专利名称：一种有核细胞体外分离试剂盒及其应用方法
技术领域：
本发明涉及生物医学技术领域，特别是涉及一种人体骨髓或脐带血中有核细胞体外分离试剂盒及其应用方法。
背景技术：
骨髓和脐带血是人的造血组织，含有丰富的各系造血干细胞/祖细胞及大量的成熟细胞，如红细胞、白细胞、血小板等，各系干细胞又因为各自表面所含有的抗原性不同，可以分为一百多种，如CD34、CD117、CD10、SCA-1、Lin-等。各系干细胞和成熟的白细胞均为有核细胞。有核细胞中包含单核细胞，多核细胞，淋巴细胞及各系干细胞/祖细胞，间充质细胞等。
目前国际国内从骨髓、脐带血中分离提取干细胞的方法很多有按照细胞的类型分离的，如单纯分离单核细胞、分离间充质干细胞、分离淋巴细胞等，有按其细胞表面抗原不同分离某一类干细胞的，如分离CD34、CD117、CD10等，所采用的方法有磁珠法，免疫荧光标记法，富选法，流式细胞仪法等。
这些方法所存在的共同问题是第一不能有效保留所有类型的干细胞，第二造价贵，第三技术条件要求较高，离工业化生产有一定的距离，在临床推广应用上有一定的难度。
发明内容
本发明的目的就在于克服上述现有技术的缺陷，提供一种从人类骨髓和脐带血中分离有核细胞的体外分离试剂盒，该技术不仅具有方法简单，造价低廉，可以工业化生产，易于推广的特点，最重要的可以保留骨髓和脐带血中所有的造血干细胞。
本发明的另一是目的提供采用上述试剂盒分离有核细胞的分离方法。
本发明的技术方案为一种有核细胞体外分离试剂盒，其特征在于该试剂盒中包含有红细胞沉淀剂、泛影酸钠-聚蔗糖400#或HISTOPAQUE1077和细胞保养液，各试剂溶液分开保存；所述红细胞沉淀剂是指由0.4％～1.2％的羟乙基淀粉或羧甲基淀粉或甲基纤维素与0.2％～0.4％葡萄糖酸钙组成的水溶液，该水溶液PH为7～8所述泛影酸钠-聚蔗糖400#由0.3％～1.5％泛影酸钠和8％的聚蔗糖400#组成的水溶液，钙水溶液PH值为7～8；所述细胞保养液为磷酸缓冲液或生理盐水；上述有核细胞体外分离试剂盒的应用方法，其工艺过程为首先用细胞保养液将骨髓或脐带血稀释，然后与红细胞沉淀剂混匀，静置8～20分钟后收取上清液，离心浓缩，浓缩液再加入泛影酸钠-聚蔗糖400#或HISTOPAQUE1077后离心分离20～30分钟，吸取有核细胞层，用细胞保养液清洗1～4次即可。
本发明既能分离骨髓又能分离脐带血，所分离出的有核细胞存活率≥98％，有核细胞回收率≥85％，如果能按无菌要求操作，在局部100级洁净工作台中，分离不会因试剂而污染而且所分离出的细胞表面没有任何标记物，不改变细胞的生物活性。
本发明的试剂盒可工业化生产，以实现了人类造血干细胞分离、纯化技术的推广，使医生可以象用药一样方便的使用细胞来治疗病人。
具体实施例方式
实施例1试剂盒组成1、红细胞沉淀剂0.4％的羧甲基淀粉与0.4％葡萄糖酸钙组成的水溶液，溶液PH值7.4；2、泛影酸钠-聚蔗糖400#0.3％的泛影酸钠和8％的聚蔗糖400#组成的水溶液，其PH值为7。
3、细胞保养液磷酸缓冲液(PBS)；上述三种液体配制后经过121℃，35分钟灭菌，测试内毒素含量≤0.5EU/ml，后分别存放在试剂盒中。
取100ml骨髓或脐带血，加100ml细胞保养液稀释，加20ml红细胞沉淀剂混匀后静置8～20分钟，收取上清液，以1200转/8分钟的速率离心浓缩。吸取浓缩液加到含有泛影酸钠-聚蔗糖400#的离心管中，做密度梯度离心30分钟，转速控制在1200转/分，吸取有核细胞层，再用细胞保养液清洗1～4次，用50ml细胞保养液稀释备用，取5μ1用臭酚蓝检测细胞存活率.再取5μ1进行细胞计数。
每100ml骨髓或脐带血分离的细胞总数不应少于2.6-5.9×107个细胞。
上述浓度为质量浓度。
实施例2试剂盒组成1、红细胞沉淀剂1.2％的羟乙基淀粉与0.2％的葡萄糖酸钙加水溶解所得的溶解液，PH值8；2、HISTOPAQUE1077；3、细胞保养液生理盐水；上述三种液体配制后经过121℃，35分钟灭菌，测试内毒素含量≤0.5EU/ml，后分别存放在试剂盒中。
具体应用方法同实施例1。
上述浓度为质量浓度。
实施例3试剂盒组成1、红细胞沉淀剂0.8％的甲基纤维素与0.3％的葡萄糖酸钙加水溶解所得的溶解液，PH值8；2、泛影酸钠-聚蔗糖400#；3、细胞保养液磷酸缓冲液(PBS)；上述三种液体配制后经过121℃，35分钟灭菌，测试内毒素含量≤0.5EU/ml，后分别存放在试剂盒中。
具体应用方法同实施例1。
上述浓度为质量浓度。
权利要求
1.一种有核细胞体外分离试剂盒，其特征在于该试剂盒中包含有红细胞沉淀剂、泛影酸钠-聚蔗糖400#或HISTOPAQUE1077和细胞保养液，各试剂溶液分开保存。
2.按照权利要求1所述的有核细胞体外分离试剂盒，其特征是所述红细胞沉淀剂是指由0.4％～1.2％的羟乙基淀粉或羧甲基淀粉或甲基纤维素与0.2％～0.4％葡萄糖酸钙组成的水溶液，该水溶液PH为7～8。
3.按照权利要求1所述的有核细胞体外分离试剂盒，其特征是所泛影酸钠-聚蔗糖400#由0.3％～1.5％泛影酸钠和8％的聚蔗糖400#组成的水溶液，该水溶液PH值为7～8。
4.按照权利要求1所述的有核细胞体外分离试剂盒，其特征是所述细胞保养液为磷酸缓冲液或生理盐水。
5.一种如权利要求1所述的有核细胞体外分离试剂盒的应用方法，其工艺过程为首先用细胞保养液将骨髓或脐带血稀释，然后与红细胞沉淀剂混匀，静置8～20分钟后收取上清液，离心浓缩，浓缩液再加入泛影酸钠-聚蔗糖400#或HISTOPAQUE1077后离心分离20～30分钟，吸取有核细胞层，用细胞保养液清洗1～4次即可。
全文摘要
本发明涉及一种人体骨髓或脐带血中有核细胞体外分离试剂盒及其应用方法，该试剂盒中包含有红细胞沉淀剂、泛影酸钠－聚蔗糖400
文档编号C12N5/0786GK1920012SQ20061010687
公开日2007年2月28日 申请日期2006年8月7日 优先权日2006年8月7日
发明者王怀林 申请人:王怀林