专利名称：鸟巢蕨植物的组培育苗方法
技术领域：
本发明涉及植物组织培养技术领域，具体是鸟巢蕨植物的组培育苗方法。
背景技术：
鸟巢蕨(Asplenium nidus)铁角蕨科巢蕨属，别名山苏花、鸟蕨羊齿、山翅菜、歪头菜、老鹰翅，属于多年生常绿附生蕨类植物，株高可达1米～1.2米，根状茎短，顶部纤维状分枝、卷曲。叶丛生于短茎顶端，向四周辐射状排列，呈鸟巢状，叶柄圆柱形，长约5厘米，叶片阔披针状，草质，浅绿色，两面光滑，叶长约100厘米。鸟巢蕨株形丰满，叶色葱绿，喜阴凉环境，较耐低温，养护管理较为粗放，抗病虫害能力极强，具有很强的适应性和极高的观赏价值，是布置厅堂、会场和制作花篮的良好观叶材料。鸟巢蕨在台湾也是用途最广的蕨类，不论蔬菜、叶材和盆栽皆有其重要性，这也是造就它大面积栽培的主要原因。鸟巢蕨传统繁殖方法主要采用切割母株和孢子播种两种方法。(1)切割法鸟巢蕨没有匍匐茎，也没有不定芽，一般只有一个顶芽，当顶芽受伤时生长点才会长出侧芽，所以将其短缩茎纵切1/2或1/4分别种植，二、三个月后在伤口近芽体处会长出新的芽体，再将其分切就可分离出许多植株。这种方法繁殖率很低，且容易伤害母株，所以很少采用。(2)孢子播种法鸟巢蕨孢子着生于叶背，当孢子成熟时会转成褐色，此时即可采集播种。首先将已有孢子成熟的叶片剪切，用刀片小心将孢子刮下收集起来，贮藏在干燥阴凉处，或将带有孢子的叶片部分切成块状并风干。播种使用清洁且较细小的介质如细蛇木屑、泥炭土、炭化稻壳或水苔等，将介质装在透明塑胶盒或水稻秧盘内，将孢子均匀撒播在介质上或者将带有孢子的叶片以孢子面朝上放置，然后盖上盖子或用保鲜膜封好以保持高湿度，并置于有遮荫的温室床下或室内较明亮处。孢子播种后约10天就可发芽并开始形成配子体，经3个月开始长出孢子叶，至6-8个月时才可陆续将较大的植株移植。从上可以看出孢子播种法周期也比较长，更重要的是它对温度和湿度要求很高，在浙江省地区自然条件下，孢子播种法孢子萌发率很低，很难分化出苗，不容易得到大量种苗，也难以被生产采用。另外，由于鸟巢蕨孢子细小且有绒毛，因而取材和消毒困难，生产可操作性差，且易发生变异。
发明内容
本发明旨在提供一种鸟巢蕨植物的组培育苗方法，以便在短期内获得大量种苗，实现鸟巢蕨植物组织培养的工厂化育苗。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为该鸟巢蕨植物的组培育苗方法，其特征在于包括以下步骤a、获取无菌材料将鸟巢蕨置于干净的室内进行养护，避免浇水，待幼叶萌发后，剪取新萌发的弯曲幼叶，清洗、消毒后，切成小块的外植体；b、培养I、初始培养；以改良MS+6-BA2.0～3.0mg/L+NAA0.1～0.3mg/L+AC1.0g/L为初始诱导培养基，将外植体放入诱导培养基上培养，待萌发出芽并变成丛生苗后进行增殖培养；II、增殖培养；以MS+6-BA0.5mg/L+AC0.5g/L为增殖培养基，将丛生苗切割分块后，接种在增殖培养基上增殖，再把新增殖的丛生苗继续切割分块接种，如此继续，从而在短时间内获得大量快繁苗；III、生根培养；以1/2MS+NAA0.1～0.2mg/L+IBA0.1～0.2mg/L为生根培养基，将快繁苗切割成单棵小苗后接种到生根培养基上生根；c、炼苗将生根后的快繁苗移栽至育苗基质上，遮荫、保温、保湿及通风条件下，培育成幼苗。
所述的改良MS是用硝酸根离子取代了氯离子且维持其中的氮含量不变的MS。研究发现，较高浓度的氯离子对鸟巢蕨植物的培养不利，用硝酸根离子取代后培养效果明显好转。
所述的改良MS优选为含NH4NO31410.5mg/L，KNO31900mg/L，MgSO4·7H2O370mg/L，KH2PO4170mg/L，Ca(NO3)2·4H2O706.8mg/L，微量元素、铁盐及有机成分用量同MS。
所述获取无菌材料步骤中的清洗与消毒程序为用中性洗衣粉浸泡清洗，然后用自来水流水冲洗干净，在超净工作台无菌条件下，先用75％酒精浸泡消毒30秒，然后无菌水冲洗3次，再放入0.1％的升汞溶液中消毒6～8分钟，再用无菌水冲洗5次，用无菌纱布吸去材料表面的水分。
所述育苗基质为珍珠岩和沙砾，其中珍珠岩与沙砾的体积比为5∶1。
所述诱导培养基、增殖培养基及生根培养基在使用前经过了灭菌处理，灭菌条件为121℃～126℃、103kPa～137kPa，且三种培养基在灭菌前pH为5.9～6.0。
所述诱导培养基和增殖培养基中都加有普通食用蔗糖30g/L和强度900g/cm2琼脂粉5.0g/L，生根培养基中加有普通食用蔗糖20g/L和强度900g/cm2琼脂粉5.0g/L。
所述初始培养和增殖培养培养温度为25±2℃，光照强度1500～2000lx；生根培养温度为15℃～30℃，用自然光培养，光照强度控制在1500～5000lx。
所述炼苗步骤中，在炼苗成活后用1/4MS营养液进行了施肥，以增强植株长势。
所述炼苗步骤中采用了带智能电子传感设备的育苗系统，以比较精确地控制苗床温度和湿度，且该育苗系统具有叶面自动施肥和杀菌功能。
本发明与现有技术相比，具有以下有益效果1、取材容易、极易获得无菌材料，且保持品种特性不变。
以前有文献报道，采用鸟巢蕨孢子无菌播种的方式进行繁殖，但由于鸟巢蕨孢子细小且有绒毛，造成取材和消毒困难，生产可操作性差，且易发生变异。而本方法是采用其新发的幼小嫩叶做为外植体，取材和消毒都比较容易掌握，具有很强的可操作性和可重复性，且能保持品种特性极少变异。
2、增殖系数较好，月增殖达到5～6倍，可在短时间内生产出大量的种苗，且生产不受季节限制，容易形成规模，具有很强的工厂化生产前景。以获得30个无菌外植体计算，在一年内至少可获得5千万株性状统一的种苗，具有很强的工厂化生产能力。
3、本技术在保证组培苗品质的同时，尽可能采取了植物组织培养简化程序，与传统组培生产比较，节约了大量的电能和极大降低了生产成本，增加了经济效益，具有很大的使用和推广价值。如整个生产过程采用自来水取代蒸馏水，普通食用蔗糖代替化学纯蔗糖，生根组培苗采用袋式自然光培养(即把将生根的组培苗放入组培育苗袋中，然后在洁净的PC板温室中进行自然光培养)。
4、采用自主开发的育苗系统，能够比较精确的控制苗床的温度和湿度，给鸟巢蕨组培苗创造一个良好的外在环境，提高了鸟巢蕨组培苗炼苗成活率，成活率可达到95％以上。该育苗系统通过智能电子传感设备，如夏季高温时，超过育苗所需的温度上限时或空气湿度低于育苗要求时，苗床都会自动喷雾降温，一旦满足设定的条件苗床喷雾系统即可停止喷雾。由于苗床采用通气性特别优良的珍珠岩和沙砾(体积比5∶1)作为育苗基质，所以在保持苗床湿润的同时不会产生积水问题。在冬季苗床温度也可以通过育苗仪器的智能管理，完全满足育苗所需的温湿度。我们开发的育苗系统还添加了叶面自动施肥和杀菌系统，即每隔一段时间，育苗系统就能把我们按照植物生长需求所配置的营养液或杀菌液通过苗床喷雾系统均匀喷洒在组培苗的叶面上。通过良好的环境控制措施，很好的保证组培苗在从异养向自养转化的过程中，仍然健康生长，且能在较短的时间内发育成正常植株，达到我们快速育苗要求。
具体实施例方式
以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例一1、培养基初始诱导培养基改良MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.1mg/L+AC1.0g/L。其中，改良MS含NH4NO31410.5mg/L，KNO31900mg/L，MgSO4·7H2O370mg/L，KH2PO4170mg/L，Ca(NO3)2·4H2O706.8mg/L，微量元素、铁盐、有机成分用量同MS。
增殖培养基MS+6-BA0.5mg/L+AC0.5g/L。
生根培养基1/2MS(大量元素减半)+NAA0.2mg/L+IBA0.1mg/L。
上述培养基高温高压(121℃-126℃，103kPa～137kPa)灭菌前PH为5.9-～6.0之间，初始诱导培养基和增殖培养基中分别加入普通食用蔗糖30g/L和强度900g/cm2琼脂粉5.0g/L，生根培养基中加入普通食用蔗糖20g/L和强度900g/cm2琼脂粉5.0g/L。
2、培养环境条件初始培养和增殖培养培养温度为25±2℃，光照1500～2000lx。鸟巢蕨组培苗生根培养温度为15℃～30℃，用自然光培养，光照强度控制在1500～5000lx。
3、无菌材料的获得在取外植体前先把鸟巢蕨放入干净的室内，养护一个月，避免浇水。一个月后，把鸟巢蕨新萌发的弯曲幼叶用手术剪刀剪取，再用中性洗衣粉浸泡清洗，然后用自来水流水冲洗干净。在超净工作台无菌条件下，先用75％酒精浸泡消毒30秒，然后无菌水冲洗3次，再放入0.1％的升汞溶液中消毒6-8分钟，再用无菌水冲洗5次，用无菌纱布吸去材料表面的水分，切成1mm左右的小块。
4、诱导分化情况(初始培养)将小块放入诱导培养基上培养。10天后切口处开始膨大，30天后小块表面开始产生一些绿色球状小体。有的小块有些褐化，在无菌条件下取出切去褐化部分再转移到新的诱导培养基上。随着绿色球状小体的逐步增大，50天后有部分球状小体开始萌发出芽，然后变成丛生苗，表明诱导分化成功。
5、丛生苗扩繁(增殖培养)将丛生苗切割成2-～3棵为一丛，分别接种在增殖培养基上，大约35天左右每一小丛苗就增殖到10～12棵左右。且丛生苗都长势旺盛，颜色翠绿，部分从生苗还萌发少量的根。把新增殖的丛生苗继续切割分块接种，如此下去，可在短时间内获得大量快繁苗。
6、生根培养及炼苗把丛生苗切成单棵小苗然后接种到生根培养基上。培养25天左右鸟巢蕨萌发出很多细根，生根率可达100％，且组培苗叶片也迅速长大伸长。待根系长至2cm左右即可移栽。炼苗所用育苗基质为珍珠岩和沙砾，其中珍珠岩与沙砾的体积比为5∶1。移栽后管理，在移栽后的1个月内，最重要的工作是要做好遮荫，保温，保湿，通风这几方面的工作。我们摸索出利用智能控温间歇喷雾育苗系统，使生产出的组培苗炼苗成活率达到95％以上。炼苗成活后要及时用1/4MS营养液进行施肥，可增强植株长势，待30天后即可出圃。
实施例二本实施例除所用培养基外，其他做法与实施例一相同。
初始诱导培养基改良MS+6-BA3.0mg/L+NAA0.2mg/L+AC1.0g/L。其中，改良MS含NH4NO31410.5mg/L，KNO31900mg/L，MgSO4·7H2O370mg/L，KH2PO4170mg/L，Ca(NO3)2·4H2O706.8mg/L，微量元素、铁盐、有机成分用量同MS。
增殖培养基MS+6-BA0.5mg/L+AC0.5g/L。
生根培养基1/2MS(大量元素减半)+NAA0.1mg/L+IBA0.2mg/L。
实施例三本实施例除所用培养基外，其他做法与实施例一相同。
初始诱导培养基改良MS+6-BA2.5mg/L+NAA0.3mg/L+AC1.0g/L。其中，改良MS含NH4NO31410.5mg/L，KNO31900mg/L，MgSO4·7H2O370mg/L，KH2PO4170mg/L，Ca(NO3)2·4H2O706.8mg/L，微量元素、铁盐、有机成分用量同MS。
增殖培养基MS+6-BA0.5mg/L+AC0.5g/L。
生根培养基1/2MS(大量元素减半)+NAA0.2mg/L+IBA0.1mg/L。
权利要求
1.一种鸟巢蕨植物的组培育苗方法，其特征在于包括以下步骤a、获取无菌材料将鸟巢蕨置于干净的室内进行养护，避免浇水，待幼叶萌发后，剪取新萌发的弯曲幼叶，清洗、消毒后，切成小块的外植体；b、培养I、初始培养；以改良MS+6-BA2.0～3.0mg/L+NAA0.1～0.3mg/L+AC1.0g/L为初始诱导培养基，将外植体放入诱导培养基上培养，待萌发出芽并变成丛生苗后进行增殖培养；II、增殖培养；以MS+6-BA0.5mg/L+AC0.5g/L为增殖培养基，将丛生苗切割分块后，接种在增殖培养基上增殖，再把新增殖的丛生苗继续切割分块接种，如此继续，从而在短时间内获得大量快繁苗；III、生根培养；以1/2MS+NAA0.1～0.2mg/L+IBA0.1～0.2mg/L为生根培养基，将快繁苗切割成单棵小苗后接种到生根培养基上生根；c、炼苗将生根后的快繁苗移栽至育苗基质上，遮荫、保温、保湿及通风条件下，培育成幼苗。
2.根据权利要求1所述的鸟巢蕨植物的组培育苗方法，其特征在于所述的改良MS是用硝酸根离子取代了氯离子且维持其中的氮含量不变的MS。
3.根据权利要求1所述的鸟巢蕨植物的组培育苗方法，其特征在于所述的改良MS含NH4NO31410.5mg/L，KNO31900mg/L，MgSO4·7H2O 370mg/L，KH2PO4170mg/L，Ca(NO3)2·4H2O 706.8mg/L，微量元素、铁盐及有机成分用量同MS。
4.根据权利要求1或2或3所述的鸟巢蕨植物的组培育苗方法，其特征在于所述获取无菌材料步骤中的清洗与消毒程序为用中性洗衣粉浸泡清洗，然后用自来水流水冲洗干净，在超净工作台无菌条件下，先用75％酒精浸泡消毒30秒，然后无菌水冲洗3次，再放入0.1％的升汞溶液中消毒6～8分钟，再用无菌水冲洗5次，用无菌纱布吸去材料表面的水分。
5.根据权利要求1或2或3所述的鸟巢蕨植物的组培育苗方法，其特征在于所述育苗基质为珍珠岩和沙砾，其中珍珠岩与沙砾的体积比为5∶1。
6.根据权利要求1或2或3所述的鸟巢蕨植物的组培育苗方法，其特征在于所述诱导培养基、增殖培养基及生根培养基在使用前经过了灭菌处理，灭菌条件为121℃～126℃、103kPa～137kPa，且三种培养基在灭菌前pH为5.9～6.0。
7.根据权利要求1或2或3所述的鸟巢蕨植物的组培育苗方法，其特征在于所述诱导培养基和增殖培养基中都加有普通食用蔗糖30g/L和强度900g/cm2琼脂粉5.0g/L，生根培养基中加有普通食用蔗糖20g/L和强度900g/cm2琼脂粉5.0g/L。
8.根据权利要求1或2或3所述的鸟巢蕨植物的组培育苗方法，其特征在于所述初始培养和增殖培养培养温度为25±2℃，光照强度1500～2000lx；生根培养温度为15℃～30℃，用自然光培养，光照强度控制在1500～5000lx。
9.根据权利要求1或2或3所述的鸟巢蕨植物的组培育苗方法，其特征在于所述炼苗步骤中，在炼苗成活后用1/4MS营养液进行了施肥，以增强植株长势。
10.根据权利要求1或2或3所述的鸟巢蕨植物的组培育苗方法，其特征在于所述炼苗步骤中采用了带智能电子传感设备的育苗系统，以比较精确地控制苗床温度和湿度，且该育苗系统具有叶面自动施肥和杀菌功能。
全文摘要
本发明公开了一种鸟巢蕨植物的组培育苗方法，包括获取无菌材料、初始培养、增殖培养、生根培养及炼苗等步骤，无菌材料取自鸟巢蕨新萌发的弯曲幼叶，初始诱导培养基采用改良MS＋6－BA2.0～3.0mg/L＋NAA0.1～0.3mg/L＋AC1.0g/L，增殖培养基采用MS＋6－BA0.5mg/L＋AC0.5g/L，生根培养基采用1/2MS＋NAA0.1～0.2mg/L＋IBA0.1～0.2mg/L，炼苗采用了智能化育苗系统。本发明方法具有以下优点取材容易，极易获得无菌材料，变异率低、增值系数高，月增值倍数能达到5～6倍，组培苗生根率达到100％，炼苗成活率高达95％，具有很强的工厂化生产能力。
文档编号C12N5/04GK1868262SQ20061005206
公开日2006年11月29日 申请日期2006年6月20日 优先权日2006年6月20日
发明者杨广瑜 申请人:慈溪市蔬菜开发有限公司