专利名称：一种使用Sepharose 4FF凝胶对细菌多糖进行纯化的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，更具体地，涉及细菌多糖的纯化方法。
背景技术：
细菌荚膜多糖是细菌重要的保护性抗原，接种这些多糖，可以使2岁以上的群体获得免疫保护。
在细菌发酵培养过程中，除了产生荚膜多糖之外，还产生大量的蛋白质、核酸、内毒素等成分，疫苗中这些成分的含量超过一定标准时，接种后可能导致较严重的副反应。世界卫生组织(WHO)发布的细菌多糖疫苗规程以及《中国药典》多糖疫苗的标准均对荚膜多糖中的蛋白质含量、核酸含量和内毒素含量有严格的要求。
细菌多糖的传统纯化工艺为采用冷酚萃取去除蛋白，然后用超滤或透析去除酚，用分级乙醇沉淀法去除核酸，并使用超速离心去除内毒素。这一工艺步骤繁多，每一个工艺过程均涉及众多工艺参数，故工艺波动性较大，给制品质量控制带来不利的因素，同时苯酚的大量使用给企业环保带来了巨大压力。
Sepharose 4FF凝胶在病毒、核酸纯化中得到应用，但是使用Sepharose 4FF凝胶对细菌多糖进行纯化目前尚无文献报道。
发明内容
本发明克服了现有技术的缺陷，提供了一种获得高纯度细菌多糖的条件温和、操作简便、易于控制、无环保问题的纯化工艺。
本发明的技术方案及步骤(1)采用生物反应器对细菌进行发酵培养；(2)于对数生长后期杀菌，离心收集上清液；(3)制备粗制多糖；
(4)对粗制多糖进行预处理，用截留分子量10～100kD的超滤膜超滤浓缩至多糖浓度为2～50mg/ml；(5)以2～15％柱体积上样于Sepharose 4FF凝胶柱，以含0.02～1.0mol/L氯化钠或氯化钙的洗脱液洗脱，收集Kd0.5之前的组分；(6)洗脱液加入乙醇至终浓度50-90％沉淀多糖，离心收集多糖沉淀；(7)沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次；(8)经冷冻干燥，获得高纯度的精制多糖。
其中的细菌可以为以下任一种b型流感嗜血杆菌、A群脑膜炎球菌、C群脑膜炎球菌、W135群脑膜炎球菌、Y群脑膜炎球菌、伤寒沙门氏菌、A群链球菌、B群链球菌、肺炎链球菌1型、肺炎链球菌2型、肺炎链球菌3型、肺炎链球菌4型、肺炎链球菌5型、肺炎链球菌6B型、肺炎链球菌7F型、肺炎链球菌8型、肺炎链球菌9N型、肺炎链球菌9V型、肺炎链球菌10A型、肺炎链球菌11A型、肺炎链球菌12F型、肺炎链球菌14型、肺炎链球茵15B型、肺炎链球菌17F型、肺炎链球菌18C型、肺炎链球菌19A型、肺炎链球菌19F型、肺炎链球菌20型、肺炎链球菌22F型、肺炎链球菌23F型、肺炎链球菌33F型；洗脱液可以含有0.2～1.0mol/L的氯化钠或氯化钙；所用的超滤膜截留分子量可以为50～100kD，上样的多糖浓度可以为20～50mg/ml，上样量可以为10％～15％；收集Kd0.5之前的组分，然后采取乙醇沉淀法沉淀细菌多糖；所获得的多糖适合制备细菌多糖疫苗及多糖蛋白结合疫苗。
本发明的有益效果是由于细菌多糖的免疫原性与细菌多糖的分子量密切相关，分子量大的多糖免疫原性较好，同时，细菌多糖中存在的蛋白质、核酸、内毒素杂质对于细菌多糖用于制备疫苗带来不利影响，通过采用Sepharose 4FF凝胶对细菌多糖进行纯化，获得了蛋白质、核酸、内毒素含量低的高纯度的细菌多糖，所获得的多糖适合制备细菌多糖疫苗及多糖蛋白结合疫苗，并提高了所制备疫苗临床使用的安全性和有效性。
具体实施例方式实施例1
采用生物反应器对b型流感嗜血杆菌进行发酵培养；于对数生长后期杀菌后，离心收集上清液；在上清液中加入十六烷基三甲基溴化铵至终浓度0.1％，室温静置12小时后，4000rpm离心15分钟，收集沉淀；沉淀中加入1mol/LCaCl2溶液，搅拌3小时后，加入乙醇至终浓度25％，离心收集上清液；上清液加入乙醇至终浓度80％，离心收集多糖沉淀；多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次；洗涤后的多糖经冷冻干燥，获得b型流感嗜血杆菌粗制多糖。
10克粗糖按50mg/ml溶解于注射用水中，按照1∶1体积比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇体积比5∶1)抽提2次，4000g离心30分钟收集上清，上清加入氯化钙至0.5mol/L，加入乙醇至25％，4℃静置12小时，10000g离心1小时去除沉淀。上清液用10kD超滤膜超滤去除乙醇并浓缩至2mg/ml，上样于Sepharose 4FF柱，每次上样36ml(柱体积的2％)。0.02mol/L氯化钠溶液洗脱；收集Kd0.5之前的洗脱峰，加入乙醇至终浓度50％，置4℃静置12小时，离心收集多糖沉淀；多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次。洗涤的经多糖冷冻干燥，获得480mg精制b型流感嗜血杆菌多糖。
各项检定指标如下蛋白含量 0.15％核酸含量 0.18％核糖含量 38.8％磷含量 8.1％KD小于0.5的分子回收95.2％鉴别试验 与b型流感嗜血杆菌特异抗血清产生沉淀线内毒素含量 10EU/微克多糖实施例2采用生物反应器对A群脑膜炎球菌进行发酵培养；于对数生长后期杀菌后，离心收集上清液；在上清液中加入十六烷基三甲基溴化铵至终浓度0.1％，室温静置12小时后，离心收集沉淀；沉淀中加入lmol/L CaCl2溶液，搅拌3小时后，加入乙醇至终浓度25％，离心收集上清液；上清液加入乙醇至终浓度75％，离心收集多糖沉淀；多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次；洗涤后的多糖经冷冻干燥，获得A群脑膜炎球菌粗制多糖。
40克粗糖按10mg/ml溶解于注射用水，按照1∶1体积比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇体积比5∶1)抽提2次，4000g离心30分钟收集上清，上清加入氯化钙至0.5mol/L，加入乙醇至25％，4℃静置12小时，10000g离心1小时去除沉淀。上清液用100kD超滤膜超滤去除乙醇并浓缩至浓度50mg/ml，上样于Sepharose 4FF柱，上样270毫升(15％柱体积)。用1.0mol/L氯化钠溶液洗脱；收集Kd0.5之前的洗脱峰，加入乙醇至终浓度90％，离心收集多糖沉淀；多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤两次。洗涤的多糖经冷冻干燥，获得7280mg精制A群脑膜炎球菌多糖。
各项检定指标如下蛋白含量 0.14％核酸含量 0.21％O-乙酰基含量 2.5mmol/g磷含量 8.52％KD小于0.5的分子回收96.4％鉴别试验 与A群脑膜炎球菌特异抗血清产生沉淀线内毒素含量 5EU/微克多糖实施例3采用生物反应器对C群脑膜炎球菌进行发酵培养；于对数生长后期杀菌后，离心收集上清液；在上清液中加入十六烷基三甲基溴化铵至终浓度0.1％，室温静置12小时后，离心收集沉淀；沉淀中加入1mol/L CaCl2溶液，搅拌3小时后，加入乙醇至终浓度25％，离心收集上清液；上清液加入乙醇至终浓度75％，离心收集多糖沉淀；多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次；洗涤后的多糖经冷冻干燥，获得C群脑膜炎球菌粗制多糖。
20克粗糖按10mg/ml溶解于注射用水，按照1∶1体积比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇体积比5∶1)抽提2次，4000g离心30分钟收集上清，上清加入氯化钙至0.5mol/L，加入乙醇至25％，4℃静置12小时，10000g离心1小时去除沉淀。上清液用50kD超滤膜超滤去除乙醇并浓缩至浓度20mg/ml，上样于Sepharose 4FF柱，上样180毫升(10％柱体积)。用0.2mol/L氯化钠溶液洗脱；收集Kd0.5之前的洗脱峰，加入乙醇至终浓度75％，离心收集多糖沉淀；多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤两次。洗涤的多糖经冷冻干燥，获得1865mg精制C群脑膜炎球菌多糖。
各项检定指标如下蛋白含量 0.18％核酸含量 0.24％O-乙酰基含量 2.1mmol/g唾液酸含量 850mg/gKD小于0.5的分子回收97.2％鉴别试验 与C群脑膜炎球菌特异抗血清产生沉淀线内毒素含量 2EU/微克多糖实施例4采用生物反应器对W135群脑膜炎球菌进行发酵培养；于对数生长后期杀菌后，离心收集上清液；在上清液中加入十六烷基三甲基溴化铵至终浓度0.1％，室温静置12小时后，离心收集沉淀；沉淀中加入1mol/L CaCl2溶液，搅拌3小时后，加入乙醇至终浓度25％，离心收集上清液；上清液加入乙醇至终浓度75％，离心收集多糖沉淀；多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次；洗涤后的多糖经冷冻干燥，获得W135群脑膜炎球菌粗制多糖。
20克粗糖按10mg/ml溶解于注射用水，按照1∶1体积比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇体积比5∶1)抽提2次，4000g离心30分钟收集上清，上清加入氯化钙至0.5mol/L，加入乙醇至25％，4℃静置12小时，10000g离心1小时去除沉淀。上清液用30kD超滤膜超滤去除乙醇并浓缩至浓度10mg/ml，上样于Sepharose 4FF柱，上样90毫升(5％柱体积)。用0.02mol/L氯化钙溶液洗脱；收集Kd0.5之前的洗脱峰，加入乙醇至终浓度80％，离心收集多糖沉淀；多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤两次。洗涤的多糖经冷冻干燥，获得650mg精制W135群脑膜炎球菌多糖。
各项检定指标如下蛋白含量0.15％核酸含量0.22％O-乙酰基含量0.61mmol/g唾液酸含量 608mg/gKD小于0.5的分子回收 97.6％鉴别试验与W135群脑膜炎球菌特异抗血清产生沉淀线内毒素含量 20EU/微克多糖实施例5采用生物反应器对Y群脑膜炎球菌进行发酵培养；于对数生长后期用甲醛杀菌后，离心收集上清液；在上清液中加入十六烷基三甲基溴化铵至终浓度0.1％，室温静置12小时后，离心收集沉淀；沉淀中加入1mol/LCaCl2溶液，搅拌3小时后，加入乙醇至终浓度25％，离心收集上清液；上清液加入乙醇至终浓度75％，离心收集多糖沉淀；多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次；洗涤后的多糖经真空冷冻干燥，获得Y群脑膜炎球菌粗制多糖。
25克粗糖按20mg/ml溶解于注射用水，按照1∶1体积比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇体积比5∶1)抽提3次，4000g离心30分钟收集上清，上清加入氯化钙至0.5mol/L，加入乙醇至25％，4℃静置12小时，10000g离心1小时去除沉淀。上清液用50kD超滤膜超滤去除乙醇并浓缩至浓度50mg/ml，上样于Sepharose 4FF柱，上样54毫升(柱体积的3％)。用1.0mol/L氯化钙溶液洗脱；收集Kd0.5之前的洗脱峰，加入乙醇至终浓度75％，离心收集多糖沉淀；多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次。洗涤的多糖经冷冻干燥，获得1760mg精制Y群脑膜炎球菌多糖。
各项检定指标如下蛋白含量 0.15％核酸含量 0.18％O-乙酰基含量 0.62mmol/g唾液酸含量 596mg/gKD小于0.5的分子回收97.8％鉴别试验 与Y群脑膜炎球菌特异抗血清产生沉淀线内毒素含量 16EU/微克多糖实施例6采用生物反应器对伤寒沙门氏菌进行发酵；于对数生长后期用甲醛杀菌后，离心收集上清液；在上清液中加入十六烷基三甲基溴化铵至终浓度0.1％，室温静置12小时后，离心收集沉淀；沉淀中加入1mol/LCaCl2溶液，搅拌3小时后，加入乙醇至终浓度25％，离心收集上清液；上清液加入乙醇至终浓度75％，离心收集多糖沉淀；多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次；洗涤后的多糖经冷冻干燥，获得伤寒Vi粗制多糖；
15克粗糖按15mg/ml溶解于注射用水中，按照1∶1体积比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇体积比5∶1)抽提3次，4000g离心30分钟收集上清，上清加入氯化钙至0.5mol/L，加入乙醇至25％，4℃静置12小时，10000g离心1小时去除沉淀。上清液用30kD超滤膜超滤去除乙醇并浓缩至20mg/ml，上样于Sepharose 4FF柱，上样72毫升(柱体积的4％)。用0.2mol/L氯化钙溶液洗脱；收集Kd0.5之前的洗脱峰，加入乙醇至终浓度70％，离心收集多糖沉淀；多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次。洗涤的多糖经冷冻干燥，获得1050mg精制伤寒Vi多糖。
各项检定指标如下蛋白含量0.16％核酸含量0.18％O-乙酰基含量3.08mmol/gKD小于0.25的分子回收75.2％鉴别试验与伤寒Vi特异血清形成沉淀线，与伤寒O血清不形成沉淀线内毒素含量 10EU/微克多糖实施例7采用生物反应器对A群链球菌进行发酵；于对数生长期后期用甲醛杀菌后，离心收集菌体；按照菌体湿重每100克加入0.5mol/L NaOH500毫升，搅拌下提取2小时，加入醋酸中和至pH7.0，4000rpm离心30分钟收集上清。用50kD超滤膜超滤，加入CaCl2至0.5mol/L，加入乙醇至终浓度25％，离心收集上清液；上清液加入乙醇至终浓度80％，离心收集多糖沉淀；多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次；洗涤后的多糖经冷冻干燥，获得A群链球菌粗制多糖。
将15g粗糖按15mg/ml溶解于注射用水中，按照1∶1体积比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇体积比5∶1)抽提2次，4000g离心30分钟收集上清，上清加入氯化钙至0.5mol/L，加入乙醇至25％，4℃静置12小时，10000g离心1小时去除沉淀。上清液用50kD超滤膜超滤去除乙醇并浓缩至40mg/ml，上样于Sepharose 4FF柱，上样108毫升(柱体积的6％)。用0.3mol/L氯化钠溶液洗脱；收集Kd0.5之前的洗脱峰，加入乙醇至终浓度90％，离心收集多糖沉淀；多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次；经洗涤的多糖经冷冻干燥，获得1750mg精制A群链球菌多糖。
各项检定指标如下蛋白含量 0.14％核酸含量 0.15％鉴别试验 与A群链球菌特异性抗血清产生沉淀线内毒素含量 0.05EU/微克多糖实施例8采用生物反应器对B群链球菌进行发酵；于对数生长期后期用甲醛杀菌后，离心收集菌体；按照菌体湿重每100克加入0.5mol/L NaOH500毫升，搅拌下提取2小时，加入醋酸中和至pH7.0，4000rpm离心30分钟收集上清。用50kD超滤膜超滤，加入CaCl2至0.5mol/L，加入乙醇至终浓度25％，离心收集上清液；上清液加入乙醇至终浓度80％，离心收集多糖沉淀；多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次；洗涤后的多糖经冷冻干燥，获得B群链球菌粗制多糖。
将25g粗糖按15mg/ml溶解于注射用水中，按照1∶1体积比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇体积比5∶1)抽提2次，4000g离心30分钟收集上清，上清加入氯化钙至0.5mol/L，加入乙醇至25％，4℃静置12小时，10000g离心1小时去除沉淀。上清液用30kD超滤膜超滤去除乙醇并浓缩至30mg/ml，上样于Sepharose 4FF柱，上样90毫升(柱体积的5％)。用0.3mol/L氯化钙溶液洗脱；收集Kd0.5之前的洗脱峰，加入乙醇至终浓度90％，离心收集多糖沉淀；多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次；经洗涤的多糖经冷冻干燥，获得850mg精制B群链球菌多糖。
各项检定指标如下蛋白含量 0.16％核酸含量 0.20％鉴别试验 与B群链球菌特异性抗血清产生沉淀线内毒素含量 0.05EU/微克多糖实施例9采用生物反应器对肺炎链球菌1型进行发酵；于对数生长期后期用脱氧胆酸钠杀菌后，离心收集上清液；上清用50kD超滤膜浓缩10倍，加入CaCl2至0.5mol/L，加入乙醇至终浓度25％，离心收集上清液；上清液加入乙醇至终浓度80％，离心收集多糖沉淀；多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次；洗涤后的多糖经冷冻干燥，获得肺炎链球菌1型粗制多糖。
将25g粗糖按15mg/ml溶解于注射用水中，按照1∶1体积比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇体积比5∶1)抽提3次，4000g离心30分钟收集上清，上清加入氯化钙至0.5mol/L，加入乙醇至25％，4℃静置12小时，10000g离心1小时去除沉淀。上清液用30kD超滤膜超滤去除乙醇并浓缩至25mg/ml，上样于Sepharose 4FF柱，上样180毫升(柱体积的10％)。用0.3mol/L氯化钠溶液洗脱；收集Kd0.5之前的洗脱峰，加入乙醇至终浓度80％，离心收集多糖沉淀；多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次；经洗涤的多糖经冷冻干燥，获得1650mg精制肺炎链球菌1型多糖。
各项检定指标如下蛋白含量 0.14％核酸含量 0.16％糖醛酸含量 50.3％KD 0.05磷含量 0.1％总氮含量 4.5％鉴别试验 与肺炎链球菌1型抗血清产生特异沉淀线内毒素含量 0.025EU/微克多糖实施例10采用生物反应器对肺炎链球菌2型进行发酵；于对数生长期后期用脱氧胆酸钠杀菌后，离心收集上清液；上清用50kD超滤膜浓缩10倍，加入CaCl2至0.5mol/L，加入乙醇至终浓度25％，离心收集上清液；上清液加入乙醇至终浓度80％，离心收集多糖沉淀；多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次；洗涤后的多糖经冷冻干燥，获得肺炎链球菌2型粗制多糖。
将25g粗糖按15mg/ml溶解于注射用水中，按照1∶1体积比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇体积比5∶1)抽提3次，4000g离心30分钟收集上清，上清加入氯化钙至0.5mol/L，加入乙醇至25％，4℃静置12小时，10000g离心1小时去除沉淀。上清液用30kD超滤膜超滤去除乙醇并浓缩至20mg/ml，上样于Sepharose 4FF柱，上样180毫升(柱体积的10％)。用0.3mol/L氯化钠溶液洗脱；收集Kd0.5之前的洗脱峰，加入乙醇至终浓度80％，离心收集多糖沉淀；多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次；经洗涤的多糖经冷冻干燥，获得1650mg精制肺炎链球菌2型多糖。
各项检定指标如下蛋白含量 0.21％核酸含量 0.19％糖醛酸含量 18.6％甲基戊糖含量 42.3％KD 0.05磷含量 0.1％总氮含量 0.2％鉴别试验 与肺炎链球菌2型抗血清产生特异沉淀线内毒素含量 0.025EU/微克多糖实施例11采用生物反应器对肺炎链球菌3型进行发酵；于对数生长期后期用脱氧胆酸钠杀菌后，离心收集上清液；上清用50kD超滤膜浓缩10倍，加入CaCl2至0.5mol/L，加入乙醇至终浓度25％，离心收集上清液；上清液加入乙醇至终浓度80％，离心收集多糖沉淀；多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次；洗涤后的多糖经冷冻干燥，获得肺炎链球菌3型粗制多糖。
将30g粗糖按20mg/ml溶解于注射用水中，按照1∶1体积比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇体积比5∶1)抽提3次，4000g离心30分钟收集上清，上清加入氯化钙至0.5mol/L，加入乙醇至25％，4℃静置12小时，10000g离心1小时去除沉淀。上清液用30kD超滤膜超滤去除乙醇并浓缩至25mg/ml，上样于Sepharose 4FF柱，上样180毫升(柱体积的10％)。用0.3mol/L氯化钠溶液洗脱；收集Kd0.5之前的洗脱峰，加入乙醇至终浓度80％，离心收集多糖沉淀；多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次；经洗涤的多糖经冷冻干燥，获得1850mg精制肺炎链球菌3型多糖。
各项检定指标如下蛋白含量 0.17％核酸含量 0.18％糖醛酸含量 45.3％KD 0.05磷含量 0.1％总氮含量 0.1％鉴别试验 与肺炎链球菌3型抗血清产生特异沉淀线内毒素含量 0.025EU/微克多糖实施例12采用生物反应器对肺炎链球菌4型进行发酵；于对数生长期后期用脱氧胆酸钠杀菌后，离心收集上清液；上清用50kD超滤膜浓缩10倍，加入CaCl2至0.5mol/L，加入乙醇至终浓度25％，离心收集上清液；上清液加入乙醇至终浓度80％，离心收集多糖沉淀；多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次；洗涤后的多糖经冷冻干燥，获得肺炎链球菌4型粗制多糖。
将15g粗糖按15mg/ml溶解于注射用水中，按照1∶1体积比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇体积比5∶1)抽提3次，4000g离心30分钟收集上清，上清加入氯化钙至0.5mol/L，加入乙醇至25％，4℃静置12小时，10000g离心1小时去除沉淀。上清液用30kD超滤膜超滤去除乙醇并浓缩至25mg/ml，上样于Sepharose 4FF柱，上样90毫升(柱体积的5％)。用0.3mol/L氯化钠溶液洗脱；收集Kd0.5之前的洗脱峰，加入乙醇至终浓度80％，离心收集多糖沉淀；多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次；经洗涤的多糖经冷冻干燥，获得1250mg精制肺炎链球菌4型多糖。
各项检定指标如下蛋白含量 0.23％核酸含量 0.21％氨基己糖含量 45.6％KD 0.05磷含量 0.1％总氮含量 5.1％鉴别试验 与肺炎链球菌4型抗血清产生特异沉淀线内毒素含量 0.025EU/微克多糖实施例13采用生物反应器对肺炎链球菌5型进行发酵；于对数生长期后期用脱氧胆酸钠杀菌后，离心收集上清液；上清用50kD超滤膜浓缩10倍，加入CaCl2至0.5mol/L，加入乙醇至终浓度25％，离心收集上清液；上清液加入乙醇至终浓度80％，离心收集多糖沉淀；多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次；洗涤后的多糖经冷冻干燥，获得肺炎链球菌5型粗制多糖。
将25g粗糖按15mg/ml溶解于注射用水中，按照1∶1体积比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇体积比5∶1)抽提3次，4000g离心30分钟收集上清，上清加入氯化钙至0.5mol/L，加入乙醇至25％，4℃静置12小时，10000g离心1小时去除沉淀。上清液用30kD超滤膜超滤去除乙醇并浓缩至25mg/ml，上样于Sepharose 4FF柱，上样180毫升(柱体积的10％)。用0.3mol/L氯化钠溶液洗脱；收集Kd0.5之前的洗脱峰，加入乙醇至终浓度80％，离心收集多糖沉淀；多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次；经洗涤的多糖经冷冻干燥，获得1020mg精制肺炎链球菌5型多糖。
各项检定指标如下蛋白含量 0.16％核酸含量 0.23％糖醛酸含量 14.2％氨基己糖含量 23.5％KD 0.35磷含量 0.3％总氮含量 4.2％鉴别试验 与肺炎链球菌5型抗血清产生特异沉淀线内毒素含量 0.025EU/微克多糖实施例14采用生物反应器对肺炎链球菌6B型进行发酵；于对数生长期后期用脱氧胆酸钠杀菌后，离心收集上清液；上清用50kD超滤膜浓缩10倍，加入CaCl2至0.5mol/L，加入乙醇至终浓度25％，离心收集上清液；上清液加入乙醇至终浓度80％，离心收集多糖沉淀；多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次；洗涤后的多糖经冷冻干燥，获得肺炎链球菌6B型粗制多糖。
将20g粗糖按20mg/ml溶解于注射用水中，按照1∶1体积比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇体积比5∶1)抽提3次，4000g离心30分钟收集上清，上清加入氯化钙至0.5mol/L，加入乙醇至25％，4℃静置12小时，10000g离心1小时去除沉淀。上清液用30kD超滤膜超滤去除乙醇并浓缩至40mg/ml，上样于Sepharose 4FF柱，上样54毫升(柱体积的3％)。用0.3mol/L氯化钠溶液洗脱；收集Kd0.5之前的洗脱峰，加入乙醇至终浓度80％，离心收集多糖沉淀；多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次；经洗涤的多糖经冷冻干燥，获得1350mg精制肺炎链球菌6B型多糖。
各项检定指标如下蛋白含量 0.21％核酸含量 0.19％甲基戊糖含量 21.3％KD 0.35磷含量 4.1％总氮含量 0.3％鉴别试验 与肺炎链球菌6B型抗血清产生特异沉淀线内毒素含量 0.025EU/微克多糖实施例15采用生物反应器对肺炎链球菌7F型进行发酵；于对数生长期后期用脱氧胆酸钠杀菌后，离心收集上清液；上清用50kD超滤膜浓缩10倍，加入CaCl2至0.5mol/L，加入乙醇至终浓度25％，离心收集上清液；上清液加入乙醇至终浓度80％，离心收集多糖沉淀；多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次；洗涤后的多糖经冷冻干燥，获得肺炎链球菌7F型粗制多糖。
将30g粗糖按20mg/ml溶解于注射用水中，按照1∶1体积比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇体积比5∶1)抽提3次，4000g离心30分钟收集上清，上清加入氯化钙至0.5mol/L，加入乙醇至25％，4℃静置12小时，10000g离心1小时去除沉淀。上清液用30kD超滤膜超滤去除乙醇并浓缩至25mg/ml，上样于Sepharose 4FF柱，上样180毫升(柱体积的10％)。用0.3mol/L氯化钠溶液洗脱；收集Kd0.5之前的洗脱峰，加入乙醇至终浓度80％，离心收集多糖沉淀；多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次；经洗涤的多糖经冷冻干燥，获得2250mg精制肺炎链球菌7F型多糖。
各项检定指标如下蛋白含量 0.18％核酸含量 0.15％甲基戊糖含量 15.6％KD 0.05磷含量 0.1％总氮含量 2.7％鉴别试验 与肺炎链球菌7F型抗血清产生特异沉淀线内毒素含量 0.025EU/微克多糖实施例16采用生物反应器对肺炎链球菌8型进行发酵；于对数生长期后期用脱氧胆酸钠杀菌后，离心收集上清液；上清用50kD超滤膜浓缩10倍，加入CaCl2至0.5mol/L，加入乙醇至终浓度25％，离心收集上清液；上清液加入乙醇至终浓度80％，离心收集多糖沉淀；多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次；洗涤后的多糖经冷冻干燥，获得肺炎链球菌8型粗制多糖。
将25g粗糖按15mg/ml溶解于注射用水中，按照1∶1体积比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇体积比5∶1)抽提3次，4000g离心30分钟收集上清，上清加入氯化钙至0.5mol/L，加入乙醇至25％，4℃静置12小时，10000g离心1小时去除沉淀。上清液用50kD超滤膜超滤去除乙醇并浓缩至25mg/ml，上样于Sepharose 4FF柱，上样90毫升(柱体积的5％)。用0.3mol/L氯化钠溶液洗脱；收集Kd0.5之前的洗脱峰，加入乙醇至终浓度80％，离心收集多糖沉淀；多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次；经洗涤的多糖经冷冻干燥，获得1750mg精制肺炎链球菌8型多糖。
各项检定指标如下蛋白含量 0.21％核酸含量 0.24％糖醛酸含量 38.6％KD 0磷含量 0.1％总氮含量 0.1％鉴别试验 与肺炎链球菌8型抗血清产生特异沉淀线内毒素含量 0.025EU/微克多糖实施例17采用生物反应器对肺炎链球菌9N型进行发酵；于对数生长期后期用脱氧胆酸钠杀菌后，离心收集上清液；上清用50kD超滤膜浓缩10倍，加入CaCl2至0.5mol/L，加入乙醇至终浓度25％，离心收集上清液；上清液加入乙醇至终浓度80％，离心收集多糖沉淀；多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次；洗涤后的多糖经冷冻干燥，获得肺炎链球菌9N型粗制多糖。
将25g粗糖按15mg/ml溶解于注射用水中，按照1∶1体积比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇体积比5∶1)抽提3次，4000g离心30分钟收集上清，上清加入氯化钙至0.5mol/L，加入乙醇至25％，4℃静置12小时，10000g离心1小时去除沉淀。上清液用30kD超滤膜超滤去除乙醇并浓缩至25mg/ml，上样于Sepharose 4FF柱，上样180毫升(柱体积的10％)。用0.3mol/L氯化钠溶液洗脱；收集Kd0.5之前的洗脱峰，加入乙醇至终浓度80％，离心收集多糖沉淀；多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次；经洗涤的多糖经冷冻干燥，获得1320mg精制肺炎链球菌9N型多糖。
各项检定指标如下蛋白含量 0.15％核酸含量 0.17％糖醛酸含量 25.3％氨基己糖含量 31.5％KD 0.05磷含量 0.1％总氮含量 3.3％鉴别试验 与肺炎链球菌9N型抗血清产生特异沉淀线内毒素含量 0.025EU/微克多糖实施例18采用生物反应器对肺炎链球菌9V型进行发酵；于对数生长期后期用脱氧胆酸钠杀菌后，离心收集上清液；上清用50kD超滤膜浓缩10倍，加入CaCl2至0.5mol/L，加入乙醇至终浓度25％，离心收集上清液；上清液加入乙醇至终浓度80％，离心收集多糖沉淀；多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次；洗涤后的多糖经冷冻干燥，获得肺炎链球菌9V型粗制多糖。
将30g粗糖按15mg/ml溶解于注射用水中，按照1∶1体积比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇体积比5∶1)抽提3次，4000g离心30分钟收集上清，上清加入氯化钙至0.5mol/L，加入乙醇至25％，4℃静置12小时，10000g离心1小时去除沉淀。上清液用30kD超滤膜超滤去除乙醇并浓缩至20mg/ml，上样于Sepharose 4FF柱，上样180毫升(柱体积的10％)。用0.3mol/L氯化钠溶液洗脱；收集Kd0.5之前的洗脱峰，加入乙醇至终浓度80％，离心收集多糖沉淀；多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次；经洗涤的多糖经冷冻干燥，获得1550mg精制肺炎链球菌9V型多糖。
各项检定指标如下蛋白含量 0.21％核酸含量 0.20％糖醛酸含量 18.6％甲基戊糖含量 16.2％KD 0.25磷含量 0.1％总氮含量 1.6％鉴别试验 与肺炎链球菌9V型抗血清产生特异沉淀线内毒素含量 0.025EU/微克多糖实施例19采用生物反应器对肺炎链球菌10A型进行发酵；于对数生长期后期用脱氧胆酸钠杀菌后，离心收集上清液；上清用50kD超滤膜浓缩10倍，加入CaCl2至0.5mol/L，加入乙醇至终浓度25％，离心收集上清液；上清液加入乙醇至终浓度80％，离心收集多糖沉淀；多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次；洗涤后的多糖经冷冻干燥，获得肺炎链球菌10A型粗制多糖。
将30g粗糖按20mg/ml溶解于注射用水中，按照1∶1体积比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇体积比5∶1)抽提3次，4000g离心30分钟收集上清，上清加入氯化钙至0.5mol/L，加入乙醇至25％，4℃静置12小时，10000g离心1小时去除沉淀。上清液用30kD超滤膜超滤去除乙醇并浓缩至25mg/ml，上样于Sepharose 4FF柱，上样180毫升(柱体积的10％)。用0.3mol/L氯化钠溶液洗脱；收集Kd0.5之前的洗脱峰，加入乙醇至终浓度80％，离心收集多糖沉淀；多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次；经洗涤的多糖经冷冻干燥，获得1730mg精制肺炎链球菌10A型多糖。
各项检定指标如下蛋白含量 0.22％核酸含量 0.18％氨基己糖含量 15.8％KD 0.35磷含量 2.7％总氮含量 1.9％鉴别试验 与肺炎链球菌10A型抗血清产生特异沉淀线内毒素含量 0.025EU/微克多糖实施例20采用生物反应器对肺炎链球菌11A型进行发酵；于对数生长期后期用脱氧胆酸钠杀菌后，离心收集上清液；上清用50kD超滤膜浓缩10倍，加入CaCl2至0.5mol/L，加入乙醇至终浓度25％，离心收集上清液；上清液加入乙醇至终浓度80％，离心收集多糖沉淀；多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次；洗涤后的多糖经冷冻干燥，获得肺炎链球菌11A型粗制多糖。
将25g粗糖按15mg/ml溶解于注射用水中，按照1∶1体积比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇体积比5∶1)抽提3次，4000g离心30分钟收集上清，上清加入氯化钙至0.5mol/L，加入乙醇至25％，4℃静置12小时，10000g离心1小时去除沉淀。上清液用30kD超滤膜超滤去除乙醇并浓缩至25mg/ml，上样于Sepharose 4FF柱，上样90毫升(柱体积的5％)。用0.3mol/L氯化钠溶液洗脱；收集Kd0.5之前的洗脱峰，加入乙醇至终浓度80％，离心收集多糖沉淀；多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次；经洗涤的多糖经冷冻干燥，获得1560mg精制肺炎链球菌11A型多糖。
各项检定指标如下蛋白含量 0.20％核酸含量 0.21％KD 0.15磷含量 3.8％总氮含量 0.2％鉴别试验 与肺炎链球菌11A型抗血清产生特异沉淀线内毒素含量 0.025EU/微克多糖实施例21采用生物反应器对肺炎链球菌12F型进行发酵；于对数生长期后期用脱氧胆酸钠杀菌后，离心收集上清液；上清用50kD超滤膜浓缩10倍，加入CaCl2至0.5mol/L，加入乙醇至终浓度25％，离心收集上清液；上清液加入乙醇至终浓度80％，离心收集多糖沉淀；多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次；洗涤后的多糖经冷冻干燥，获得肺炎链球菌12F型粗制多糖。
将25g粗糖按15mg/ml溶解于注射用水中，按照1∶1体积比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇体积比5∶1)抽提3次，4000g离心30分钟收集上清，上清加入氯化钙至0.5mol/L，加入乙醇至25％，4℃静置12小时，10000g离心1小时去除沉淀。上清液用30kD超滤膜超滤去除乙醇并浓缩至25mg/ml，上样于Sepharose 4FF柱，上样180毫升(柱体积的10％)。用0.3mol/L氯化钠溶液洗脱；收集Kd0.5之前的洗脱峰，加入乙醇至终浓度80％，离心收集多糖沉淀；多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次；经洗涤的多糖经冷冻干燥，获得1220mg精制肺炎链球菌12F型多糖。
各项检定指标如下蛋白含量 0.16％核酸含量 0.17％氨基己糖含量 28.5％KD 0.10磷含量 0.1％总氮含量 4.1％鉴别试验 与肺炎链球菌12F型抗血清产生特异沉淀线内毒素含量 0.025EU/微克多糖实施例22采用生物反应器对肺炎链球菌14型进行发酵；于对数生长期后期用脱氧胆酸钠杀菌后，离心收集上清液；上清用50kD超滤膜浓缩10倍，加入CaCl2至0.5mol/L，加入乙醇至终浓度25％，离心收集上清液；上清液加入乙醇至终浓度80％，离心收集多糖沉淀；多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次；洗涤后的多糖经冷冻干燥，获得肺炎链球菌14型粗制多糖。
将40g粗糖按20mg/ml溶解于注射用水中，按照1∶1体积比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇体积比5∶1)抽提3次，4000g离心30分钟收集上清，上清加入氯化钙至0.5mol/L，加入乙醇至25％，4℃静置12小时，10000g离心1小时去除沉淀。上清液用30kD超滤膜超滤去除乙醇并浓缩至30mg/ml，上样于Sepharose 4FF柱，上样180毫升(柱体积的10％)。用0.3mol/L氯化钠溶液洗脱；收集Kd0.5之前的洗脱峰，加入乙醇至终浓度80％，离心收集多糖沉淀；多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次；经洗涤的多糖经冷冻干燥，获得2350mg精制肺炎链球菌14型多糖。
各项检定指标如下蛋白含量 0.18％核酸含量 0.19％氨基己糖含量 22.3％KD 0.15磷含量 0.1％总氮含量 3.1％鉴别试验 与肺炎链球菌14型抗血清产生特异沉淀线内毒素含量 0.025EU/微克多糖实施例23采用生物反应器对肺炎链球菌15B型进行发酵；于对数生长期后期用脱氧胆酸钠杀菌后，离心收集上清液；上清用50kD超滤膜浓缩10倍，加入CaCl2至0.5mol/L，加入乙醇至终浓度25％，离心收集上清液；上清液加入乙醇至终浓度80％，离心收集多糖沉淀；多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次；洗涤后的多糖经冷冻干燥，获得肺炎链球菌15B型粗制多糖。
将30g粗糖按20mg/ml溶解于注射用水中，按照1∶1体积比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇体积比5∶1)抽提3次，4000g离心30分钟收集上清，上清加入氯化钙至0.5mol/L，加入乙醇至25％，4℃静置12小时，10000g离心1小时去除沉淀。上清液用30kD超滤膜超滤去除乙醇并浓缩至25mg/ml，上样于Sepharose 4FF柱，上样180毫升(柱体积的10％)。用0.3mol/L氯化钠溶液洗脱；收集Kd0.5之前的洗脱峰，加入乙醇至终浓度80％，离心收集多糖沉淀；多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次；经洗涤的多糖经冷冻干燥，获得2150mg精制肺炎链球菌15B型多糖。
各项检定指标如下蛋白含量 0.18％核酸含量 0.17％氨基己糖含量 17.6％KD 0.30磷含量 3.2％总氮含量 2.1％鉴别试验 与肺炎链球菌15B型抗血清产生特异沉淀线内毒素含量 0.025EU/微克多糖实施例24采用生物反应器对肺炎链球菌17F型进行发酵；于对数生长期后期用脱氧胆酸钠杀菌后，离心收集上清液；上清用50kD超滤膜浓缩10倍，加入CaCl2至0.5mol/L，加入乙醇至终浓度25％，离心收集上清液；上清液加入乙醇至终浓度80％，离心收集多糖沉淀；多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次；洗涤后的多糖经冷冻干燥，获得肺炎链球菌17F型粗制多糖。
将25g粗糖按15mg/ml溶解于注射用水中，按照1∶1体积比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇体积比5∶1)抽提3次，4000g离心30分钟收集上清，上清加入氯化钙至0.5mol/L，加入乙醇至25％，4℃静置12小时，10000g离心1小时去除沉淀。上清液用50kD超滤膜超滤去除乙醇并浓缩至25mg/ml，上样于Sepharose 4FF柱，上样90毫升(柱体积的5％)。用0.3mol/L氯化钠溶液洗脱；收集Kd0.5之前的洗脱峰，加入乙醇至终浓度80％，离心收集多糖沉淀；多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次；经洗涤的多糖经冷冻干燥，获得1350mg精制肺炎链球菌17F型多糖。
各项检定指标如下蛋白含量 0.21％核酸含量 0.22％甲基戊糖含量 23.6％KD 0.25磷含量 0.2％总氮含量 0.3％鉴别试验 与肺炎链球菌17F型抗血清产生特异沉淀线内毒素含量 0.025EU/微克多糖实施例25采用生物反应器对肺炎链球菌18C型进行发酵；于对数生长期后期用脱氧胆酸钠杀菌后，离心收集上清液；上清用50kD超滤膜浓缩10倍，加入CaCl2至0.5mol/L，加入乙醇至终浓度25％，离心收集上清液；上清液加入乙醇至终浓度80％，离心收集多糖沉淀；多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次；洗涤后的多糖经冷冻干燥，获得肺炎链球菌18C型粗制多糖。
将25g粗糖按15mg/ml溶解于注射用水中，按照1∶1体积比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇体积比5∶1)抽提3次，4000g离心30分钟收集上清，上清加入氯化钙至0.5mol/L，加入乙醇至25％，4℃静置12小时，10000g离心1小时去除沉淀。上清液用50kD超滤膜超滤去除乙醇并浓缩至25mg/ml，上样于Sepharose 4FF柱，上样90毫升(柱体积的5％)。用0.3mol/L氯化钠溶液洗脱；收集Kd0.5之前的洗脱峰，加入乙醇至终浓度80％，离心收集多糖沉淀；多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次；经洗涤的多糖经冷冻干燥，获得1750mg精制肺炎链球菌18C型多糖。
各项检定指标如下蛋白含量 0.18％核酸含量 0.23％甲基戊糖含量 16.8％KD 0磷含量 3.6％总氮含量 0.1％鉴别试验 与肺炎链球菌18C型抗血清产生特异沉淀线内毒素含量 0.025EU/微克多糖实施例26采用生物反应器对肺炎链球菌19A型进行发酵；于对数生长期后期用脱氧胆酸钠杀菌后，离心收集上清液；上清用50kD超滤膜浓缩10倍，加入CaCl2至0.5mol/L，加入乙醇至终浓度25％，离心收集上清液；上清液加入乙醇至终浓度80％，离心收集多糖沉淀；多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次；洗涤后的多糖经冷冻干燥，获得肺炎链球菌19A型粗制多糖。
将30g粗糖按20mg/ml溶解于注射用水中，按照1∶1体积比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇体积比5∶1)抽提3次，4000g离心30分钟收集上清，上清加入氯化钙至0.5mol/L，加入乙醇至25％，4℃静置12小时，10000g离心1小时去除沉淀。上清液用50kD超滤膜超滤去除乙醇并浓缩至25mg/ml，上样于Sepharose 4FF柱，上样90毫升(柱体积的5％)。用0.3mol/L氯化钠溶液洗脱；收集Kd0.5之前的洗脱峰，加入乙醇至终浓度80％，离心收集多糖沉淀；多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次；经洗涤的多糖经冷冻干燥，获得1850mg精制肺炎链球菌19A型多糖。
各项检定指标如下蛋白含量 0.15％核酸含量 0.18％氨基己糖含量 14.8％甲基戊糖含量 24.5％KD 0.15磷含量 5.6％总氮含量 1.5％鉴别试验 与肺炎链球菌19A型抗血清产生特异沉淀线内毒素含量 0.025EU/微克多糖实施例27采用生物反应器对肺炎链球菌19F型进行发酵；于对数生长期后期用脱氧胆酸钠杀菌后，离心收集上清液；上清用50kD超滤膜浓缩10倍，加入CaCl2至0.5mol/L，加入乙醇至终浓度25％，离心收集上清液；上清液加入乙醇至终浓度80％，离心收集多糖沉淀；多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次；洗涤后的多糖经冷冻干燥，获得肺炎链球菌19F型粗制多糖。
将25g粗糖按15mg/ml溶解于注射用水中，按照1∶1体积比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇体积比5∶1)抽提2次，4000g离心30分钟收集上清，上清加入氯化钙至0.5mol/L，加入乙醇至25％，4℃静置12小时，10000g离心1小时去除沉淀。上清液用50kD超滤膜超滤去除乙醇并浓缩至40mg/ml，上样于Sepharose 4FF柱，上样72毫升(柱体积的4％)。用0.1mol/L氯化钙溶液洗脱；收集Kd0.5之前的洗脱峰，加入乙醇至终浓度80％，离心收集多糖沉淀；多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次；经洗涤的多糖经冷冻干燥，获得1350mg精制肺炎链球菌19F型多糖。
各项检定指标如下蛋白含量 0.20％核酸含量 0.21％氨基己糖含量 14.3％甲基戊糖含量 25.3％KD 0.05磷含量 4.3％总氮含量 2.3％鉴别试验 与肺炎链球菌19F抗血清产生特异沉淀线内毒素含量 0.025EU/微克多糖实施例28采用生物反应器对肺炎链球菌20型进行发酵；于对数生长期后期用脱氧胆酸钠杀菌后，离心收集上清液；上清用50kD超滤膜浓缩10倍，加入CaCl2至0.5mol/L，加入乙醇至终浓度25％，离心收集上清液；上清液加入乙醇至终浓度80％，离心收集多糖沉淀；多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次；洗涤后的多糖经冷冻干燥，获得肺炎链球菌20型粗制多糖。
将25g粗糖按20mg/ml溶解于注射用水中，按照1∶1体积比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇体积比5∶1)抽提3次，4000g离心30分钟收集上清，上清加入氯化钙至0.5mol/L，加入乙醇至25％，4℃静置12小时，10000g离心1小时去除沉淀。上清液用50kD超滤膜超滤去除乙醇并浓缩至25mg/ml，上样于Sepharose 4FF柱，上样90毫升(柱体积的5％)。用0.3mol/L氯化钠溶液洗脱；收集Kd0.5之前的洗脱峰，加入乙醇至终浓度80％，离心收集多糖沉淀；多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次；经洗涤的多糖经冷冻干燥，获得1550mg精制肺炎链球菌20型多糖。
各项检定指标如下蛋白含量 0.17％核酸含量 0.19％氨基己糖含量 15.6％KD 0.35磷含量 2.6％总氮含量 1.6％鉴别试验 与肺炎链球菌20型抗血清产生特异沉淀线内毒素含量 0.025EU/微克多糖实施例29采用生物反应器对肺炎链球菌22F型进行发酵；于对数生长期后期用脱氧胆酸钠杀菌后，离心收集上清液；上清用50kD超滤膜浓缩10倍，加入CaCl2至0.5mol/L，加入乙醇至终浓度25％，离心收集上清液；上清液加入乙醇至终浓度80％，离心收集多糖沉淀；多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次；洗涤后的多糖经冷冻干燥，获得肺炎链球菌22F型粗制多糖。
将30g粗糖按15mg/ml溶解于注射用水中，按照1∶1体积比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇体积比5∶1)抽提3次，4000g离心30分钟收集上清，上清加入氯化钙至0.5mol/L，加入乙醇至25％，4℃静置12小时，10000g离心1小时去除沉淀。上清液用50kD超滤膜超滤去除乙醇并浓缩至30mg/ml，上样于Sepharose 4FF柱，上样90毫升(柱体积的5％)。用0.3mol/L氯化钠溶液洗脱；收集Kd0.5之前的洗脱峰，加入乙醇至终浓度80％，离心收集多糖沉淀；多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次；经洗涤的多糖经冷冻干燥，获得1750mg精制肺炎链球菌22F型多糖。
各项检定指标如下蛋白含量 0.19％核酸含量 0.16％糖醛酸含量 17.8％甲基戊糖含量 27.6％KD 0.30磷含量 0.1％总氮含量 0.2％鉴别试验 与肺炎链球菌22F型抗血清产生特异沉淀线内毒素含量 0.025EU/微克多糖实施例30采用生物反应器对肺炎链球菌23F型进行发酵；于对数生长期后期用脱氧胆酸钠杀菌后，离心收集上清液；上清用50kD超滤膜浓缩10倍，加入CaCl2至0.5mol/L，加入乙醇至终浓度25％，离心收集上清液；上清液加入乙醇至终浓度80％，离心收集多糖沉淀；多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次；洗涤后的多糖经冷冻干燥，获得肺炎链球菌23F型粗制多糖。
将25g粗糖按15mg/ml溶解于注射用水中，按照1∶1体积比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇体积比5∶1)抽提2次，4000g离心30分钟收集上清，上清加入氯化钙至0.5mol/L，加入乙醇至25％，4℃静置12小时，10000g离心1小时去除沉淀。上清液用50kD超滤膜超滤去除乙醇并浓缩至40mg/ml，上样于Sepharose 4FF柱，上样90毫升(柱体积的5％)。用0.1mol/L氯化钙溶液洗脱；收集Kd0.5之前的洗脱峰，加入乙醇至终浓度80％，离心收集多糖沉淀；多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次；经洗涤的多糖经冷冻干燥，获得2350mg精制肺炎链球菌23F型多糖。
各项检定指标如下
蛋白含量 0.16％核酸含量 0.21％甲基戊糖含量 42.6％KD 0磷含量 3.7％总氮含量 0.1％鉴别试验 与肺炎链球菌23F抗血清产生特异沉淀线内毒素含量 0.025EU/微克多糖实施例31采用生物反应器对肺炎链球菌33F型进行发酵；于对数生长期后期用脱氧胆酸钠杀菌后，离心收集上清液；上清用50kD超滤膜浓缩10倍，加入CaCl2至0.5mol/L，加入乙醇至终浓度25％，离心收集上清液；上清液加入乙醇至终浓度80％，离心收集多糖沉淀；多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次；洗涤后的多糖经冷冻干燥，获得肺炎链球菌33F型粗制多糖。
将30g粗糖按15mg/ml溶解于注射用水中，按照1∶1体积比加入氯仿-正丁醇混合液(氯仿∶正丁醇体积比5∶1)抽提3次，4000g离心30分钟收集上清，上清加入氯化钙至0.5mol/L，加入乙醇至25％，4℃静置12小时，10000g离心1小时去除沉淀。上清液用50kD超滤膜超滤去除乙醇并浓缩至25mg/ml，上样于Sepharose 4FF柱，上样90毫升(柱体积的5％)。用0.3mol/L氯化钠溶液洗脱；收集Kd0.5之前的洗脱峰，加入乙醇至终浓度70％，离心收集多糖沉淀；多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次；经洗涤的多糖经冷冻干燥，获得1850mg精制肺炎链球菌33F型多糖。
各项检定指标如下蛋白含量 0.22％核酸含量 0.18％KD 0.25磷含量 0.2％总氮含量 0.1％鉴别试验 与肺炎链球菌33F抗血清产生特异沉淀线内毒素含量 0.025EU/微克多糖本发明与现有技术的比较
从上表可以看出，本发明纯化获得的细菌多糖的蛋白含量、核酸含量、内毒素含量均优于现有技术，说明本发明是一种获得高纯度细菌多糖的新方法，本发明纯化获得的细菌多糖适合于制备疫苗。
权利要求
1.一种使用Sepharose 4FF凝胶对细菌多糖进行纯化的方法，具体步骤是(1)采用生物反应器对细菌进行发酵培养；(2)于对数生长后期杀菌，离心收集上清液；(3)制备粗制多糖；(4)对粗制多糖进行预处理，用截留分子量10～100kD的超滤膜超滤浓缩至多糖浓度为2～50mg/ml；(5)以2～15％柱体积上样于Sepharose 4FF凝胶柱，以含0.02～1.0mol/L氯化钠或氯化钙的洗脱液洗脱，收集Kd0.5之前的组分；(6)洗脱液加入乙醇至终浓度50-90％沉淀多糖，离心收集多糖沉淀；(7)沉淀分别用无水乙醇、丙酮各洗涤2次；(8)经冷冻干燥，获得高纯度的精制多糖。
2.根据权利要求1所述的使用Sepharose 4FF凝胶对细菌多糖进行纯化的方法，其特征是所述细菌为以下任一种b型流感嗜血杆菌、A群脑膜炎球菌、C群脑膜炎球菌、W135群脑膜炎球菌、Y群脑膜炎球菌、伤寒沙门氏菌、A群链球菌、B群链球菌、肺炎链球菌1型、肺炎链球菌2型、肺炎链球菌3型、肺炎链球菌4型、肺炎链球菌5型、肺炎链球菌6B型、肺炎链球菌7F型、肺炎链球菌8型、肺炎链球菌9N型、肺炎链球菌9V型、肺炎链球菌10A型、肺炎链球菌11A型、肺炎链球菌12F型、肺炎链球菌14型、肺炎链球菌15B型、肺炎链球菌17F型、肺炎链球菌18C型、肺炎链球菌19A型、肺炎链球菌19F型、肺炎链球菌20型、肺炎链球菌22F型、肺炎链球菌23F型、肺炎链球菌33F型。
3.根据权利要求1所述的使用Sepharose 4FF凝胶对细菌多糖进行纯化的方法，其特征是所述超滤膜截留分子量为50～100kD。
4.根据权利要求1所述的使用Sepharose 4FF凝胶对细菌多糖进行纯化的方法，其特征是所述洗脱液含有0.20～1.0mol/L的氯化钠或氯化钙。
5.根据权利要求1所述的使用Sepharose 4FF凝胶对细菌多糖进行纯化的方法，其特征是所述上样的多糖浓度为20～50mg/ml，上样量10％～15％。
全文摘要
本发明一种使用Sepharose 4FF凝胶对细菌多糖进行纯化的方法，属于生物技术领域，其步骤为在对细菌多糖进行预处理后，使用Sepharose 4FF凝胶对细菌多糖进行纯化，收集Kd 0.5之前的组分，可获得纯度高，内毒素含量低的细菌多糖。本发明获得的纯度高、内毒素含量低的细菌多糖适合于制备细菌多糖疫苗及细菌多糖结合疫苗。
文档编号C12R1/21GK1970779SQ20061004887
公开日2007年5月30日 申请日期2006年12月6日 优先权日2006年12月6日
发明者黄镇, 向左云 申请人:云南沃森生物技术有限公司