养平板上，30℃培养。
经过培养，能够存活下来的阳性克隆即为能够分泌蔗糖转化酶的酵母克隆，转化入该酵母的质粒中的cDNA含有信号序列，也即转化入该酵母的质粒中携带分泌或跨膜相关的cDNA。
从酵母中分离携带分泌或跨膜相关的cDNA的质粒，转化大肠杆菌扩增质粒，见图6。
通过PCR技术、DNA测序、斑点印迹和Northern印迹分析验证，这些质粒载有信号序列及其起始密码。
用Hind III/Not I进行酶切，从携带分泌或跨膜相关的cDNA的质粒中切出所述的分泌或跨膜相关的cDNA。以该cDNA为探针，通过PCR反应，从前述构建的非小细胞肺癌细胞株H125 cDNA文库中获得全长的cDNA，即为编码分泌型(或跨膜)蛋白的cDNA。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表<110>中国科学院上海生命科学研究院<120>鉴别分泌型蛋白标志物的系统及方法<130>063625<160>3<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>1atgctcggac tgcaagcttc gaaggggggg ggg33<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
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<221>misc_feature<223>引物<400>3cacctcatta ccatgcggcc gcctct2权利要求
1.一种鉴别分泌型蛋白或跨膜蛋白的系统，其特征在于，所述的系统包括(a)一种酵母细胞，所述的酵母细胞不表达有功能的分泌型蔗糖转化酶；和(b)一种表达载体，所述的表达载体含有蔗糖转化酶基因表达盒，所述的蔗糖转化酶基因表达盒含有缺失信号序列的蔗糖转化酶基因。
2.如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述的蔗糖转化酶基因表达盒从5’至3’依次含有多克隆位点、缺失信号序列的蔗糖转化酶基因、和终止密码子。
3.如权利要求2所述的系统，其特征在于，所述多克隆位点包括HindIII位点和Not I位点。
4.一种鉴别编码分泌型蛋白或跨膜蛋白的cDNA的方法，其特征在于，所述的方法包括(1)将外源的cDNA片段插入到含有缺失信号序列的蔗糖转化酶基因的表达载体中；(2)将步骤(1)获得的表达载体导入不表达有功能的分泌型蔗糖转化酶的酵母细胞中，并在蔗糖作为唯一碳源的培养基上培养，获得能够生长的酵母细胞；(3)鉴别从步骤(2)获得的酵母细胞中的外源cDNA片段的信息，基于该信息获得编码分泌型蛋白或跨膜蛋白的cDNA。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的酵母转化酶基因表达盒从5’至3’依次含有多克隆位点、缺失信号序列的酵母转化酶基因、终止密码子；并且，将外源的cDNA片段插入所述的表达载体的多克隆位点中。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的cDNA片段来源于cDNA文库，并且所述的cDNA片段是富集了5’端cDNA的cDNA片段。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的cDNA文库为疾病相关的细胞或组织的cDNA文库。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的cDNA文库中富集疾病特异性或组织特异性cDNA。
9.一种酵母细胞，其特征在于，所述的酵母细胞不表达有功能的分泌型酵母转化酶基因。
10.一种通过权利要求5所述的方法获得的分泌型蛋白或跨膜蛋白的cDNA，以及由该cDNA编码的蛋白。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，公开了一种鉴别分泌型蛋白或跨膜蛋白的系统。本发明还公开了一种从cDNA文库中鉴别编码分泌型蛋白或跨膜蛋白的cDNA的方法。本发明所述方法具有很高的灵敏度和特异性，可方便地鉴别出一些新的疾病特异性的分泌型蛋白，例如筛选和鉴别肺癌特异性的分泌型蛋白标志物。
文档编号C12Q1/00GK101093226SQ20061002806
公开日2007年12月26日 申请日期2006年6月23日 优先权日2006年6月23日
发明者谢东 申请人:中国科学院上海生命科学研究院