专利名称：人血浆dna定量分析方法
技术领域：
本发明涉及一种DNA测量方法，特别涉及一种对血浆DNA水平的定量检测分析方法。
背景技术：
人血浆DNA是指游离于细胞外的DNA(cell free DNA)，又称循环DNA，始终处于一个较为恒定的水平，保持着一种平衡。只有当人体患有各种疾病，如感染而引发的机体炎症、外伤所致大面积组织损伤、组织器官的衰竭、自身免疫性疾病和肿瘤等由于大量的细胞出现死亡，此时核酸从细胞内大量进入到外周循环的血液中，这种平衡才会被打破，导致人血浆DNA水平大幅度地升高，以及出现DNA质量的异常。
因此，对血浆DNA的定量检测及分析，可以用于上述各种类型疾病的诊断及严重程度评估，对一些特殊复杂性疾病(遗传病及肿瘤等)进行分子诊断，跟踪观察治疗效果，进行病情预后分析等。所以，血浆DNA的定量检测及分析技术具有重要临床潜在应用价值。
在本发明之前，没有准确定量检测血浆DNA的定量检测分析技术。虽然以前有人采用过针对人基因组中的某一个看家基因进行实时荧光定量检测分析，试图对人血浆DNA水平进行定量，但总是难以做到；其原因在于，检测过程的开始必须将用于血浆DNA定量检测的模板(血浆DNA模板)提取并富集起来，这样势必导致对不同的样本(同一实验批次内和不同批次的各个样本)提取回收率存在差异，随后所采用的高敏感性基因扩增技术对各个样本的基因扩增效率又存在一定的差异，这样可使检测结果出现严重的偏差，因此单一针对血浆DNA的实时荧光定量检测技术无法对人血浆DNA水平进行准确定量，从而使得人血浆DNA的实时荧光定量基因扩增(实时荧光定量PCR)检测技术长期以来难以用于临床疾病的诊断、治疗效果观察及病情预后分析。
发明内容
本发明目的在于克服上述缺陷，研究发展一种新的、可准确应用于临床血浆DNA水平定量检测的新分析方法。
本发明的技术方案是人血浆DNA定量分析方法，收集以EDTA-K2抗凝的人外周血血浆，其主要技术特征在于向所收集的血浆加入含人工合成DNA片段的线性克隆质粒DNA内参照物，对提取的血浆DNA模板以三引物两种荧光标记的双Taqman探针的二重PCR技术，进行血浆DNA水平的实时荧光定量检测分析，(1)将人工合成的序列克隆到pMD18T载体，制备含人工合成DNA片段的线性克隆质粒DNA内参照物，人工合成的序列为5’-ACGGGAGCGGTTGGTGGTGGAAATCGTGCGTGACATTAAGA-3’，41bp分子量12.93KD。
实时荧光定量PCR检测所需的上游引物序列P 15’-AAACAGCTATGACCATGATTACGAA-3’，25bp分子量7.75KD。
下游引物序列P25’-CTTAATGTCACGCACGATTTCC-3’，22bp分子量6.73KD。
Taqman荧光探针1HEX 5’-CCACCAACCGCTCCCGTAATCTCTAG-3’TEMRA，26bp分子量7.88KD，5’端标记HEX，3’端标记TEMRA。
(2)人血浆DNA水平检测的靶基因是人看家基因β-actin，其基因序列为5’-GGACCTGACTGACTACCTCATGAAGATCCTCACCGAGCGCGGCTACAGCTTCACCACCACGGCCGAGCGGGAAATCGTGCGTGACATTAAG-3’，91bp分子量28.07KD。
实时荧光定量PCR检测所需的上游引物序列P35’-GGACCTGACTGACTACCTCATGAA-3’，24bp分子量7.4KD。
下游引物序列P25’-CTTAATGTCACGCACGATTTCC-3’，22bp分子量6.73KD。
Taqman荧光探针2FAM 5’-CACCGAGCGCGGCTACAGCTTC-3’TEMRA，22bp分子量6.76KD，5’端标记FAM，3’端标记TEMRA。
(3)线性克隆质粒DNA内参照物中所含人工合成DNA片段与被定量分析的人血浆DNA靶基因β-actin序列具有不同的序列，针对这两个靶基因进行定量分析为两种不同荧光标记的Taqman荧光探针；同时，在设计人工合成DNA时，针对这两个靶基因进行基因扩增时共用了同一个下游引物P2，使二重PCR基因扩增的条件与效率一致。
(4)将步骤(1)人工合成的外源性DNA插入载体pMD18T；从培养菌液中提取含插入片段的阳性质粒，用限制性核酸内切酶Hind II将阳性质粒标准品酶切为线性得到线性克隆质粒DNA内参照物；将酶切后的线性克隆质粒DNA内参照物5μl(5×103拷贝)投入到250μl人血浆中，对提取的血浆DNA模板采用两重荧光定量基因扩增技术，在同一个基因扩增管中分别对两个不同的靶基因，即人类基因组和外源性DNA基因组同时进行荧光定量扩增分析，从而准确计算出人血浆中DNA的含量。
本发明的优点和效果在于采用设计一个与人类基因组完全不同源的外源性DNA序列，并对该序列进行基因克隆，制备大量的具有相同序列的外源性DNA作为参考物质，并将其加入到血浆中利用其具有与血浆DNA提取效率完全一致的特点，即在提取血浆游离DNA的同时，外源性DNA也被提取，利用已知靶质和实际测定质的外源性线性克隆质粒DNA内参照物，对血浆DNA定量并对检测结果进行矫正，从而得到被测血浆DNA的准确含量，这是本发明的创造性所在。
其意义在于，应用本发明可以克服以往存在的各个样本间DNA提取效率及核酸体外扩增效率不一致性的关键问题，从而能够对人的血浆DNA进行准确定量检测，确立人类血浆DNA水平正常值参考值范围，用于发现患者血浆中DNA水平是否异常，对疾病进行诊断和治疗效果的跟踪观察。
其意义还在于，由于血浆DNA水平能够反映人体患有各种疾病如感染而引发的机体炎症、外伤所致大面积组织损伤、组织器官的衰竭、自身免疫性疾病和肿瘤等而引起的变化，因此不仅可以通过本发明得知这种变化，而且能定量检测这种变化，使得这种检测方法具有实用性，即可以应用于临床。可以评估各种类型的临床常见疾病的严重程度，并进行病情预后分析等。
本技术中利用双通道荧光定量PCR检测仪器对两个待测靶基因同时进行实时荧光定量检测，所采用的是以不同荧光标记的两个分别针对内参照基因和待测定的人血浆DNA基因的Taqman荧光探针，以共同的下游引物，即三个引物，对两个目的基因进行实时荧光定量PCR检测，使得在同一个基因扩增管中的两个基因扩增反应效率一致；同时，在最大程度上减少了引物二聚体形成的可能。
迄今为止尚未有用于血浆DNA定量临床检验诊断的两重荧光定量PCR检测技术，更无本发明中所描述的含有内参照的血浆DNA两重荧光定量PCR的检测技术。
具体实施例方式
1.外源性DNA制备将3’末端带有A的寡核苷酸插入载体pMD18T，制备感受态细菌，将含目的片段得到的pMD18-T全量转入200μl的感受态细菌中；经蓝白斑筛选、菌落PCR鉴定，阳性克隆提取含目的片段的质粒DNA。
限制性核酸内切酶Hind II将质粒内参照物酶切为线性酶切后，将线性克隆质粒DNA内参照物稀释为1×103拷贝/μl。
2.血浆分离和保存用含EDTA-K2的5ml带盖无菌塑料抗凝离心管抽取人外周血液3ml，室温放置4h内以2000r/min离心20min，收集血浆；再次以3000r/min离心15min，获得无血细胞成分的血浆，取0.5ml并向其中加入浓度为1×103拷贝/μl的线性克隆质粒DNA内参照物10μl，用0.5ml的Eppendorf离心管平均分装成两管，每管250μl，-70℃保存待用。
注收集抗凝静脉血不可以使用玻璃离心管或试管。
3.血浆DNA模板的提取采用常规酚/氯仿、QIAamp DNA Blood Minikit或磁珠法DNA提取试剂提取。
对含有内参照物的每份待测血浆标本以上述任何一种同样的方法进行DNA模板的提取，最后溶解于40μl TE缓冲液中放置于-20℃保存，在两周内检测，如需要长期保存，应放置在-70℃的冰箱中保存。
4.荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)荧光定量PCR检测β-actin和投入的外源性DNA(内参照物)(1)PCR体系组成
(2)扩增循环参数
第一步95℃ 5min；第二步94℃30s，57℃60s，40个循环；第三步72℃ 3min。
(3)采用PE7000或PE7700、Mx 3005P、Light Cycler 2.0等具有两重荧光分析功能的定量PCR仪(双通道以上荧光定量PCR仪器)。进行两重荧光定量PCR检测。
(4)利用公式计算人血浆DNA的准确含量。
log人拷贝数/log内拷贝数＝Ct内/Ct人log人拷贝数＝Ct内/Ct人log内拷贝数 注公式中4为用于血浆DNA含量检测的人血浆为250μ1(即1/4ml)，6×10-6指每分子人类基因组的质量(μg)，8指每一反应中只加入5μl血浆DNA模板(血浆DNA模板提取后总量为40μl，即其中的1/8)，5×103为投入的内参照物的浓度；“人”表示人血浆DNA；“内”表示内参照物；Ct值指荧光定量扩增检测域值循环周期数(即threshold cycle)。所投入线性克隆质粒DNA内参照物(5×103拷贝)与被测定的人基因组DNA的量，在本检测技术的线性范围内，并且与健康人预计的基因拷贝数接近或稍低，这样减少了所投入的外源性靶模板DNA的基因扩增的竞争效应。
以本发明定量检测人血浆DNA，针对不同年龄段、不同性别、不同地区、不同人种等，可以建立健康人血浆DNA的正常水平数值标准，即人血浆DNA正常参考值范围。利用本技术所建立的人血浆DNA水平定量这一临床检验诊断项目，可以在体检时用于评判身体是否出现异常现象；同时，还可以用于诊断和评估各种类型的临床常见疾病的严重程度，从而提高对临床疾病诊断、治疗疗效观察及病情预后分析的效果。
权利要求
1.人血浆DNA定量分析方法，收集以EDTA-K2抗凝的人外周血血浆，其特征在于向所收集的血浆加入含人工合成DNA片段的线性克隆质粒DNA内参照物，对提取的血浆DNA模板以三引物两种荧光标记的双Taqman探针的二重PCR技术，进行血浆DNA水平的实时荧光定量检测分析，(1)将人工合成的序列克隆到pMD18T载体，制备含人工合成DNA片段的线性克隆质粒DNA内参照物，人工合成的序列为5’-ACGGGAGCGGTTGGTGGTGGAAATCGTGCGTGACATTAAGA-3’，41bp分子量12.93KD。实时荧光定量PCR检测所需的上游引物序列P15’-AAACAGCTATGACCATGATTACGAA-3’，25bp分子量7.75KD。下游引物序列P25’-CTTAATGTCACGCACGATTTCC-3’，22bp分子量6.73KD。Taqman荧光探针1HEX 5’-CCACCAACCGCTCCCGTAATCTCTAG-3’TEMRA，26bp分子量7.88KD，5’端标记HEX，3’端标记TEMRA。(2)人血浆DNA水平检测的靶基因是人看家基因β-actin，其基因序列为5’-GGACCTGACTGACTACCTCATGAAGATCCTCACCGAGCGCGGCTACAGCTTCACCACCACGGCCGAGCGGGAAATCGTGCGTGACATTAAG-3’，91bp分子量28.07KD。实时荧光定量PCR检测所需的上游引物序列P35’-GGACCTGACTGACTACCTCATGAA-3’，24bp分子量7.4KD。下游引物序列P25’-CTTAATGTCACGCACGATTTCC-3’，22bp分子量6.73KD。Taqman荧光探针2FAM 5’-CACCGAGCGCGGCTACAGCTTC-3’TEMRA，22bp分子量6.76KD，5’端标记FAM，3’端标记TEMRA。(3)线性克隆质粒DNA内参照物中所含人工合成DNA片段与被定量分析的人血浆DNA靶基因β-actin序列具有不同的序列，针对这两个靶基因进行定量分析为两种不同荧光标记的Taqman荧光探针；同时，在设计人工合成DNA时，针对这两个靶基因进行基因扩增时共用了同一个下游引物P2，使二重PCR基因扩增的条件与效率一致。(4)将步骤(1)人工合成的外源性DNA插入载体pMD18T；从培养菌液中提取含插入片段的阳性质粒，用核酸限制性内切酶Hind II将阳性质粒标准品酶切为线性得到线性克隆质粒DNA内参照物；将酶切后的线性克隆质粒DNA内参照物5μl(5×103拷贝)投入到250μl人血浆中，对提取的血浆DNA模板采用两重荧光定量基因扩增技术，在同一个基因扩增管中分别对两个不同的靶基因，即人类基因组和外源性DNA基因组同时进行荧光定量扩增分析，从而准确计算出人血浆中DNA的含量。
全文摘要
本发明涉及一种对人血浆DNA水平的定量检测分析方法。选择与人类血浆DNA具有相同或相似提取效率的人工合成外源性DNA系列，且二者不同源，选择看家基因beta actin为测定基因，将人工合成外源性DNA插入载体pMD18T并放入细菌中培养，进行蓝白斑筛选、菌落PCR鉴定，再酶切成线性，投入到血浆中，采用两重荧光定量基因扩增，荧光基团分别为FAM、HEX，提取已知外源性阳性质粒回收效率，用计算公式计算得知血浆DNA的量。本发明解决了现有技术中不能临床应用的缺陷，可建立人类基因的正常水平数值标准包括异常值参考范围，便于发现身体出现异常现象，评估各种类型的临床常见疾病的严重程度，从而加强对临床疾病的诊断、治疗，跟踪观察治疗效果，进行病情预后分析等。
文档编号C12Q1/68GK1811387SQ20061003802
公开日2006年8月2日 申请日期2006年1月25日 优先权日2006年1月25日
发明者潘世扬, 黄珮珺, 张寄南, 童明庆, 魏源华 申请人:潘世扬