专利名称：锯缘青蟹呼肠孤病毒诊断试剂盒及检测方法
技术领域：
本发明涉及一种诊断试剂盒，具体地说，涉及一种针对水生经济动物病害的诊断试剂盒及其检测方法。
背景技术：
锯缘青蟹肉质鲜美、营养丰富，是我国重要的水产经济动物，在广东、福建、海南、浙江等省沿海地区养殖广泛。但是，随着养殖规模和密度的增加，病害日益严重，造成了很大的经济损失。导致病害的病原生物包括细菌、病毒、寄生虫等，种类繁多。2004年5-11月，在广东珠海市发生了流行病，死亡率超过70％。研究发现，呼肠孤病毒在其中有重要影响作用。到目前为止，对于病毒病还没有有效的治疗方法。防止病毒的传染和流行是能够采取的主要措施，早期快速诊断锯缘青蟹呼肠孤病毒是减少损失的有效途径，因此，简便快速、特异性好、灵敏度高的诊断试剂盒及其检测方法对于疾病的预防意义重大。
多聚酶链式反应(polymerase chain reaction，简称PCR技术)，是目前流行的一种体外扩增特异DNA片段的技术，具有快速、敏感、特异性强等特点，如能将这种技术应用于锯缘青蟹呼肠孤病毒的检测，将具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于克服现有锯缘青蟹呼肠孤病毒检测上存在的不足，提供一种简便快速，特异性好，灵敏度高的锯缘青蟹呼肠孤病毒诊断试剂盒。
本发明的另一个目的是提供利用上述试剂盒检测锯缘青蟹呼肠孤病毒的方法。
一种锯缘青蟹呼肠孤病毒的诊断试剂盒，包括下列部件(1)RNA提取液A液，为Trizol液；(2)RNA提取液B液，为氯仿；(3)RNA提取液C液，为异丙醇；(4)RNA提取液D液，为70％乙醇；(5)RNA提取液E液，为DEPC水；(6)RT反应液F液，包括Buffer、dNTP、随机引物、RNA酶抑制剂、DTT、反转录酶M-MLV RT；(7)RT-PCR反应液G液，包括含mg2+的Buffer、dNTP、正向引物F、反向引物R和Taq酶；F为5-TTCATTGGCATCCTGACTTT-3，R为3-CGTTTCCGAGTGGTTTACTT-5；(8)阳性对照H液，为呼肠孤病毒阳性模板。
利用上述试剂盒检测锯缘青蟹呼肠孤病毒的方法，包括如下步骤(1)取待检样品加10倍体积的A液，于匀浆器中冰浴匀浆，室温静置3～5min；
(2)在上述匀浆液中加入B液，B液的体积为A液体积的0.2倍，上下颠倒混匀，静置5～10min；(3)4～8℃，10000～12000r/min离心10～15min；(4)取上清液，加入等体积C液，轻轻晃动，静置10～15min；(5)4℃，10000～12000r/min离心10～15min；(6)弃上清，用预冷的D液洗涤，4～8℃，7500～10000r/min离心5～10min；(7)空气干燥或在超净工作台上吹干，加E液溶解，得到RNA提取液；(8)RNA提取液在65～70℃温育5min，立即置于冰上冷却5min；(9)取冷却后的RNA提取液，加入到四倍体积F液中，37～42℃孵育1h；然后95℃处理5～10min，得到RT-PCR反应模板；(10)将RT-PCR反应模板和阳性对照H液加入到G液中，混匀后离心，置于PCR仪上；(11)按下列条件扩增首先95℃5min，再94℃30sec、55℃30sec、72℃2min共30个循环，再72℃10min，10℃保存；(12)反应结束后加溴酚蓝混匀，经0.8％琼脂糖凝胶电泳20～30分钟后于紫外仪上观察；若在与阳性对照同一位置的433bp处出现明亮的反应条带，则为锯缘青蟹呼肠孤病毒阳性，说明待测样品含该病毒，否则为阴性。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果本发明依据从患病锯缘青蟹中分离到的一株呼肠孤病毒RNA序列设计的一对引物，建立反转录—聚合酶链式反应(RT-PCR)体系，在此基础上进行优化，建立锯缘青蟹呼肠孤病毒定性检测方法，此方法简便快速，特异性好，灵敏度高；可用于锯缘青蟹养殖过程中不同时期的病毒跟踪检测，也可用于环境监测，避免病毒传播流行，提高科学管理效率，具有很高的实用价值。
图1是感染锯缘青蟹呼肠孤病毒的锯缘青蟹鳃组织样品的PCR检测结果图。其中MDNA分子量标准；Lane 1CRV阴性对照；Lane2CRV阳性对照；Lane 3检测样品。
具体实施例方式
实施例1锯缘青蟹呼肠孤病毒的基因诊断试剂盒该试剂盒由以下各部分构成(10样份)1、RNA提取液A液，2管，5ml/管，内装Trizol液。
2、RNA提取液B液，1管，内装氯仿，共2ml。
3、RNA提取液C液，1管，内装异丙醇，共5ml。
4、RNA提取液D液，1管，内装70％乙醇，共10ml。
5、RNA提取液E液，1管，0.5ml/管，内装DEPC水。
6、RT反应液(F液)，1管，0.1ml/管，内装RT反应液，包括5×Buffer、dNTP、DEPC-H2O、随机引物、RNA酶抑制剂、反转录酶M-MLV(RT)。
7、RT-PCR反应液(G液)，1管，0.2ml/管，内装RT-PCR反应液，包括10×Buffer(含mg2-)、dNTP、正向引物F、反向引物R、ddH2O和Taq酶。
8、阳性对照(H液)，1管，20μl/管，内装CRV阳性模板。
9、长方体盒子，8.5×5.8×6.2cm3。
10、一块泡沫板，其大小与长方体盒子的底面相同，高2.2cm，有四排孔，第一排四个孔，孔径1.3cm，第二排五个孔，孔径1.0cm，第三、四排分别六个孔，孔径0.6cm。上述各小管分别对应放置于泡沫板的孔内，装于长方体盒子中。
该试剂盒中的内外一对引物的DNA序列如下F5-TTCATTGGCATCCTGACTTT-3R3-CGTTTCCGAGTGGTTTACTT-5RT反应液体系(10μl体系)如下5×Buffer2μldNTP 1μlDEPC-H2O3.3μl随机引物 1μlRNA酶抑制剂 0.2μl反转录酶M-MLV(RT)0.5μlRT-PCR反应液体系(20μl体系)如下10×Buffer(含mg2-) 2μldNTP 0.2μl
正向引物F0.2μl反向引物R0.2μlddH2O 15.2μlTaq酶0.2μl实施例2锯缘青蟹呼肠孤的检测方法使用实施例1的试剂盒，按下列步骤进行1、用无菌操作方法，取新鲜锯缘青蟹鳃组织0.1g加1ml A液，于匀浆器中冰浴匀浆，室温静置3～5min。
2、在上述匀浆液中加入200μl B液，上下颠倒混匀，静置5min。
3、4℃下，12000r/min离心10min。
4、取400μl上清，加入等体积C液，轻轻晃动，静置10min。
5、4℃下，12000r/min离心15min。
6、弃上清，用1ml预冷的D液洗涤2次，4℃下7500r/min离心5min。
7、空气干燥或在超净工作台上吹干，加50μl E液水溶解(若不能完全溶解可于55-60℃放置10min)。得到的RNA提取液可于-20℃保存。
8、将RNA提取液在65℃预热5min。
9、取2μl预热的RNA提取液，加入到8μl F液中，37℃下孵育1h；然后95℃水浴5min使失活，得到RT-PCR反应模板。
10、分别取2μl RT-PCR反应模板和阳性对照H液加入到18μl G液中，混匀后1000r/min离心10秒，置于PCR仪上。
11、按下列条件扩增首先95℃5min，再94℃30sec、55℃30sec、72℃2min共30个循环，再72℃10min，10℃保存；12、反应结束后取5～10μl(扩增产物)加4μl溴酚蓝混匀，经0.8％琼脂糖凝胶电泳20～30分钟(5V/cm)后于紫外仪上观察。若在433bp处出现明亮的反应条带(与阳性对照在同一位置)，则为CRV阳性，说明待测样品携带锯缘青蟹呼肠孤病毒，否则为阴性(见图1)。
权利要求
1.一种锯缘青蟹呼肠孤病毒的诊断试剂盒，其特征在于包括下列部件(1)RNA提取液A液，为Trizol液；(2)RNA提取液B液，为氯仿；(3)RNA提取液C液，为异丙醇；(4)RNA提取液D液，为70％乙醇；(5)RNA提取液E液，为DEPC水；(6)RT反应液F液，包括Buffer、dNTP、随机引物、RNA酶抑制剂、DTT、反转录酶M-MLV RT；(7)RT-PCR反应液G液，包括含mg2+的Buffer、dNTP、正向引物F、反向引物R和Taq酶；F为5-TTCATTGGCATCCTGACTTT-3，R为3-CGTTTCCGAGTGGTTTACTT-5；(8)阳性对照H液，为呼肠孤病毒阳性模板。
2.一种利用权利要求1所述试剂盒检测锯缘青蟹呼肠孤病毒的方法，其特征在于包括如下步骤(1)取待检样品加10倍体积的A液，于匀浆器中冰浴匀浆，室温静置3～5min；(2)在上述匀浆液中加入B液，B液的体积为A液体积的0.2倍，上下颠倒混匀，静置5～10min；(3)4～8℃，10000～12000r/min离心10～15min；(4)取上清液，加入等体积C液，轻轻晃动，静置10～15min；(5)4℃，10000～12000r/min离心10～15min；(6)弃上清，用预冷的D液洗涤，4～8℃，7500～10000r/min离心5～10min；(7)空气干燥或在超净工作台上吹干，加E液溶解，得到RNA提取液；(8)RNA提取液在65～70℃温育5min，立即置于冰上冷却5min；(9)取冷却后的RNA提取液，加入到四倍体积F液中，37～42℃孵育1h；然后95℃处理5～10min，得到RT-PCR反应模板；(10)将RT-PCR反应模板和阳性对照H液加入到G液中，混匀后离心，置于PCR仪上；(11)按下列条件扩增首先95℃5min，再94℃30sec、55℃30sec、72℃2min共30个循环，再72℃10min，10℃保存；(12)反应结束后加溴酚蓝混匀，经0.8％琼脂糖凝胶电泳20～30分钟后于紫外仪上观察；若在与阳性对照同一位置的433bp处出现明亮的反应条带，则为锯缘青蟹呼肠孤病毒阳性，说明待测样品含该病毒，否则为阴性。
全文摘要
本发明涉及一种诊断试剂盒，具体公开了一种锯缘青蟹呼肠孤病毒诊断试剂盒及检测方法。本发明的试剂盒及检测方法是依据从患病锯缘青蟹中分离到的一株呼肠孤病毒RNA序列设计的一对引物为主体而设计的。本发明采用反转录—聚合酶链式反应(RT－PCR)技术，对锯缘青蟹呼肠孤病毒的特异性RNA核酸片段进行定性检测，简便快速，特异性好，灵敏度高；可用于锯缘青蟹养殖过程中各时期的呼肠孤病毒跟踪检测，也可用于环境监测，避免病毒传播流行，提高科学管理效率，具有很高的实用价值。
文档编号C12Q1/68GK1940535SQ200610122460
公开日2007年4月4日 申请日期2006年9月27日 优先权日2006年9月27日
发明者郭志勋, 翁少萍, 何建国, 刘利利 申请人:中山大学