专利名称：一种制备红景天提取物的方法
技术领域：
本发明属于植物天然产物提取领域，具体地说涉及一种红景天提取物的制备方法。
背景技术：
红景天是指景天科红景天属植物，在世界上有90余种，多分布在北半球的高寒地带，大多数都生长在海拔3500-5000米左右的高山流石或灌木丛林下。我国有73种，主要分布在我国西藏的高山高寒地带，另外东北、西北、华北的一些地区也有红景天资源分布。
红景天的主要药用部位是根茎，主要有效成份是红景天素、红景天甙以及其甙元(酪醇)等，具有抗疲劳、抗缺氧、抗诱变和抑制肿瘤等功效，且本身并无副作用(宋月英等 红景天属植物化学成分及药理作用的研究进展 中草药.2004，35(2).-235-236；李刚等 藏药红景天的药理学研究进展 中国民族医药杂志.2004，10(3).-38-40；王家明 闫继平 王盛虔 红景天的药理作用研究进展中医药学报.2003，31(4).-57-59)，因此在药品和保健食品的开发中得到了广泛的应用。
当前对红景天中的红景天素、红景天甙等活性成分的主要提取方法是水提法和醇提法，水法提取成本低，方法简单；醇法提取成本较前者高，但提取液中可溶性固形物的含量(得率)相对于水提法较高，故传统红景天有效成分提取以醇提为更为常用(余华 何志礼 红景天有效成分的提取和加工适应性研究 食品工业科技.2002，23(8).-47-49)。
目前，由于对红景天的大量开发利用，使这种我国的特有药材资源面临枯竭的危机，如何在当前提取法的基础上开发新的提取方法以提高红景天中有效成分的产率，从而提高红景天原药的利用率，成为当前本领域急需解决的问题。
发明内容
本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种制备红景天提取物的方法。该方法包括以下步骤a、准备红景天根茎原料；b、加入微生物酶液酶解；c、将步骤b处理所得酶解产物进行醇提；d、除去c步骤醇提产物中的醇，得红景天提取物。
其中，上述方法步骤a中的红景天根茎原料准备过程是将红景天根茎按40～80目粉碎，再加入1～3倍重量的水浸泡、然后在80～120℃下加热蒸煮20～40分钟。优选的，按60目粉碎，加热蒸煮温度80～90℃，加热蒸煮30分钟。
其中，上述方法步骤b中的酶解为将微生物酶液加入30～50℃的红景天根茎原料中，保温酶解8～24小时。
优选的，酶解温度为40℃，酶解时间为12小时其中，上述方法步骤b中的微生物酶液为曲霉、木霉和根霉中的一种或多种的酶液。
进一步的，上述的微生物酶液是由以下方法制备得到的将麸皮和水拌匀后在115～125℃灭菌25～35分钟，冷却后接种曲霉、木霉或根霉，28～30℃培养36～48小时；然后加4～6倍水，在28～30℃下浸泡1～3小时，过滤或离心后取上清液，即得。
其中，上述方法的步骤c中的醇提为在80℃水浴中用醇回流浸提1～8次，每次醇加入量为使醇的终浓度为60％～85％，每次浸提时间为10～90min。优选的，浸提3～5次，每次浸提时间20～60min。
进一步的，上述的醇为乙醇。
本发明所要解决的第二个技术问题是提供一种红景天提取物，该红景天提取物是由上述的方法所制备而成的。
本发明所要解决的第三个技术问题是提供上述的红景天提取物在制备抗肿瘤、抗疲劳或抗缺氧功能的药物组合物或保健食品中的用途。
现有红景天提取物的提取工艺主要是采用直接用浓度约70％的醇类(酒精等)浸泡提取红景天原料，提取率和药效受红景天品种，植株部位和分布地域等影响。
本发明红景天提取物的制备方法与原工艺相比，在醇类提取之前，先用微生物酶液预处理，利用微生物所分泌的多种水解酶预处理红景天原料，使其组织疏松，纤维素及淀粉等成分分解，增加醇溶物质的溶出率(红景天有效成份多为醇溶物质)。
本发明所使用的微生物酶液是来源于曲霉(Aspergillus)、木霉(Trichoderma)或根霉(Rhizopus)中的一种或多种。其中根霉中常用日本根霉(Rhizopus japonicus)、米根霉(Rhizopus oryzae)和华根霉(Rhizopus chinensis)；木霉(Trichoderma)中常用绿色木霉(Trichoder mavirde)和里氏木霉(Trichoderma reesei)；曲霉中常用是黑曲霉(Aspergillus niger)和米曲霉(Aspergillus oryzae)。实际生产中可分别使用上述曲霉、木霉或根霉中的一种或多种进行浸提得到酶液，浸提酶液按应用需要还可以进行混合，以取得更好的效果。
本发明方法创造性地现有技术进行了改进，加入了微生物酶液处理的简单步骤，使整个方法能显著增加醇溶物质(含红景天有效成份)的溶出，使新工艺比现有工艺的浸取率提高约20％-30％，从而有效利用野生资源，大大增加了原材料利用率，提高了经济收益；同时本方法能降低药渣污染物的排量，实现对红景天的绿色开发。本发明红景天提取物中有效成分的含量比现有技术大为提高，其制备的药物组合物和保健食品的效果也得到了很大的增强，具有极好的市场前景。
下面通过对本发明较佳实施方式的详细描述对本发明进行说明，但不应理解为是对本发明的限制。本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变型，只要不脱离本发明的技术思想，均属于本发明所附权利要求所定义的范围。
具体实施例方式
实施例一 本发明微生物酶液的制备分别取2kg麸皮，各加水2kg，拌匀后，120℃灭菌30分钟，冷却后分别接种所需的各种曲霉、木霉或根霉，28～30℃培养40小时。然后每份各加水10kg，在30℃下浸泡2小时，过滤后取上清液，即分别得到20％的酶浸提液。
上述制得的曲霉、木霉或根霉的20％酶浸提液可以单独作为本发明微生物酶液使用，也可以按应用需要进行两种或三种的混合均匀后得到微生物酶液。
实施例二 红景天提取物的制备取10kg红景天根茎原料粉碎(40目)，加入3倍重量的水混合，加温至80～85℃35分钟，降温至40℃，按红景天根茎原料的重量加入按实施例1方法所制备的混合酶液(黑曲霉+绿色木霉)，混匀后在30℃保温酶解8小时。
向酶解后的混合液中加入乙醇至终浓度70％，提取2次，每次1小时。提取液离心(1800r/min，8min)后用400目筛绢过滤。将滤液在真空度0.015Mpa下减压蒸馏除乙醇，然后干燥得到红景天提取物2410g。
实施例三 红景天提取物的制备取50kg红景天原料粉碎(80目)，加入2倍重量的水混合，110～120℃蒸煮20分钟，降温至38℃，按红景天根茎原料的重量加入按实施例1方法所制备的混合酶液(米曲霉+绿色木霉)，混匀后在40℃保温12小时。向红景天酶解液中加入乙醇至终浓度65％，提取8次，每次20分钟。提取液离心(1800r/min，8min)后用400目筛绢过滤。将滤液在真空度0.015Mpa下减压蒸馏除乙醇，然后干燥得到红景天提取物12150g。
实施例四 红景天提取物的制备取50kg红景天原料粉碎(60目)，加入1倍重量的水混合，85～95℃蒸煮40分钟，降温至40℃，按红景天根茎原料的重量加入按实施例1方法所制备的混合酶液(米曲霉+黑曲霉)，混匀后在48℃保温酶解24小时。向红景天酶解液中加入乙醇至终浓度85％，提取5次，每次1.5小时。提取液离心(1800r/min，8min)后抽滤，将滤液在真空度0.015Mpa下减压蒸馏除乙醇，然后干燥得到红景天提取物11850g。
实施例五 红景天提取物的精制取实施例二、三和四的提取产物按现有常规方法制备成浸膏。
实施例六 红景天口服液的制备取实施例五所制得的浸膏3kg，添加适量矫味剂、无菌水和其他常规辅料，按常规制药工艺制备成红景天口服液。
实施例七 红景天胶囊的制备取实施例五所制得的浸膏5kg，添加适量药学上常用的辅料，按常规制药工艺制备成红景天胶囊。
试验例一 本发明方法的比较实验1、试验材料a、按常规醇提方法制备的红景天提取物取60目粉碎的红景天原料200g，加入2倍重量的水混匀，85～95℃蒸煮40分钟，加入乙醇至终浓度85％，提取5次，共5个小时。提取液离心(1800r/min，8min)后抽滤，将滤液在真空度0.015Mpa下减压蒸馏除乙醇，得到红景天提取物。
b、按本发明方法制备的红景天提取物分别取60目粉碎的红景天原料200g，加入2倍重量的水混匀，85～95℃蒸煮40分钟，降温至40℃，按原料重的15％加入本发明各种酶液(绿色木霉、米曲霉、黑曲霉、日本根霉、绿色木霉+米曲霉、米曲霉+黑曲霉、绿色木霉+黑曲霉)，同时还设立添加同样量的市售淀粉酶的对照组，混匀后在45℃保温8小时。向红景天酶解液中加入乙醇至终浓度85％，提取5次，共5个小时。提取液离心(1800r/min，8min)后抽滤，将滤液在真空度0.015Mpa下减压蒸馏除乙醇，得到红景天提取物。
将a、b所得的提取物加去离子水调节至同体积得到红景天提取物样品溶液。
2、检测项目及检测方法a、紫外分光光度法检测红景天提取物中有效成份含量(结果见表一)取红景天提取物样品溶液适当稀释，用去离子水作空白对照，用分光光度计测定在278nm处的吸光度值。
b、重氮盐比色法检测有效成份的含量(结果见表一)重氮化试剂甲液用浓盐酸溶解对氨基苯磺酸制成10％的溶液。称取对氨基苯磺酸1g，加浓盐酸10ml充分溶解即得10％的盐酸对氨基苯磺酸溶液。放在100ml容量瓶中，加水稀释至100ml即得到1％的该溶液。
乙液配10％的亚硝酸钠溶液。称取亚硝酸钠1g，加水至10ml，使之充分溶解即得10％的亚硝酸钠溶液。
重氮化反应的前处理红景天的提取物中，仍然含有蛋白和多糖，以及一些色素等从而使得红景天的提取物呈现暗红棕色和浑浊，影响产物的比色。用醋酸铅除去多糖和蛋白，饱和硫酸钠除去多余的铅离子。取红景天提取物样品5ml，加入10％的醋酸铅5ml和饱和的硫酸钠2ml，最后定容至25ml。沉淀完毕后8Krpm离心5min，取上清液用于重氮化反应。
重氮化显色反应取上清液5ml于20ml刻度比色管中，在其中加2％碳酸钠3ml和重氮化试剂3ml，摇匀显色5min，再加5％氢氧化钠0.5ml显色15min。整个过程都保持在4℃以下，稀释至1/10，分光光度计测定在489nm处的吸光度值。
c、重量法测定红景天总物质溶出(结果见表一)将称量皿在65℃烘箱中预烘一天，然后在102℃烘箱中烘至恒重，于天平上称重，为M1。取25ml的红景天提取物样品溶液，置于65℃烘箱中烘干，再在102℃烘箱中烘至恒重。同样在天平上称重，为M2。
干物质的重量M＝M2-M1。
总固形物溶出率＝M/25*样品溶液总体积数/药材取样量总固形物溶出率比＝各组总固形物溶出率/直接醇提的总固形物溶出率*100％表一 本发明方法的比较实验结果
3、试验结果分析本方法主要是采用真菌胞外水解酶来破坏红景天组织以提高红景天的溶出。其中纤维素酶酶活以木酶最高，黑曲霉和米曲霉次之，根霉几乎没有纤维素酶活；蛋白酶酶活以米曲酶最高，木霉和黑曲霉次之，而根霉最少；淀粉酶酶活则以黑曲霉最高，根霉和米曲霉次之，木霉最少；只有黑曲霉产果胶酶。从实验中的干物质溶出率来看，经霉菌水解酶处理后的溶出率都比对照高，尤其是黑曲霉和米曲霉，根霉对红景天的溶出率也有提高，但相比前三者，则要低些。表明在红景天的干物质溶出过程中，这些水解酶起了重要作用。紫外吸光度值除了根霉对应的吸光度值比对照的低以外，其余三种霉菌对应的值均比对照的高，特别是黑曲霉对应的样品最高，其次是米曲霉和木霉。根霉酶系作用差，可能是根霉产生的酶比较单一，主要是淀粉酶，蛋白酶不高，没有纤维素酶，不利于红景天的干物质溶出的缘故。重氮盐比色结果表明，除黑曲霉外，其他酶解样品的O.D489值均比对照高，说明酶处理后，红景天有效成份随着总物质溶出的提高而提高。
同时，本实验结果表明，不同霉菌酶系的组合作用优于单独霉菌酶系的作用，红景天有效成份的含量明显高于单种霉菌酶系的作用。其中，木霉和黑曲霉组合酶系综合效果最好，米曲酶和黑曲霉组合酶系其次。黑曲霉酶系中含酶种丰富，米曲霉酶系以蛋白酶为主，纤维素酶较少；而木霉酶系以纤维素酶为主，酶系组合后，酶种相互弥补，对红景天组织破解更彻底，溶出率大幅度提高。
本试验总体结果表明，本发明方法能有效提高提取物中总物质的溶出量和有效成份的得率，可使3％粗提物产品的产量增加10％～20％。
试验例二 本发明方法的药渣排量检测使用同样200g的原料，分别使用醇提法、超声波法、热蒸法和本发明方法制备红景天提取物，检测总固形物溶出(g)，固体排渣量和排渣率(以醇提法的排渣量为100％作为对照)。
表二 总固形物溶出量和排渣量检测
本试验结果表明(结果见表二)，本发明方法能够降低药渣的排放量。
试验例三 使用本发明方法所增加的经济收益在原料红景天干粉、水、20％酶液按1∶1∶1混合的情况下红景天干粉+水+20％酶液＝100kg+100kg+100kg(其中20％酶液100kg是用100kg水浸泡20kg麸皮固体酶制剂而成)，进行收益与成本的比较1、增加的成本a、红景天原料100kg，按原方法可得3％粗提物约18kgb、增加20kg麸皮固体酶制剂成本麸皮原料20kg×1.2元/kg＝24元生产成本20kg×0.6元/kg＝12元c、增加本工艺的成本约50元总成本＝24+12+50＝86元2、使用本发明方法所增加的净收益(红景天3％粗提物按市场价200元/kg计)采用本发明方法如增加20％粗提物增加净收益为3.6kg×200元/kg＝720元-86＝634元。
采用本发明方法如增加15％粗提物增加净收益为2.7kg×200元/kg＝540元-86＝454元。
采用本发明方法如增加10％粗提物增加净收益为1.8kg×200元/kg＝360元-86＝274元。
由上可见，使用本发明方法，平均每100kg原料可以增加274～634元的收益，大大增加了经济效益。
上述实例表明本发明提供红景天活性成分提取物的制备方法与原工艺相比，所得的红景天活性成分提取物的活性成分含量可提高约30％，能有效地利用野生资源，大大增加了原材料利用率并带来显著的经济效益；同时本方法能降低药渣污染物的排量，实现对红景天的绿色开发，具有极好的市场前景。
以上对本发明的详细描述并不限制本发明，本领域的技术人员可以根据本发明作出各种改变及变形，只要不脱离本发明的精神，均属于本发明所附权利要求所定义的范围。
权利要求
1.一种制备红景天提取物的方法，其特征在于包括以下几个步骤a、准备红景天根茎原料；b、加入微生物酶液酶解；c、将步骤b处理所得酶解产物进行醇提；d、除去c步骤醇提产物中的醇，得红景天提取物。
2.根据权利要求1所述的制备红景天提取物的方法，其特征在于所述的步骤a中的红景天根茎原料准备过程是将红景天根茎按40～80目粉碎，再加入1～3倍重量的水浸泡、然后在80～120℃下加热蒸煮20～40分钟。
3.根据权利要求1所述的制备红景天提取物的方法，其特征在于步骤b所述酶解为将微生物酶液加入30～50℃的红景天根茎原料中，保温酶解8～24小时。
4.根据权利要求3所述的制备红景天提取物的方法，其特征在于步骤b所述的微生物酶液来源于曲霉、木霉和根霉中的一种或多种。
5.根据权利要求4所述的制备红景天提取物的方法，其特征在于所述的微生物酶液是由以下方法制备得到的将麸皮和水拌匀后在115～125℃灭菌25～35分钟，冷却后接种曲霉、木霉或根霉，28～30℃培养36～48小时；然后加4～6倍水，在28～30℃下浸泡1～3小时，过滤或离心后取上清液，即得。
6.根据权利要求1所述的制备红景天提取物的方法，其特征在于步骤c所述的醇提为在80℃水浴中用醇回流浸提1～8次，每次醇加入量与原料的重量之比为使醇的终浓度为60％～85％，每次浸提时间为10～90min。
7.根据权利要求6所述的制备红景天提取物的方法，其特征在于所述的醇为乙醇。
8.一种红景天提取物，是由权利要求1～7任一项所述的方法所制备的。
9.权利要求8所述的红景天提取物在制备抗肿瘤、抗疲劳或抗缺氧功能的药物组合物或保健食品中的用途。
全文摘要
本发明提供了一种制备红景天提取物的方法。该方法在当前提取方法的基础上用微生物酶液对红景天进行酶解处理，使新工艺比现有工艺的得率大大提高，能有效利用野生药材资源，同时还能降低药渣等污染物的排量，实现中药的绿色开发，解决了当前本领域急需解决的问题，具有很好的应用前景。
文档编号C12R1/845GK1989991SQ200610146110
公开日2007年7月4日 申请日期2006年11月3日 优先权日2005年11月4日
发明者张静波, 邓小晨 申请人:四川宇妥藏药药业有限责任公司