犬干扰素α、制备方法和用途的制作方法

专利名称：犬干扰素α、制备方法和用途的制作方法
研究领域本发明属于生物制品领域，涉及犬干扰素α，特别涉及重组犬干扰素α及其突变体。
研究背景犬类动物作为伴侣动物、警犬、救护犬等在人类的生活中占据日益重要的地位，与之相伴的犬类各种病毒性疾病也在人们的生活中重复发生，有些成为人畜共患病的病原，引起全社会的关注。但在兽医临床方面，目前还没有一种治疗病毒性疾病的特效药。各种疫苗由于使用、保存、运输等方面的原因，往往使免疫程序失败，何况新的病毒在不断产生，疫苗的研发需要较长的时间，不能及时地用于临床治疗。因此，从兽医临床角度出发，综合控制犬病毒性疾病，需要安全、有效、副作用少、稳定性高，同时便于运输、储存、使用的药物。犬干扰素α可以一定程度地满足上述需要，它具有广谱的抗病毒活性，有很高的临床应用价值，如果能制成适于临床应用的制剂，将会有较高的应用价值。
1957年，英国科学家Alick Isaacs和Iean Lindenmann首次发现一种能够干扰病毒繁殖的物质，称之为干扰素(interferon，IFN)，从此开始了干扰素的研究工作。目前，重组人干扰素已广泛应用于治疗乙肝、丙肝等病毒性感染，且取得了不错的疗效。
1987年，Himmler等首先开始了犬干扰素α(CaINF-α)的研究工作，报道了CaINF-α基因序列(GenBank M28624.1 GI163973)Himmler A，HauptmannR，Adolf G R.Structure and expression in Escherichia coli of canine interferon-alphagenes.J Interferon Res.1987.7173，并申报了相关专利。将该基因重组到大肠杆菌中使其表达犬干扰素α，在犬细胞上测得生物活性为3×105U/L。我国的科学工作者于上世纪90年代也相续开始了犬干扰素α的研究工作，并在犬干扰素α的基因重组、克隆、表达等方面取得了一系列的研究结果。其中，夏春等夏春，汪明，夏兆飞.拉布拉犬和德国牧羊犬干扰素α基因克隆及测序.农业生物技术学报1999，7(3)进行了拉布拉多犬和德国牧羊犬干扰素α基因克隆及测序的研究，但没有后续的关于表达、应用等方面的研究报道。王艳等王艳，王海震，曹瑞兵等.犬α干扰素基因的高效表达及其活性测定.中国病毒学2005，20(2)189-192对犬干扰素α基因的克隆、表达和活性测定进行了比较系统的研究，经提取纯化的CaIFN-α在犬肾细胞(MDCK)上进行了生物活性测定，生物活性为5.11×105U/mg，但是未对犬干扰素的组合物、应用等进一步进行研究。迄今为止，尚无犬干扰素α突变体的研究报道，也未见重组犬干扰素α组合物和应用的研究方面的相关报道。
目前，文献报道中的犬干扰素α氨基酸序列完全相同，均为164个氨基酸组成的蛋白。本发明提供了一种犬干扰素α的突变体，将原序列第163位Arg替换为Gly。然后将该突变体基因进行重组，在大肠杆菌中进行表达，通过复性和纯化，获得了纯度大于95％的犬干扰素。在犬肾细胞上进行生物活性测定，生物活性达到了0.5～1×107U/mg，远高于文献报道的比活性水平，生物活性提高约10～20倍。这使犬干扰素α的临床用量降低了10～20倍，降低了生产成本，更重要的是可以降低甚至消除犬干扰素α的毒副作用，使犬干扰素α的商品化成为可能，也为兽医临床应用提供了价格低廉的抗病毒药品，有利于犬干扰素α的临床推广。
本发明还提供了犬干扰素α的组合物，犬干扰素α在本发明的组合物条件下，能保持长期的生物活性，具有良好的稳定性。将其制成制剂后，具有便于运输、储存和使用的特点。由于其临床应用的安全、稳定、和方便性能，使其具有广阔的应用前景。
专业术语解释在本说明中，“犬干扰素α”包括天然犬干扰素α、重组犬干扰素α和重组犬干扰素α的突变体。
天然犬干扰素α从犬体内、组织或血液中提取获得的干扰素α蛋白，常见的如犬白细胞干扰素α。
重组犬干扰素α应用基因重组技术，将犬干扰素α基因重组入原核、酵母、昆虫、真核等表达系统，经过体外培养表达而获得的犬干扰素α。
重组犬干扰素α突变体应用基因突变和基因重组技术获得的，和犬自身干扰素α的氨基酸序列不同的犬干扰素α。
本发明目的1.提供犬干扰素α的突变体，其氨基酸序列是SEQ ID NO.1。其生物活性高于重组犬干扰素α。
2.提供犬干扰素α突变体的基因，其核苷酸序列是SEQ ID NO.2。
3.提供一种犬干扰素αSEQ ID NO.1的制备方法。
4.提供一种犬干扰素α组合物，其特征在于1)含有犬干扰素α；2)含有保护剂；3)含有一种调节pH值3.0～9.0的缓冲盐。
5.提供一种犬干扰素α粉针剂和犬干扰素α水针剂及其制备方法。
6.提供犬干扰素α组合物在制备用于治疗犬瘟热、犬副流感、犬疱疹病毒感染、犬细小病毒性肠炎、犬传染性肝炎等病毒性疾病的药物中的用途。
本发明是这样实现的一、犬干扰素α突变体SEQ ID NO.1的获得本发明通过PCR点突变方法获得含有1个突变位点的干扰素基因SEQ ID NO.2。参照CIFN-α基因序列，设计合成正反向引物。在反向引物中，将原序列第163位Arg编码(CGT)改为Gly编码(GGT)。经过30次PCR循环，扩增出基因片段SEQ IDNO.2。
用限制性内切酶同时消化酶切低琼脂糖胶电泳回收SEQ ID NO.2的PCR产物和表达载体，然后进行回收，以外源目的DNA和载体DNA 2∶1的末端比例，用T4DNA连接酶进行粘性末端定向连接。重组质粒转化到CaCl2制备的BL21感受态细胞，涂布于含100ug/ml Ampicillin的LB琼脂板，30C培养16小时。
挑单菌落培养，用核酸内切酶法检测重组阳性克隆，得到的阳性克隆再测定DNA序列，和设计序列相符时即得到了含有犬干扰素α突变体SEQ ID NO.1重组质粒的工程菌。
二、重组犬干扰素α的表达将重组犬干扰素α(CIFN)或第163位Gly的犬干扰素α突变体(SEQ ID NO.1)基因分别与化学诱导型和温敏诱导型的大肠杆菌表达载体连接重组，并转入宿主菌，采用添加诱导剂或升温两种方法进行诱导表达，表达条件根据载体和宿主的特性来确定的。宿主菌可以是BL21、和/或JM109、和/或生物工程常用宿主菌，宿主菌的选择是以能表达犬干扰素α来确定的。
菌体通过离心的方法收集。使用高压匀浆、超声或球磨等常规的方法破碎菌体，然后离心，收集沉淀。可以通过离心、洗涤或/和色谱分离的方法对包涵体进行初步纯化。
获得的包涵体用高浓度变性剂溶解，变性剂可以是脲、盐酸胍、以及溶解包涵体常用的变性剂。溶解后的包涵体可以通过硫酸铵沉淀和色谱法进行纯化，也可以不经过纯化直接用于复性。
二、重组犬干扰素α的复性本发明中重组犬干扰素α以包涵体的形式表达，必须通过复性使其回复生物学功能。由于犬干扰素含有6个半胱氨酸残基，形成3对分子内二硫键，本发明在复性时添加氧化还原对，用以启动二硫键交换，促进正确二硫键形成，提高复性率。氧化还原对由含一定比例的氧化巯残基和还原巯残基组成，氧化巯残基的最佳浓度是0.05～2mmol/L，还原巯残基的最佳浓度是0.1～20mmol/L。氧化巯残基可以由氧化型谷胱甘肽、胱氨酸、或/和其他含有氧化巯残基的物质提供，还原型巯残基可以由还原型谷胱甘肽、半胱氨酸、巯基乙醇、或/和其他含有还原巯残基的物质提供。
包涵体溶解液可以采用透析法、稀释法、超滤法、色谱法等复性手段，降低变性剂的浓度，使犬干扰素处于有利于重折叠的溶液条件中，并最终使其恢复活性。
三、重组犬干扰素α的纯化本发明采用离子交换色谱法对犬干扰素α进行纯化。离子交换介质可以是SP-Sepharose、CM-Sepharose、以及常用的阳离子型交换介质。经过纯化后可得到电泳纯度大于95％的犬干扰素α。
四、犬干扰素α的组合物本发明提供了含有犬干扰素α的组合物，犬干扰素α可以是天然犬干扰素α、重组犬干扰素α或重组犬干扰素α的突变体。
犬干扰素α原液，调节pH值至3.0～9.0，优选pH值范围是6.5～7.5。加入保护剂、缓冲盐、也可以有选择地加入一种等渗剂或/和非离子型去污剂。保护剂可以是氨基酸、糖、明胶、或人白蛋白中的一种或几种。缓冲盐可以是磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐，以及药学可选用的缓冲盐中的一种或几种。等渗剂可以是氯化钠、氯化钾、甘露醇、甘油，以及药学可选用的等渗剂中的一种或几种。非离子型去污剂可以是聚山梨酯80，以及药学可选用的非离子型去污剂中的一种或几种。犬干扰素α的效价应为每剂1000单位～2000万单位。
氨基酸可以是甘氨酸、精氨酸、赖氨酸、丙氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、组氨酸、天冬氨酸、天冬酰氨、谷氨酰氨。优选精氨酸、甘氨酸、赖氨酸、谷氨酸。更优选甘氨酸和精氨酸。
糖类可以是甘露醇(2％～30％)、葡萄糖(1％～10％)、蔗糖(1％～10％)、乳糖(1～10％)。优选甘露醇。
五、犬干扰素α粉针剂的制备将犬干扰素α的原液，调节pH值3.0～9.0，加入保护剂、缓冲盐，也可以有选择地加入一种等渗剂或/和非离子型去污剂，在无菌条件下分装，冷冻干燥。即按犬干扰素α组合物要求，将组合物中所述的各种物质混合均匀，按每瓶1mL的装量进行分装，待冷冻干燥机隔板温度降至-30℃左右，在无菌条件下，将上述分装好的冻干瓶置冷冻干燥机中，维持1～3h。然后抽真空，使冻干箱内真空度将至150mbar以下，隔板进行程序升温，使隔板温度保持在共熔点温度以下5℃，维持12～20h。将隔板升温至20℃，维持2～4h，充氮气，压塞，取出冻干瓶，扎盖，即得。
六、犬干扰素α水针剂的制备将犬干扰素α的原液，调节pH值3.0～9.0，加入保护剂、缓冲盐，也可以有选择地加入一种等渗剂或/和非离子型去污剂，在无菌条件下灌装。即按犬干扰素α组合物要求，将组合物中所述的各种物质混合均匀，按每瓶1mL的装量在无菌条件下灌装，即得。
七、犬干扰素α稳定性试验将不同类型的犬干扰素α分别按实施例中犬干扰素α组合物及粉针剂和水针剂的制备方法进行制备，制备方法见实施例3～28。考察的样品组合物中均含有每剂总活性为200万单位的犬干扰素α，每剂的体积为1mL。犬干扰素α可以是重组犬干扰素α突变体、重组犬干扰素α和犬白细胞干扰素α。将不同类型的样品分别置于4℃冰箱和25℃恒温培养箱中保存。分别于0、1、2、3、6个月测定活性，以6个月后每瓶样品的总活性与0个月样品的总活性进行比较，计算活性保存率，活性保存率在95％以上者，判定为合格。
八、犬干扰素α的药效学试验人基因工程干扰素α的临床常用剂量为300万单位，按人的标准体重60kg进行换算，得出犬的使用剂量为15万单位/kg。因此，本发明以15万单位/kg的剂量对犬干扰素α治疗犬病毒性疾病进行研究。
犬干扰素可以是犬白细胞干扰素α、重组犬干扰素α和重组犬干扰素α突变体。给药途径可以是肌肉注射、皮下注射和静脉注射。制剂类型可以是粉针剂，也可以是水针剂。
本发明中所指的犬干扰素α粉针剂和水针剂的给药途径相同，因此，临床疗效应该只与给药剂量有关。本发明中用于药效学试验的药品采用犬干扰素α组合物1及粉针剂的制备方法制备，制备方法见实施例3。
为了验证是否不同组合物、不同剂型的犬干扰素样品具有相似的疗效，本发明按实施例3中方法将犬干扰素α组合物1制成水针剂，按实施例17和实施例22的方法，将犬干扰素α组合物15和组合物20分别制成粉针剂，用不同的组合物和剂型治疗犬瘟热，比较治疗结果。
具体实施例下面结合具体实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1重组犬干扰素α突变体的获得1)编码犬干扰素α突变体SEQ ID NO.1的基因SEQ ID NO.2的获得参照CIFN-α基因序列，设计合成正反向引物，在反向引物中，将原序列中第163位Arg编码(CGT)改为Gly编码(GGT)。以CIFN-α基因为模板，经过30次PCR循环，扩增出SEQ ID NO.2基因片段。经过PCR扩增的SEQ ID NO.2基因片段长度(522bp)与理论大小相符(见

图1)。
将SEQ ID NO.2基因片段分别与大肠杆菌化学诱导型载体(pJZ32)和升温诱导型载体(pJZ22)重组，方法如下。
用限制性内切酶同时消化酶切低琼脂糖胶电泳回收SEQ ID NO.2的PCR产物和表达载体，然后进行琼脂糖凝胶电泳，切下目的DNA带，以外源目的DNA和载体DNA 2∶1的末端比例，用T4 DNA连接酶进行粘性末端定向连接，构建示意图见图3。
取37℃振荡培养过夜的E.coli BL21(DE3)新鲜种子，接种于LB培养基中，37℃振荡培养2-3小时。冰浴10分钟，4℃4000r/min离心10min收集菌体，用预冷的100mMCaCl2溶液悬浮离心两次，再用100ul预冷的100mM CaCl2重悬菌体，即感受态细胞，立即用于质粒的转化。
将适量的质粒载体与目的基因的连接产物与100ul新鲜的感受态细胞混匀，冰浴30min，42℃水浴90秒，再冰浴2min，加入0.5mlLB培养基30℃培养1小时后涂布于含100ug/ml Ampicillin的LB琼脂板，30℃培养16小时。
挑取转化子接种于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，30□振荡过夜。收集菌体，按照常规方法小量抽提质粒，经过PCR扩增检验及酶切鉴定确定阳性克隆(见图2)，用双脱氧链终止法进行核苷酸序列分析，突变部分核苷酸序列见图4。
2)SEQ ID NO.1发酵表达温度诱导表达按1％接种量将SEQ ID NO.1工程菌接种于500ml TB培养液中，30□220rpm的振摇30-36h。一级菌按5％接种于15升发酵罐，30℃培养至OD＝5-6时，快速升温至42℃，诱导培养3小时，目的蛋白表达量约占菌体总蛋白的15％(见图5)。
化学诱导表达按1％接种量将SEQ ID NO.2工程菌接种于500ml TB培养液中，37□220rpm的振摇30-36h。一级菌按5％接种于15升发酵罐，37℃培养至OD＝5-6时，加入IPTG，诱导培养3小时，目的蛋白表达量约占菌体总蛋白的25％(见图5)。
诱导结束后，5000r/min离心，收集菌体。使用高压匀浆机破碎菌体，8000r/min离心20min，收集沉淀，即为包涵体。包涵体用8mol/L尿素，50mmol/L Tirs，1mmol/LEDTA，pH＝8.5溶解，浓度为500～800ug/mL，即得到包涵体溶解液。
3)SEQ ID NO.1的复性将上述包涵体溶解液以1∶10的比例稀释到含有0.3～0.7mol/L精氨酸，0.1mmol/L氧化型谷胱甘肽，1mmol/L还原型谷胱甘肽，pH＝8.5的折叠缓冲液中，室温放置24h，即得到具有天然活性的犬干扰素α。
4)SEQ ID NO.1的纯化上述经过复性的样品，用分子截留量为3kD的超滤膜超滤浓缩，至蛋白质浓度为1～2mg/mL，用盐酸调解pH＝4.0，上载阳离子交换色谱柱，阳离子交换色谱柱预先用20mmol/L乙酸-乙酸钠平衡。样品上载后，用20mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4，pH＝6.0淋洗，然后用20mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4，0.3mol/L NaCl，pH＝6.0洗脱，即得到纯度大于95％的犬干扰素α(见图6)。
5)SEQ ID NO.1的活性检测参照VSV病毒攻击细胞(MDCK)病变保护方法，设立标准品对照和空白对照，最后细胞以结晶紫染液染色，在酶联仪上测定样品的OD550值，并按指数回归方程计算相当于50％病变OD值的稀释度，即样品活性单位。测定SEQ ID NO.1纯化产物的活性约为1～2×106U/mg。
实施例2重组犬干扰素α(CIFN)的获得1)CIFN基因的获得参照CIFN-α基因序列，设计合成正反向引物，经过30次PCR循环，扩增出CIFN基因片段。经过PCR扩增的CIFN基因片段长度(522bp)与理论大小相符(见图1)。
将CIFN基因片段分别与大肠杆菌化学诱导型载体pJZ32和升温诱导型载体(pJZ32)重组，方法同实施例1。经过PCR扩增检验及酶切鉴定确定阳性克隆(见图2)，用双脱氧链终止法进行核苷酸序列分析(见图4)。
2)CIFN发酵表达
方法同实施例1。经过3h的发酵表达，温度诱导型和化学诱导型的重组CIFN蛋白表达量约占菌体总蛋白的12％和23％。
3)CIFN的复性方法同实施例1。
4)CIFN的纯化方法同实施例1。纯化电泳图见图7。
5)CIFN的活性检测方法同实施例1。测定CIFN纯化产物的活性约为4～6×105IU/mg。
实施例3犬干扰素α组合物1及其粉针剂和水针剂的制备组合物1每1mL溶液包含以下成分
粉针剂的制备按干扰素组合物要求，将组合物中所述的各种物质混合均匀，即得组合物1。将组合物1的溶液按每瓶1mL的装量进行分装，待冷冻干燥机隔板温度降至-30℃左右，在无菌条件下，将上述分装好的冻干瓶置冷冻干燥机中，维持1～2h。然后抽真空，使冻干箱内真空度将至150mbar以下，将隔板进行程序升温，使隔板温度保持在共熔点温度以下5℃，维持12～20h。将隔板升温至20℃，维持2～4h，充氮气，压塞，取出冻干瓶，扎盖，即得。
水针剂的制备按干扰素组合物要求，将组合物中所述的各种物质混合均匀，即得组合物1。将组合物1的溶液按每瓶1mL的装量在无菌条件下灌装，置4℃保存。
试验二、铂类化合物及铂类化合物增效剂的体内抑瘤作用。
按照试验一所述之方法测定铂类化合物及及铂类化合物增效剂的体内抑瘤作用，结果表明，阿霉素、表阿霉素、丝裂霉素C、放线菌素D或更生霉素等铂类化合物增效剂能够明显增强舒铂、双环铂、依铂、甲啶铂、西茜铂或匹克铂等铂类化合物的抑瘤作用(P＜0.05)。二者单独应用特别是局部给药均有一定的抑瘤作用(P＜0.05)，而联合应用具有明显的增效作用(P＜0.001)。
试验三、局部应用抗代谢类抗癌药物对铂类化合物的增效作用。
以大白鼠为试验对象，将2×105个肿瘤细胞皮下注射于其季肋部，待肿瘤生长14天后将其分为以下10组(见表2)。第一组为对照，第2到10组为治疗组，其中，第2组为舒铂，第3到6组分别为5-氟尿嘧啶、6-巯基嘌呤、甲氨蝶呤和托泊替康。第7到10组分别为舒铂与5-氟尿嘧啶、6-巯基嘌呤、甲氨蝶呤和托泊替康的联合。所有药物经均为瘤内放置，除舒铂为为10mg/kg外均，抗代谢类抗癌药物均为5mg/kg。治疗后第30天测量肿瘤体积大小，比较治疗效果(见表2)。
表2
注舒铂为铂类化合物，而5-氟尿嘧啶、6-巯基嘌呤、甲氨蝶呤和托泊替康均为抗代谢类抗癌药物。结果表明，与对照组相比，铂类化合物(第2组)及抗代谢类抗癌药物(第3到6组)单独应用均有一定的抑瘤作用(P＜0.05)。然而联合应用(第7到10组)具有明显的增效作用(P＜0.001)。
每1mL溶液包含以下成分
其制备方法类似于实施例3。
实施例8犬干扰素α组合物6及其粉针剂和水针剂的制备组合物6每1mL溶液包含以下成分
其制备方法类似于实施例3。
实施例9犬干扰素α组合物7及其粉针剂和水针剂的制备组合物7每1mL溶液包含以下成分
其制备方法类似于实施例3。
实施例10犬干扰素α组合物8及其粉针剂和水针剂的制备组合物8每1mL溶液包含以下成分
其制备方法类似于实施例3。
实施例11犬干扰素α组合物9及其粉针剂和水针剂的制备组合物9每1mL溶液包含以下成分
其制备方法类似于实施例3。
实施例12犬干扰素α组合物10及其粉针剂和水针剂的制备组合物10每1mL溶液包含以下成分
其制备方法类似于实施例3。
实施例13犬干扰素α组合物11及其粉针剂和水针剂的制备组合物11
每1mL溶液包含以下成分
其制备方法类似于实施例3。
实施例14犬干扰素α组合物12及其粉针剂和水针剂的制备组合物12每1mL溶液包含以下成分
其制备方法类似于实施例3。
实施例15犬干扰素α组合物13及其粉针剂和水针剂的制备组合物13每1mL溶液包含以下成分
其制备方法类似于实施例3。
实施例16犬干扰素α组合物14及其粉针剂和水针剂的制备组合物14每1mL溶液包含以下成分
其制备方法类似于实施例3。
实施例17犬干扰素α组合物15及其粉针剂和水针剂的制备组合物15每1mL溶液包含以下成分
其制备方法类似于实施例3。
实施例18犬干扰素α组合物16及其粉针剂和水针剂的制备组合物16每1mL溶液包含以下成分
其制备方法类似于实施例3。
实施例19犬干扰素α组合物17及其粉针剂和水针剂的制备组合物17每1mL溶液包含以下成分
其制备方法类似于实施例3。
实施例20犬干扰素α组合物18及其粉针剂和水针剂的制备组合物18每1mL溶液包含以下成分
其制备方法类似于实施例3。
实施例21犬干扰素α组合物19及其粉针剂和水针剂的制备组合物19每1mL溶液包含以下成分
其制备方法类似于实施例3。
实施例22犬干扰素α组合物20及其粉针剂和水针剂的制备组合物20每1mL溶液包含以下成分
其制备方法类似于实施例3。
实施例23犬干扰素α组合物21及其粉针剂和水针剂的制备组合物21每1mL溶液包含以下成分
其制备方法类似于实施例3。
实施例24犬干扰素α组合物22及其粉针剂和水针剂的制备组合物22每1mL溶液包含以下成分
其制备方法类似于实施例3。
实施例25犬干扰素α组合物23及其粉针剂和水针剂的制备组合物23每1mL溶液包含以下成分
其制备方法类似于实施例3。
实施例26犬干扰素α组合物24及其粉针剂和水针剂的制备组合物24
本发明选择的浆化温度对降低产品中Sb(III)含量作用显著，升高浆化温度，产品中Sb(III)含量明显降低。当控制浆化温度为95～105℃时，产品中Sb(III)的含量可降至0.1％以下，使锑酸钠达到一级品标准。原因是高温且剧烈搅拌下NaOH与Sb2O3反应速度加快，大大提高了Sb2O3生成中间产物偏亚锑酸钠的转化率，使浆化更充分，从而在氧化回流反应过程中Sb(III)氧化得更彻底，使产品中Sb(III)的含量大为降低。氧化回流温度的选择有助于减少产物对未反应的偏亚锑酸钠(NaSbO2)的包敷，使得Sb(III)尽可能地氧化为Sb(V)，利于锑酸钠的生成。若氧化温度过高，H2O2易分解造成浪费，使氧化不完全，不利于Sb(III)含量的降低，故控制氧化温度在55～70℃范围。
根据以上实验筛选出的最佳工艺条件，本发明进行了多批次的实验，得到了相应的产品。经过标准分析方法测定，获得了下表所示的结果。其中总锑含量(采用部颁标准的硫酸铈滴定法进行测定)表示的是元素锑的质量百分含量(wt.％)，产品纯度表示锑酸钠的质量百分含量。
产品质量分析及原料转化率
经测定，五个产品中Na2O的含量均在12～13％之间，属于部颁标准的一28中所述组合物及制备方法制成粉针剂和水针剂。重组犬干扰素α按实施例2中所述方法获得，按实施例3～28所述方法制成粉针剂和水针剂。犬白细胞干扰素为市售商品，测定其比活性后，按实施例3～28所述方法将其制成粉针剂和水针剂。对制备的各种样品进行了长达6个月的稳定性考察。考察的样品组合物中均含有总活性为200万单位的犬干扰素α。组合物分别制成粉针剂和水针剂。将各类样品分别置于4℃冰箱和25℃恒温培养箱中保存。于0、1、2、3、6个月测定活性，以6个月后每瓶样品的总活性与0个月样品的总活性进行比较，计算活性保存率，活性保存率在95％以上者，判定为合格。由于篇幅所限，本文只列出各组合物在放置6各月后的活性保存率。
试验结果表1～6分别给出了不同来源、不同剂型的犬干扰素α放置6个月后的活性保存率结果。由表1～6可以看出，各组合物制剂在4℃和25℃保存6个月都比较稳定，活性下降很少或几乎不下降，且各组合物样品间活性相差很小，说明犬干扰素α在本发明提供的组合物条件下，在4～25℃保存是稳定的。比较各组合物的活性保存率，保护剂为甘氨酸、精氨酸、甘露醇、人白蛋白以及人白蛋白与甘氨酸、精氨酸、甘露醇等的混合组合物似乎更有利于保持活性。该组合物对犬白细胞干扰素α、重组犬干扰素α和重组犬干扰素α突变体的活性保持均有作用。
表1犬白细胞干扰素α粉针剂组合物6个月的活性保存率
表2犬白细胞干扰素α水针剂组合物6个月的活性保存率
表3重组犬干扰素α粉针剂组合物6个月的活性保存率
表4重组犬干扰素α水针剂组合物6个月的活性保存率
表5重组犬干扰素α突变体粉针剂组合物6个月的活性保存率
表6重组犬干扰素α突变体水针剂组合物6个月的活性保存率
实施例30治疗犬瘟热试验犬48只，随机分为8组，每组6只。A～C、E～G组为犬干扰素治疗组。除非特别说明，本发明所指A组为重组犬干扰素α突变体，按实施例1和3制备粉针剂的方法制备。B组为重组犬干扰素α，按实施例2和3制备粉针剂的方法制备。C组为犬白细胞干扰素α治疗组，为市售商品。D组为阳性对照组。E组为重组犬干扰素α突变体，按实施例1和3制备水针剂的方法制备。F组为重组犬干扰素α突变体，按实施例1和17制备粉针剂的方法制备。G组为重组犬干扰素α突变体，按实施例1和22制备粉针剂的方法制备。
A～C、E～G组分别于接种犬瘟热后24h、48h和72h注射犬干扰素α，注射剂量为15万单位/kg。D组为攻毒对照组，接种犬瘟热后24h、48h和72h分别注射生理盐水。观察并记录临床症状，统计死亡数。表7给出了重组犬干扰素α对犬瘟热的治疗结果。可以看出，用犬干扰素α治疗犬瘟热，能明显提高病犬的存活率。同时，临床观察也显示，重组犬干扰素α治疗组的发病犬症状明显比对照组轻。三种不同来源、不同剂型、不同组合物的犬干扰素，在治疗剂量相同的情况下，对犬瘟热的治疗效果没有明显不同。
表7犬干扰素α对犬瘟热的治疗效果
实施例31犬副流感试验犬24只，随机分为4组，每组6只。A组为重组犬干扰素α突变体治疗组，B组为重组犬干扰素α治疗组，C组为犬白细胞干扰素α治疗组，D组为阳性对照组。A、B、C三组分别于接种犬副流感病毒后24h、48h和72h注射犬干扰素α，注射剂量为15万单位/kg。D组为攻毒对照组，接种犬副流感病毒后24h、48h和72h分别注射生理盐水。观察并记录临床症状，统计死亡数。表8给出了犬干扰素α对犬副流感的治疗结果。可以看出，犬干扰素α治疗组能明显降低犬的发病数。虽然4组都没有病犬死亡，但临床观察也显示，用犬干扰素α治疗能改善患病犬的临床症状，促进病犬尽快痊愈。
表8犬干扰素α对犬副流感的治疗效果
实施例32犬疱疹病毒感染试验犬24只，随机分为4组，每组6只。A组为重组犬干扰素α突变体治疗组，B组为重组犬干扰素α治疗组，C组为犬白细胞干扰素α治疗组，D组为阳性对照组。A、B、C三组分别于接种犬疱疹病毒后24h、48h和72h注射犬干扰素α，注射剂量为15万单位/kg。D组为攻毒对照组，接种犬疱疹病毒后24h、48h和72h分别注射生理盐水。观察并记录临床症状，统计死亡数。表9给出了犬干扰素α对犬疱疹病毒的治疗结果。可以看出，犬干扰素α治疗组能明显降低犬的发病数，降低死亡率。同时，临床观察也显示，用犬干扰素α治疗能改善患病犬的临床症状，促进病犬尽快痊愈。
2、橙皮素新衍生物体外抑制AA大鼠PMφ合成LTB4实验用实验1相同的方法制备AA大鼠巨噬细胞(PMφ)悬浮液，将PMφ悬浮液分成38组，除AA组和阳性药FC外，其余8种待测橙皮素新衍生物和对照的橙皮素共9种化合物，每种分10-4mol.L-1、10-5mol.L-1、10-6mol.L-1和10-7mol.L-1四种浓度。每个浓度设3个复管，每管加入0.9mL PMφ悬浮液，然后分别加入待测样品和溶剂(10uL，DMSO浓度＜0.5％)，置于37℃恒温振荡水浴中温孵10min.，然后依次加入花生四烯酸5uL(终浓度50umol/L)、钙离子载体A231875uL(终浓度3umol/L)、CaCl2和MgCl2混合液0.1mL(终浓度5mmol/L)，37℃下继续温孵5min.，每管加入2mL无水乙醇终止反应，再加10.5mL蒸馏水使乙醇浓度稀释为15％；4℃下离心(5000g，10min.)，取上清液并用1M HCl调至Ph＝3。通过反相预处理柱(SEP-PAK C18Cartridge Waters Associates Milford MA)，并用15％乙醇20mL、蒸馏水20mL、石油醚20mL及乙酸乙酯10mL依次洗脱，收集乙酸乙酯洗脱液，减压下氮气吹干，残留物加200uL甲醇复溶，取100uL进样，反相HPLC检测LTB4(5-脂氧合酶产物)(Waters HPLC，6x150mm ODS C18柱)洗脱剂甲醇∶水∶醋酸(70∶30∶0.01)，流速0.8mL/min.，检测波长280nm。测定结果见表2。
从表2可以看出，本发明提供的橙皮素新衍生物体外抑制AA大鼠PMφ合成LTB4，的半数抑制浓度IC50均比橙皮素低(IC50越低，表明化合物抑制LTB4合成的能力越强)。其中化合物(8)、(4)和(9)的IC50分别为5.56×10-8、1.41×10-7和2.06×10-7mol·L-1，率。同时，临床观察也显示，用犬干扰素α治疗能改善患病犬的临床症状，促进病犬尽快痊愈。
表11犬干扰素α对犬细小病毒性肠炎的治疗效果
序列表<110>北京江中泽生科技有限责任公司 北京铁草科技有限公司<120>犬干扰素α、制备方法和用途<150>CN<160>2<170>PatentIn Version 2.1<210>1<211>492<212>DNA<213>人工<220>
<221>MUTAGEN<222>(487)<400>1TGCCACCTGC CCGACACCCA CGGCCTGCGC AACTGGAGGG TCCTGACGCT CCTGGGACAG 60ATGAGGAGAC TCTCCGCCGG CTCTTGTGAC CACTACACCA ATGACTTTGC CTTCCCCAAG 120GAGCTGTTTG ATGGCCAGCG GCTCCAGGAG GCGCAGGCCC TCTCTGTGGT CCACGTGATG 180ACCCAGAAGG TCTTCCACCT CTTCTGCCCG GACACGTCCT CTGCTCCTTG GAACATGACT 240CTCCTGGAGG AACTGTGCTC GGGGCTCTCT GAGCAGCTGG ATGACCTGGA GGCCTGTCCC 300
CTGCAGGAGG CGGGGCTGGC CGAGACCCCC CTCATGCATG AGGACTCCAC CCTGAGGACC 360TACTTCCAAA GGATCTCCCT CTACCTGCAA GACAGGAACC ACAGCCCGTG TGCCTGGGAG 420ATGGTCCGAG CAGAAATCGG GAGATCCTTC TTCAGCTCGA CCATCTTGCA AGAACGCATT 480CGTCGTGGTA AA 492<210>1<211>164<212>PRT<213>人工<220>
<221>MUTAGEN<222>(163)<400>2Cys His Leu Pro Asp Thr His Gly Leu Arg1 5 10Asn Trp Arg Val Leu Thr Leu Leu Gly Gln15 20Met Arg Arg Leu Ser Ala Gly Ser Cys Asp25 30His Tyr Thr Asn Asp Phe Ala Phe Pro Lys35 40Glu Leu Phe Asp Gly Gln Arg Leu Gln Glu45 50Ala Gln Ala Leu Ser Val Val His Val Met55 60
Thr Gln Lys Val Phe His Leu Phe Cys Pro65 70Asp Thr Ser Ser Ala Pro Trp Asn Met Thr75 80Leu Leu Glu Glu Leu Cys Ser Gly Leu Ser85 90Glu Gln Leu Asp Asp Leu Glu Ala Cys Pro95 100Leu Gln Glu Ala Gly Leu Ala Glu Thr Pro105 110Leu Met His Glu Asp Ser Thr Leu Arg Thr115 120Tyr Phe Gln Arg Ile Ser Leu Tyr Leu Gln125 130Asp Arg Asn His Ser Pro Cys Ala Trp Glu135 140Met Val Arg Ala Glu Ile Gly Arg Ser Phe145 150Phe Ser Ser Thr Ile Leu Gln Glu Arg Ile155 160Arg Arg Gly Lys16权利要求
1.一种犬干扰素α突变体，其特征在于和天然犬干扰素α不同，其氨基酸序列的第163位的精氨酸被甘氨酸所取代。
2.编码权利要求1的犬干扰素α突变体的基因。
3.权利要求1的犬干扰素α突变体的制备方法其特征在于是通过基因突变后再通过重组方法生产的。
4.一种含有犬干扰素α的组合物，其特征在于1)含有犬干扰素α；2)含有保护剂；3)含有一种调节pH值3.0～9.0的缓冲盐。
5.权利要求4所述的组合物，其特征在于所述组合物含有等渗剂或/和非离子去污剂。
6.权利要求4或5所述的组合物，其中所述犬干扰素α是重组犬干扰素α或天然犬干扰素α。
7.权利要求4～6任一项所述的组合物，其每剂中犬干扰素α含量为1000单位～2000万单位。
8.权利要求4所述的组合物，其中所述保护剂是氨基酸、糖、人白蛋白、明胶中的一种或几种。
9.权利要求4所述的组合物，其中所述缓冲盐是磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、或药学可选用的其它缓冲盐中的一种或几种。
10.权利要求5所述的组合物，其中所述等渗剂是氯化钠、氯化钾、甘露醇、甘油，或者药学可选用的其他等渗剂中的一种或几种。
11.权利要求5所述的组合物，其中所述非离子型去污剂是聚山梨酯类物质，或药学可选用的其它非离子型去污剂。
12.权利要求8所述的组合物，其中所述氨基酸是精氨酸、甘氨酸、赖氨酸、亮氨酸、酸性氨基酸中的一种或几种。
13.权利要求8所述的组合物，其中所述糖是甘露醇、葡萄糖、蔗糖、乳糖以及药学常用的单糖或二糖中的一种或几种。
14.权利要求4～13任一项所述的组合物，它是水针剂或粉针剂原液。
15.权利要求14所述的犬干扰素α粉针剂的制备方法，其特征在于将犬干扰素α的原液，调节pH值3.0～9.0，加入保护剂、缓冲盐，也可以有选择地加入一种等渗剂或/和非离子型去污剂，在无菌条件下分装，冷冻干燥。
16.权利要求14所述的犬干扰素α水针剂的制备方法，其特征在于将犬干扰素α的原液，调节pH值3.0～9.0，加入保护剂、缓冲盐，也可以有选择地加入一种等渗剂或/和非离子型去污剂，在无菌条件下灌装。
17.权利要求4～13所述的犬干扰素α组合物在制备用于治疗犬瘟热、犬副流感、犬疱疹病毒感染、犬细小病毒性肠炎、犬传染性肝炎病毒性疾病的药物中的用途。
全文摘要
本发明公开了一种犬干扰素α的突变体，其比活性为0.5～1×10
文档编号C12N15/09GK1861634SQ200610074938
公开日2006年11月15日 申请日期2006年4月6日 优先权日2006年4月6日
发明者任启生, 宋新荣, 陈黄实, 陈嫚, 李柏松 申请人:北京江中泽生科技有限责任公司, 北京铁草科技有限公司