专利名称：从牛、羊血液中提取超氧化物歧化酶的方法
技术领域：
本发明涉及一种超氧化物歧化酶(SOD)的提取方法，特别是一种从牛、羊血液中提取超氧化物歧化酶的方法。
背景技术：
超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，缩写为SOD)是一种能够催化超氧阴离子自由基歧化反应的金属酶，具有延缓衰老、增强耐缺氧和抗疲劳、抗辐射、促进婴幼儿生长发育等作用，广泛地应用于医药、食品、化妆品等行业。目前从牛、羊血液中提取超氧化物歧化酶的方法通常采用的是取新鲜的牛、羊血液离心收集血红细胞，剧烈搅拌使其溶血，溶血后加入硫酸铵进行盐析，收集50％到90％的沉淀，利用高速离心机高速离心除去大部分杂蛋白，再利用三氯甲烷、乙醇、丙酮等有机溶剂进行沉淀，进一步除去杂蛋白，经过盐析、除去残留的硫酸铵、最后再经过柱层析系统(一般都经过两次柱层析)，才能分离得到较高比活的SOD。
但该方法的工艺比较复杂，生产周期长；由于使用了昂贵的柱层析系统、柱填料和高速离心机，成本较高，而且经过柱层析后，使产品的收率大大降低。
发明内容
本发明的目的在于提供一种工艺简单、生产周期短、成本低、产品收率及比活高，质量稳定的从牛、羊血液中提取超氧化物歧化酶的方法，从而克服现有技术的不足。
本发明是这样实现的它包括以下步骤；(1)、在新鲜的牛血液或羊血液中加入占血液重量0.2-0.5％的抗凝剂，在温度为4-8℃的低温下放置30-100分钟，待溶液分层，去掉大部分上清液后得到沉淀；(2)、将上述沉淀由室温迅速加温至40-50℃，保温10-30分钟后迅速降至室温，4000-6000转/分钟离心10-30分钟后去除沉淀，得到上清液；(3)、将上述上清液进行3-6级温度梯度处理后得到上清液a；(4)、对上清液a进行两级盐析首先加入硫酸铵，使盐析液饱和度为45-70％，充分搅拌使硫酸铵完全溶解，在温度为4-8℃下放置12-36小时后，4000-6000转/分钟离心10-30分钟后去除沉淀，得上清液b；继续在上清液b中加入硫酸铵，使盐析液饱和度为85-95％，充分搅拌使硫酸铵完全溶解，在温度为4-8℃下放置12-36小时后，4000-6000转/分钟离心10-30分钟，收集沉淀，得到沉淀一，余下的上清液在温度为4-8℃下放置12-36小时，用G4磨沙漏斗进行抽滤，收集沉淀，得到沉淀二；(5)、用浓度为0.05-0.2M、pH＝7.0的磷酸钾缓冲液分别溶解沉淀一和沉淀二，完全溶解后超滤去除残留的硫酸铵，经浓缩和冷冻干燥后，即可分别得到比活和纯度略有不同的两组超氧化物歧化酶成品。
上述步骤(1)中所用的抗凝剂是柠檬酸钠。
上述步骤(3)中，在进行3-6级温度梯度处理时，初级温度为40-50℃，终级温度为70-80℃，每两级间温度梯度差为5-10℃，每级梯度处理都是先由室温迅速升温至该级温度保持10-30分钟后再迅速降至室温，每级降温后进行4000-6000转/分钟的离心操作10-30分钟后去除沉淀。
与现有技术相比，本发明的生产工艺简单，生产周期短，成本低，成品酶的收率及比活高、质量稳定。整个加热过程中酶的比活提高将近10倍，而成品酶的收率可达到96％以上，除血红蛋白效果好；由于采用了温度梯度处理法及两级盐析，仅使用4000-6000转/分钟的低速离心机即可达到去除沉淀得到高收率产品的目的，成本较低；而且可以同时生产出两种比活和纯度不同的产品，供需要高纯度、高比活的医药行业，以及不需要很高比活的化妆品、食品及保健品行业。经检验，采用本发明的方法生产出的高纯度SOD酶冻干产品的存放期达到三年以上；SOD酶的紫外吸光谱采用730型分光光度计对SOD酶的紫外扫描，测得牛血的Cu.Zn-SOD的最大吸收值为261nm，A261/A280＝1.34，完全符合国家标准要求。
具体实施例方式本发明的实施例1从牛血中提取超氧化物歧化酶的方法(一)、在10kg新鲜的牛血中加入20g的柠檬酸钠抗凝剂，在温度为6℃的低温下放置80分钟，待溶液分层，去掉大部分上清液后得到8500ml沉淀；(二)、将上述沉淀由室温迅速加温至50℃，保温15分钟后迅速降至室温，4000转/分钟离心15分钟后去除沉淀，得到5000ml上清液；(三)、将步骤(2)得到的上清液进行3级温度梯度处理将步骤(2)得到的5000ml上清液由室温迅速升温至40℃，保持20分钟后再迅速降至室温，4000转/分钟离心10分钟后去除沉淀，得到4200ml的上清液一；将上清液一由室温迅速升温至50℃，保持15分钟后再迅速降至室温，4000转/分钟离心15分钟后去除沉淀，得到3000ml的上清液二；将上清液二由室温迅速升温至60℃，保持10分钟后再迅速降至室温，4500转/分钟离心10分钟后去除沉淀，得到1500ml上清液a；(四)、对上清液a进行两级盐析首先加入硫酸铵，使盐析液饱和度为60％，充分搅拌使硫酸铵完全溶解，在温度为6℃下放置24小时后，4500转/分钟离心15分钟后去除沉淀，得上清液b；继续在上清液b中加入硫酸铵，使盐析液饱和度为90％，充分搅拌使硫酸铵完全溶解，在温度为6℃下放置24小时后，5000转/分钟离心10分钟，收集沉淀，得到沉淀一，余下的上清液在温度为6℃下放置24小时，用G4磨沙漏斗进行抽滤，收集沉淀，得到沉淀二；(五)、用浓度为0.10M、pH＝7.0的磷酸钾缓冲液分别溶解沉淀一和沉淀二，完全溶解后超滤(10000M)去除残留的硫酸铵，经浓缩和冷冻干燥后，即可分别得到纯度和比活略为不同的两组超氧化物歧化酶成品，超氧化物歧化酶成品呈浅绿色冻干粉状，其总重约为7.5-10g。
本发明的实施例2从牛血中提取超氧化物歧化酶的方法(一)、在10kg新鲜的牛血中加入30g的柠檬酸钠抗凝剂，在温度为4℃的低温下放置30分钟，待溶液分层，去掉大部分上清液后得到8500ml沉淀；(二)、将上述沉淀由室温迅速加温至40℃，保温10分钟后迅速降至室温，4000转/分钟离心30分钟后去除沉淀，得到5100ml上清液；(三)将步骤(2)得到的上清液进行4级温度梯度处理将步骤(2)得到的5100ml上清液由室温迅速升温至40℃，保持10分钟后再迅速降至室温，4000转/分钟离心10分钟后去除沉淀，得到3600ml上清液一；将上清液一由室温迅速升温至45℃，保持15分钟后再迅速降至室温，4000转/分钟离心15分钟后去除沉淀，得到2500ml上清液二；将上清液二由室温迅速升温至50℃，保持20分钟后再迅速降至室温，4000转/分钟离心15分钟后去除沉淀，得到1600ml上清液三；将上清液三由室温迅速升温至55℃，保持30分钟后再迅速降至室温，4500转/分钟离心20分钟后去除沉淀，得到1000ml上清液a；(四)、对上清液a进行两级盐析首先加入硫酸铵，使盐析液饱和度为45-70％，充分搅拌使硫酸铵完全溶解，在温度为4℃下放置12小时后，4000转/分钟离心10分钟后去除沉淀，得上清液b；继续在上清液b中加入硫酸铵，使盐析液饱和度为85％，充分搅拌使硫酸铵完全溶解，在温度为4℃下放置12小时后，5000转/分钟离心15分钟，收集沉淀，得到沉淀一，余下的上清液在温度为4℃下放置12小时，用G4磨沙漏斗进行抽滤，收集沉淀，得到沉淀二；(五)用浓度为0.05M、pH＝7.0的磷酸钾缓冲液分别溶解沉淀一和沉淀二，完全溶解后超滤(10000M)去除残留的硫酸铵，经浓缩和冷冻干燥后，即可分别得到纯度和比活略为不同的两组超氧化物歧化酶成品，超氧化物歧化酶成品呈浅绿色冻干粉状，其总重约为7.5-10g。
本发明的实施例3从牛血中提取超氧化物歧化酶的方法(一)、在10kg新鲜的牛血中加入50g的柠檬酸钠抗凝剂，在温度为8℃的低温下放置100分钟，待溶液分层，去掉大部分上清液后得到8500ml沉淀；(二)、将上述沉淀由室温迅速加温至50℃，保温30分钟后迅速降至室温，6000转/分钟离心10分钟后去除沉淀，得到5300ml上清液；(三)将步骤(2)得到的上清液进行6级温度梯度处理将步骤(2)得到的5300ml上清液由室温迅速升温至50℃，保持10分钟后再迅速降至室温，4000/分钟离心30分钟后去除沉淀，得到3900ml上清液一；将上清液一由室温迅速升温至55℃，保持15分钟后再迅速降至室温，4500转/分钟离心25分钟后去除沉淀，得到2800ml上清液二；将上清液二由室温迅速升温至60℃，保持15分钟后再迅速降至室温，4000转/分钟离心30分钟后去除沉淀，得到1800ml上清液三；将上清液三由室温迅速升温至65℃，保持20分钟后再迅速降至室温，5000转/分钟离心15分钟后去除沉淀，得到1400ml上清液四；将上清液四由室温迅速升温至70℃，保持25分钟后再迅速降至室温，4500转/分钟离心25分钟后去除沉淀，得到1000ml上清液五；将上清液五由室温迅速升温至80℃，保持30分钟后再迅速降至室温，6000转/分钟离心10分钟后去除沉淀，得到800ml上清液a；(四)、对上清液a进行两级盐析首先加入硫酸铵，使盐析液饱和度为70％，充分搅拌使硫酸铵完全溶解，在温度为8℃下放置36小时后，5000转/分钟离心15分钟后去除沉淀，得上清液b；继续在上清液b中加入硫酸铵，使盐析液饱和度为95％，充分搅拌使硫酸铵完全溶解，在温度为8℃下放置36小时后，6000转/分钟离心10分钟，收集沉淀，得到沉淀一，余下的上清液在温度为8℃下放置36小时，用G4磨沙漏斗进行抽滤，收集沉淀，得到沉淀二；(五)用浓度为0.2M、pH＝7.0的磷酸钾缓冲液分别溶解沉淀一和沉淀二，完全溶解后超滤(10000M)去除残留的硫酸铵，经浓缩和冷冻干燥后，即可分别得到纯度和比活略为不同的两组超氧化物歧化酶成品，超氧化物歧化酶成品呈浅绿色冻干粉状，其总重约为7.5-10g。
本发明的实施例4从羊血中提取超氧化物歧化酶的方法(一)、在10kg新鲜的羊血中加入20g的柠檬酸钠抗凝剂，在温度为6℃的低温下放置80分钟，待溶液分层，去掉大部分上清液后得到8600ml沉淀；
(二)、将上述沉淀由室温迅速加温至50℃，保温15分钟后迅速降至室温，4000转/分钟离心15分钟后去除沉淀，得到5200ml上清液；(三)、将步骤(2)得到的上清液进行3级温度梯度处理将步骤(2)得到的5200ml上清液由室温迅速升温至40℃，保持20分钟后再迅速降至室温，4000转/分钟离心10分钟后去除沉淀，得到4000ml的上清液一；将上清液一由室温迅速升温至50℃，保持15分钟后再迅速降至室温，4000转/分钟离心15分钟后去除沉淀，得到3100ml的上清液二；将上清液二由室温迅速升温至60℃，保持10分钟后再迅速降至室温，4500转/分钟离心10分钟后去除沉淀，得到1600ml上清液a；(四)、对上清液a进行两级盐析首先加入硫酸铵，使盐析液饱和度为50％，充分搅拌使硫酸铵完全溶解，在温度为6℃下放置24小时后，4500转/分钟离心15分钟后去除沉淀，得上清液b；继续在上清液b中加入硫酸铵，使盐析液饱和度为90％，充分搅拌使硫酸铵完全溶解，在温度为6℃下放置24小时后，5000转/分钟离心10分钟，收集沉淀，得到沉淀一，余下的上清液在温度为6℃下放置24小时，用G4磨沙漏斗进行抽滤，收集沉淀，得到沉淀二；(五)、用浓度为0.10M、pH＝7.0的磷酸钾缓冲液分别溶解沉淀一和沉淀二，完全溶解后超滤(10000M)去除残留的硫酸铵，经浓缩和冷冻干燥后，即可分别得到纯度和比活略为不同的两组超氧化物歧化酶成品，超氧化物歧化酶成品呈浅绿色冻干粉状，其总重约为7.5-10g 。
本发明的实施例5从羊血中提取超氧化物歧化酶的方法(一)、在10kg新鲜的牛血中加入30g的柠檬酸钠抗凝剂，在温度为4℃的低温下放置30分钟，待溶液分层，去掉大部分上清液后得到8600ml沉淀；(二)、将上述沉淀由室温迅速加温至40℃，保温10分钟后迅速降至室温，4000转/分钟离心30分钟后去除沉淀，得到5300ml上清液；(三)将步骤(2)得到的上清液进行4级温度梯度处理将步骤(2)得到的5300ml上清液由室温迅速升温至40℃，保持10分钟后再迅速降至室温，4000转/分钟离心10分钟后去除沉淀，得到3400ml上清液一；将上清液一由室温迅速升温至45℃，保持15分钟后再迅速降至室温，4000转/分钟离心15分钟后去除沉淀，得到2600ml上清液二；将上清液二由室温迅速升温至50℃，保持20分钟后再迅速降至室温，4000转/分钟离心15分钟后去除沉淀，得到1700ml上清液三；将上清液三由室温迅速升温至55℃，保持30分钟后再迅速降至室温，4500转/分钟离心20分钟后去除沉淀，得到1100ml上清液a；(四)、对上清液a进行两级盐析首先加入硫酸铵，使盐析液饱和度为60％，充分搅拌使硫酸铵完全溶解，在温度为4℃下放置12小时后，4000转/分钟离心10分钟后去除沉淀，得上清液b；继续在上清液b中加入硫酸铵，使盐析液饱和度为85％，充分搅拌使硫酸铵完全溶解，在温度为4℃下放置12小时后，5000转/分钟离心15分钟，收集沉淀，得到沉淀一，余下的上清液在温度为4℃下放置12小时，用G4磨沙漏斗进行抽滤，收集沉淀，得到沉淀二；(五)用浓度为0.05M、pH＝7.0的磷酸钾缓冲液分别溶解沉淀一和沉淀二，完全溶解后超滤(10000M)去除残留的硫酸铵，经浓缩和冷冻干燥后，即可分别得到纯度和比活略为不同的两组超氧化物歧化酶成品，超氧化物歧化酶成品呈浅绿色冻干粉状，其总重约为7.5-10g。
本发明的实施例6从羊血中提取超氧化物歧化酶的方法(一)、在10kg新鲜的牛血中加入50g的柠檬酸钠抗凝剂，在温度为8℃的低温下放置100分钟，待溶液分层，去掉大部分上清液后得到8600ml沉淀；(二)、将上述沉淀由室温迅速加温至50℃，保温30分钟后迅速降至室温，6000转/分钟离心10分钟后去除沉淀，得到5500ml上清液；(三)将步骤(2)得到的上清液进行6级温度梯度处理将步骤(2)得到的5500ml上清液由室温迅速升温至50℃，保持10分钟后再迅速降至室温，4000/分钟离心30分钟后去除沉淀，得到4000ml上清液一；将上清液一由室温迅速升温至55℃，保持15分钟后再迅速降至室温，4500转/分钟离心25分钟后去除沉淀，得到2900m1上清液二；将上清液二由室温迅速升温至60℃，保持15分钟后再迅速降至室温，4000转/分钟离心30分钟后去除沉淀，得到1900ml上清液三；将上清液三由室温迅速升温至65℃，保持20分钟后再迅速降至室温，5000转/分钟离心15分钟后去除沉淀，得到1500ml上清液四；将上清液四由室温迅速升温至70℃，保持25分钟后再迅速降至室温，4500转/分钟离心25分钟后去除沉淀，得到1200ml上清液五；将上清液五由室温迅速升温至80℃，保持30分钟后再迅速降至室温，6000转/分钟离心10分钟后去除沉淀，得到900ml上清液a；(四)、对上清液a进行两级盐析首先加入硫酸铵，使盐析液饱和度为70％，充分搅拌使硫酸铵完全溶解，在温度为8℃下放置36小时后，5000转/分钟离心15分钟后去除沉淀，得上清液b；继续在上清液b中加入硫酸铵，使盐析液饱和度为95％，充分搅拌使硫酸铵完全溶解，在温度为8℃下放置36小时后，6000转/分钟离心10分钟，收集沉淀，得到沉淀一，余下的上清液在温度为8℃下放置36小时，用G4磨沙漏斗进行抽滤，收集沉淀，得到沉淀二；(五)用浓度为0.2M、pH＝7.0的磷酸钾缓冲液分别溶解沉淀一和沉淀二，完全溶解后超滤(10000M)去除残留的硫酸铵，经浓缩和冷冻干燥后，即可分别得到纯度和比活略为不同的两组超氧化物歧化酶成品，超氧化物歧化酶成品呈浅绿色冻干粉状，其总重约为7.5-10g。
权利要求
1.一种从牛、羊血液中提取超氧化物歧化酶的方法，其特征在于包括以下步骤(1)、在新鲜的牛血液或羊血液中加入占血液重量0.2-0.5％的抗凝剂，在温度为4-8℃的低温下放置30-100分钟，待溶液分层，去掉大部分上清液后得到沉淀；(2)、将上述沉淀由室温迅速加温至40-50℃，保温10-30分钟后迅速降至室温，4000-6000转/分钟离心10-30分钟后去除沉淀，得到上清液；(3)、将上述上清液进行3-6级温度梯度处理后得到上清液a；(4)、对上清液a进行两级盐析首先加入硫酸铵，使盐析液饱和度为45-70％，充分搅拌使硫酸铵完全溶解，在温度为4-8℃下放置12-36小时后，4000-6000转/分钟离心10-30分钟后去除沉淀，得上清液b；继续在上清液b中加入硫酸铵，使盐析液饱和度为85-95％，充分搅拌使硫酸铵完全溶解，在温度为4-8℃下放置12-36小时后，4000-6000转/分钟离心10-30分钟，收集沉淀，得到沉淀一，余下的上清液在温度为4-8℃下放置12-36小时，用G4磨沙漏斗进行抽滤，收集沉淀，得到沉淀二；(5)、用浓度为0.05-0.2M、pH＝7.0的磷酸钾缓冲液分别溶解沉淀一和沉淀二，完全溶解后超滤去除残留的硫酸铵，经浓缩和冷冻干燥后，即可分别得到比活和纯度略有不同的两组超氧化物歧化酶成品。
2.根据权利要求1所述的从牛、羊血中提取超氧化物歧化酶的方法，其特征在于步骤(1)中所用的抗凝剂是柠檬酸钠。
3.根据权利要求1所述的从牛、羊血中提取超氧化物歧化酶的方法，其特征在于步骤(3)中，在进行3-6级温度梯度处理时，初级温度为40-50℃，终级温度为70-80℃，每两级间温度梯度差为5-10℃，每级梯度处理都是先由室温迅速升温至该级温度保持10-30分钟后再迅速降至室温，每级降温后进行4000-6000转/分钟的离心操作10-30分钟后去除沉淀。
全文摘要
本发明公开了一种从牛、羊血液中提取超氧化物歧化酶的方法，它将新鲜的牛血液或羊血液经过抗凝、沉淀、3－6级的温度剃度处理、盐析、超滤及浓缩、冷冻干燥等生产步骤处理后即可同时得到比活和纯度略有不同的两组超氧化物歧化酶成品，与现有技术相比，本发明具有工艺简单、生产周期短、产品收率及比活高、质量稳定、成本低等特点，经济效益十分显著。
文档编号C12N9/08GK1916168SQ20061005120
公开日2007年2月21日 申请日期2006年9月4日 优先权日2006年9月4日
发明者谭亚兰, 李蒙 申请人:云南呈贡光明亚南经贸有限责任公司