蛋白质及其在诊断阿耳茨海默病中的应用的制作方法

专利名称：：蛋白质及其在诊断阿耳茨海默病中的应用的制作方法蛋白质及其在诊断阿耳茨海默病中的应用发明领域本发明的实施方式涉及用于例如结合试验、蛋白质和抗体纯化、治疗和诊断的肽。相关技术的描述阿耳茨海默病(AD)是一种目前不可治愈的神经退行性疾病，全世界有至少1500万人患有该病。AD主要发生于老年人，65岁老人的发病率约为1%，而85岁老人的发病率升高至预计40%。随着由于医疗条件的进步、预期寿命的增加、生育高峰期一代人的变老引起的人口整体老龄化，预计AD的整体发病率将升高，这给健康护理系统和患者以及他们的护理者和家庭带来了更加重的负担。现在还没有AD的有效治疗方法。现有的治疗方法如八^(^1@(盐酸多奈哌齐；PfizerCorp.)、Exelon②(酒石酸利伐斯的明；NovartisPharmaceuticalsCorp.)以及NamendaTM禾口Axura(美金冈lj;MerzPharmaKgaAandForestLaboratories,Inc.)能缓解轻度到中度AD患者的症状，但不能治本。AD的临床诊断也不完善；普通执业医师的诊断准确率约为50-60%，诊疗中心阿耳茨海默病专家的诊断准确率为80-90%(Molsa等，WeMra/.A^wmy^g./^yc/z/a^7，48(11):1085-90(1985);Rocca等，J肌脸,/.'79:415-424(1986);Burns等，層丄301(6759):1026(1990);Risse等，』m.J—，147(2):168-72(1990);Gilleard等，Jctoc/z/afr.85(4):264-9(1992);Mendez等，爿fe/^,wer流hoc.D/離d，6:35-43(1992);Fleming等，她yoC"".尸rac.，7:1093-1107(1995);Corey-Bloom等，7Vewra/ogy，45:211-218(1995);和Bowler等，iVewra/.A^wraswrg./^yc/w'a^y，64(1):18-24(1998)。出现最初症状与作出AD诊断之间的延误平均约为3年(Jost等，乂爿肌Gen'afr.Soc.，43(11):1248-55(1995))。已经公认的是，可靠的生物标记可有效帮助准确和早期诊断AD(Growdon等，A^wraWo/.Jg&g，79:109-116(1998))。尽管目前存在一些生化标记和遗传标记，但通常认为其临床-病理学相关性太低而无法供常规临床使用。例如，载脂蛋白Ee4等位基因是一种仅在50y。的AD病例中发现的遗传风险因子(Myers等，脸wra/ogy，46(3):673-7(1996))，而脑脊液(CSF)中的t和0淀粉样蛋白和血清AP的测量值在AD和非AD水平之间显著重叠，从而限制了它们的用途(Pirttila等，JA^ra/.，727(l):90-5(1994);Arai等，^朋.脸腳/.,38:649-652(1995);Jensen等，A^wmsc/.，186(2-3):189-91(1995);Motter等，^肌*腳/.,3S(4):643-8(1995);Munroe等，^"",MSd.，25(3):207-17(1995);Tata等，/*腳/A^画wg.c/z/欣，59:280-283(1995);Vigo-Pelfrey等，Wewra/ogy，45(4):788-93(1995);IwatsuboT.，A^wraWo/.^g/"g，79:161-163(1998);Nitsch等，j朋.'J7(4):512-8(1995);vanGool等，脸腾/.,37(2):277-9(1995);Tamaoka等，/A^wra/.757(1-2):65-8(1996);禾卩Pirtilla等，^c/j.a^/ra/.，53(2):189-93(19%))。其它建议的标记，如对托品酰胺的瞳孔反应(Scinto等，266:1051-1054(1994);和Growdon等，y^c/.脸腳/.，54(7):841-4(1997))和血清因子如p-97(Kennard等，淑u，2(11):1230-5(1996》还未在重复的受控临床研究中得到验证。大多数建议的AD标记的主要缺点是，它们通常不是与AD病理学相关的脑特异性分子，且无法在外周液中对它们进行可靠的测量。神经丝状蛋白(NTP)是最近才鉴定的一个脑蛋白质家族。NTP是一种功能与神经出芽和细胞死亡有关的约41kD的膜相关磷蛋白(delaMonte等，/C7/"./"w"，100:3093-3104(1997);禾卩delaMonte等，Te;.，2:327-332(1999))。有令人信服的证据表明NTP与AD有关。NTPmRNA在AD患者大脑中相比对照被上调；AD患者的大脑和CSF中的NTP蛋白水平高于对照；且在老年斑、神经原纤维缠结(NFT)以及AD和唐氏综合征患者大脑中的退化神经元、神经纤维网丝和营养不良性神经炎性芽中清楚发现NTP免疫反应性(Ozturk等，A^/.^cad[/&4，86:419-423(1989);delaMonte等，JC/Z"./匿W.'86:1004-13(1990);delaMonte等，We膨/.S"'.，113:152-64(1992);delaMonte等，爿朋.A^wra/.'32:733-42(1992);delaMonte等，/Wewra/flAo/.五x;.^Vewra/.，55:1038-50(1996)，delaMonte等，Wewra/Sc/.,138:26-35(1996);delaMonte等，A^wra/.，135:118-25(1996);delaMonte等，J.C7/"./騰W.'100:3093-3104(1997);和delaMonte等，造.~.，2:327-332(1999))。AD神经退行性病变早期(形成NFT之前)发生NTP在神经元中累积。在唐氏综合征患者脑组织中也鉴定出NTP(Wands等，国际专利申请WO卯/06993;delaMonte等，J/z.W印.，2:327-332(1999))。大多数唐氏综合征患者在中年后显示出与AD患者类似的神经病理学，且在生命晚期出现许多与AD类似的认知缺陷。NTP的过表达造成由凋亡和受损的线粒体功能介导的神经细胞死亡，并在AD患者的大脑中观察到促凋亡途径的激活(delaMonte等，/A^wrapaA五x/7Vewra/60:195-207(2001);delaMonte等，Ce〃Mo/,h/eSd.58:844-9(2001);delaMonte等，J爿Me/me"6:231-42(2004》。AD患者和对照脑脊液(CSF)中的NTP水平显示，其在AD患者中总是升高的(Chong等，JC7/".Ia6/4wa/.，6(6):379-83(1992);delaMonte等，A^wra/.,32:133-142(1992);delaMonte等，/C//".Z"veW.,100:3093-3104(1997);Ghanbari等，《/C//".爿wa/.，12(4):223隱6(1998);Ghanbari等，JCowfemp.A^wra/.，1998:2-8(1998);Kahle等，7V謂/ogy，54(7):1498-504(2000))。相比非AD的神经疾病对照，在AD中显示出NTP升高的特异性，且NTP的升高与痴呆程度正相关(delaMonte等，C7z,"./"ve"，100:3093-3104(1997);禾卩delaMonte等，j/z.W印.，2:327-332(1999);禾PKahle等，7Vem/ogy，54:1498-504(2000))。在一个主要的研究中，89%的早期AD患者CSF中NTP的水平超过2ng/mL，而89%的非AD对照CSF中的NTP水平低于2ng/mL(delaMonte等，C//"./"wW.，100:3093-3104(1997))。随后通过高效液相色谱、毛细管电泳和ELISA在尿中鉴定了NTP蛋白(Ghanbari等，J.C//".ZW.，12(4):285-288(1998);和delaMonte等，i~.，2:327-332(1999))。发现尿NTP水平与AD患者和对照的CSF水平相关，且相比非AD患者在AD患者中显著升高(Ghanbari等，C"".M加/.，12:285-288(1998)，delaMonte等，Jowma/q^4/z/zez'mer&Z^mse3:345-353(2001))。为尿样建立了在液相中采用结合有单克隆抗NTP的金颗粒检测试验，并证明该试验对于AD是灵敏且特异的(Fitzpatrick等，爿/z/^'me^i印oW，3:155-159(2000))。还为尿样建立了ELISA形式的检测试验，并发现该试验对于AD是高度灵敏且特异的(delaMonte等，Fra",说oyc/7:d989-96(2002);Munzar等，j/z/^'mer'sWeporfe5:1-6(2002);Munzar等，iVewro/C7/"A^wrap/z^.o/2002(1):2-7(2002);Munzar等，Jfe/ze/meAi印orfe4:61-65(2001))。已经鉴定并描述了NTP(AD7c-NTP)的cDNA序列和预测的蛋白质序列(delaMonte等，C//"./m^s"100:3093-3104(1997))。神经丝状蛋白还描述于美国专利5,948,634;5,948,888和5,830,670并被要求权利，这些专利的题目都是"神经丝状蛋白基因表达和阿耳茨海默病的检测"(NeuralThreadProteinGeneExpressionandDetectionofAlzheimer'sDisease)。其它种类的神经丝状蛋白(约26kD、约21kD、约17kD和约15kD)也已鉴定并与神经外胚层瘤、星形细胞瘤和成胶质细胞瘤以及缺氧、缺血或脑梗死引起的损伤相关联(delaMonte等，《/A^wrapa决o/.五印.7Vewra/.'55:1038-50(1996)，delaMonte等，We腳/L，138:26-35(1996);delaMonte等，We腳/L，135:118-25(1996);delaMonte等，JC7/"./騰",100:3093-3104(1997);和delaMonte等，i，2:327-332(1999》。发明概述虽然取得了这些进步，需要开发改进的检测试验以及用于该试验的蛋白质或肽组分。还需要改进针对AD和其它神经退行性疾病的已有检测试验和生物标记。诸如以经济的方法从尿中常规纯化天然肽标记物的方法等技术进步也会改进任何此类试验。本领域还需要用于治疗和诊断与AD和唐氏综合征相关的改进的组合物，以及用于治疗和诊断神经外胚层瘤、星形细胞瘤、成胶质细胞瘤和其它神经退行性疾病及由于缺氧、缺血和脑梗死造成的损伤的组合物。本发明的一个实施方式提供了一种具有氨基酸序列SEQIDNO:14的肽。本发明进一步的实施方式提供了由核酸序列SEQIDNO:15或由在严格条件下与核酸序列SEQIDNO:15杂交的序列编码的肽。本发明再进一步的实施方式提供了一种含有具有氨基酸序列SEQIDNO:14的肽的组合物。本发明再进一步的实施方式提供了具有核酸序列SEQIDNO:15的多核苷酸。本发明的另一个实施方式提供了编码氨基酸序列SEQIDNO:14的多核苷酸。本发明的另一个实施方式提供了一种除AD7c-NTP外含有氨基酸序列SEQIDNO:14的蛋白质。进一步的实施方式包括由至少含有核酸序列SEQIDNO:15的DNA或由与至少含有核酸序列SEQIDNO:15的DNA杂交的序列编码的蛋白质。本发明的再另一个实施方式提供了一种检测生物样品中具有氨基酸序列SEQIDNO:14的肽的方法，以及鉴定除AD7c-NTP外含有氨基酸序列SEQIDNO:14的蛋白质的方法，所述方法包括(1)使生物样品接触一种或多种肽或抗体，所述肽或抗体结合于具有氨基酸序列SEQIDNO:14的肽和/或除AD7c-NTP外含有氨基酸序列SEQIDNO:14的蛋白质，从而形成含有各自结合实体(entity)的肽或抗体偶联物；(2)分离所得肽或抗体；和(3)将具有氨基酸序列SEQIDNO:14的肽和/或除AD7c-NTP外含有氨基酸序列SEQIDNO:14的蛋白质与所述肽和/或抗体偶联物分离以获得纯化的具有氨基酸序列SEQIDNO:14的肽或纯化的除AD7c-NTP外含有氨基酸序列SEQIDNO:14的蛋白质。本发明进一步的实施方式提供了一种特异性识别以下肽的抗体(a)具有氨基酸序列SEQIDNO:14的肽；(b)由核酸序列SEQIDNO:15编码的肽；或(c)由在严格条件下与核酸序列SEQIDNO:15杂交的核酸序列编码的肽。另一个实施方式提供了一种特异性识别以下蛋白质的抗体(a)除AD7c-NTP外含有氨基酸序列SEQIDNO:14的蛋白质；(b)除AD7c-NTP外由含有核酸序列SEQIDNO:15的DNA编码的蛋白质；或(c)除AD7c-NTP外由含有在严格条件下与核酸序列SEQIDNO:15杂交的核酸序列的DNA编码的蛋白质。再进一步的实施方式提供了一种检测或纯化生物样品中具有氨基酸序列SEQIDNO:14的肽和/或除AD7c-NTP外含有氨基酸序列SEQIDNO:14的蛋白质的方法，该方法包括-(1)使生物样品接触一种或多种具有选自下组的氨基酸序列的偶联肽(conjugatingpeptide):(a)HHARL(SEQIDNO:1);(b)HARL(SEQIDNO:2);(c)HARLI(SEQIDNO:3);(d)HARLIL(SEQIDNO:12);(e)HHARLCL(SEQIDNO:13);Cf)ARLIL(SEQIDNO:16);(g)HHARLIF(SEQIDNO:17);(h)THARLIL(SEQIDNO:18);(i)ARLI(SEQIDNO:19);(j)ARL(SEQIDNO:20);(k)HARLCL(SEQIDNO:21);(l)ARLCL(SEQIDNO:22);(m)ARCL(SEQIDNO:23);(n)MFARLIL(SEQIDNO:24);(o)FARLIL(SEQIDNO:25);(p)FARLI(SEQIDNO:26);(q)FARL(SEQIDNO:27);(r)HARLIF(SEQIDNO:28);(s)ARLIF(SEQIDNO:29);以及这种氨基酸序列的同源物，以形成至少(A)和(B)的偶联物其中(A)为所述一种或多种偶联肽，(B)为具有氨基酸序列SEQIDNO:14的肽和/或除AD7c-NTP外含有氨基酸序列SEQIDNO:14的蛋白质；(2)分离所得偶联物；和(3)将具有氨基酸序列SEQIDNO:14的肽和/或除AD7c-NTP外含有氨基酸序列SEQIDNO:14的蛋白质与所述偶联物分离以获得纯化的具有氨基酸序列SEQIDNO:14的肽禾口/或除AD7c-NTP外含有氨基酸序列SEQIDNO:14的蛋白质。本发明再进一步的实施方式提供了一种检测或纯化生物样品中的具有氨基酸序列SEQIDNO:14的肽和/或除AD7c-NTP外含有氨基酸序列SEQIDNO:14的蛋白质的方法，该方法包括(1)使生物样品接触一种或多种具有选自下组的氨基酸序列的偶联肽(a)LHARLCLANFCGRNRV(SEQIDNO:4);(b)LARLCLANFCGNNNV(SEQIDNO:5);(c)CARYRTGHHARLM(SEQIDNO:6);(d)HHARLPLANFCG(SEQIDNO:7);(e)RTGHHARLC*LANFC(SEQIDNO:8);(f)CESARYRTGHHARLC*(SEQIDNO:9);(g)DNTHHARLIL(SEQIDNO:10);(h)SHHARLIL(SEQIDNO:11);以及它的同源物，从而形成含有至少(A)所述一种或多种偶联肽，和(B)具有氨基酸序列SEQIDNO:14的肽和/或除AD7c-NTP外含有氨基酸序列SEQIDNO:14的蛋白质的偶联物；(2)分离所得偶联物；和(3)将具有氨基酸序列SEQIDNO:14的肽和/或除AD7c-NTP外含有氨基酸序列SEQIDNO:14的蛋白质与所述偶联物分离以获得纯化的具有氨基酸序列SEQIDNO:14的肽和/或除AD7c-NTP外含有氨基酸序列SEQIDNO:14的蛋白质。另一个实施方式提供了一种检测或纯化生物样品中的具有氨基酸序列SEQIDNO:14的肽和/或除AD7c-NTP外含有氨基酸序列SEQIDNO:14的蛋白质的方法，该方法包括(a)使生物样品接触一种或多种具有选自下组的氨基酸序列的偶联肽①ARLI(SEQIDNO:19);(ii)HARL(SEQIDNO:2);(iii)FARL(SEQIDNO:27);(iv)ARL(SEQIDNO:20);禾口(v)ARLC(SEQIDNO:30);其中所述肽在肽的3'或5'末端侧接包含至少1个到25个额外的氨基酸，从而形成含有至少(A)—种或多种偶联肽，和(B)具有氨基酸序列SEQIDNO:14的肽和/或除AD7c-NTP外含有氨基酸序列SEQIDNO:14的蛋白质的偶联物；(b)分离所得偶联物；和(c)将具有氨基酸序列SEQIDNO:14的肽和/或除AD7c-NTP外含有氨基酸序列SEQIDNO:14的蛋白质与所述偶联物分离以获得纯化的具有氨基酸序列SEQIDNO:14的肽禾P/或除AD7c-NTP外含有氨基酸序列SEQIDNO:14的蛋白质。其它实施方式提供了一种确定存在阿耳茨海默病或其它神经退行性疾病的诊断试验，所述试验包括确定生物样品中存在的具有氨基酸序列SEQIDNO:14的肽和/或除AD7c-NTP外含有氨基酸序列SEQIDNO:14的蛋白质的量，然后确定该样品中存在的肽和/或蛋白质的量是否超过表明存在阿耳茨海默病或其它神经退行性疾病的阀值量。另一个实施方式提供了一种确定存在阿耳茨海默病或其它神经退行性疾病的诊断试验，所述试验包括任何上述检测或纯化生物样品中的具有氨基酸序列SEQIDNO:14的肽和/或除AD7c-NTP外含有氨基酸序列SEQIDNO:14的蛋白质的方法。该方法还包括确定样品中存在的具有氨基酸序列SEQIDNO:14的肽和/或除AD7c-NTP外含有氨基酸序列SEQIDNO:14的蛋白质的量，然后确定该样品中存在的肽和/或蛋白质的量是否超过表明存在阿耳茨海默病或其它神经退行性疾病的阀值上面的概述和下面的详细描述都是示例性和说明性的，且都是为了进一步解释如权利要求所述的本发明。通过下面对优选实施方式的详细描述，其它特征和优点对于精通本领域的技术人员而言将是显而易见的。此外，本文对已知系统、组合物和方法的任何缺点或有害特性的描述不是要将本文所述实施方式的范围限于其之外。实际上，本发明的各种实施方式可包括一种或多种已知系统、组合物或方法而不会受到其缺点或有害特性的影响。优选实施方式的详细描述本发明的实施方式涉及与阿耳茨海默病(AD)和相关神经退行性疾病有关的新的肽。意外发现所述肽可作为准确和早期诊断AD的可靠生物标记。所述新的肽可用于AD的测定和诊断试验，并可用于治疗AD和其它症状。按照一种实施方案的一种实施，所述肽可用以下氨基酸序列(SEQIDNO:14)表示并可由所述核酸序列(SEQIDNO:15)编码。核酸序列(SEQIDNO:15)和氨基酸序列(SEQIDNO:14)MCTCTCCTTOTGMCTOCCTGCCTCGGCCTCGCA^AGTGCTG&SACTG③GTG脇C;CMCMGCCCMCITTTTAATTOT0TOTCTAWC3CIUVTOTC&C虽然不希望局限于任何操作理论，发明人认为用氨基酸序列SEQIDNO:14表示的肽出人意料地改进了与本文所述偶联肽的结合亲和力。因此，当采用得自相同或类似的具有氨基酸序列SEQIDNO:14的肽或多肽的标准曲线将该肽用于检测试验时，所述肽可用来表征尿样和区分患有阿耳茨海默病的个体和对照对象。实施方式还包括由在严格条件下与核酸序列SEQIDNO:15杂交的核酸序列编码的肽。根据本发明的实施，所述严格条件为严格性强的southern杂交条件。除了所述实施方式的肽和多核苷酸，该实施方式还包括所述肽和蛋白质的抗体，所述肽和/或多核苷酸和/或除AD7c-NTP外含有该肽的蛋白质的抑制剂，含有该肽、多核苷酸、抗体和抑制剂的组合物，以及采用上述任何一种来诊断和/或治疗患者的症状(如诊断AD)的方法。术i吾"AD7c-NTP"是指delaMonte等，/C"".100:3093-104(1997)，美国专利号5,948,634;5,948,888和5,830,670中序列120和121以及GenBank存AF010144中描述的约41kD的蛋白质以及编码它的cDNA和核酸序列。因此，术语"除AD7c-NTP之外的蛋白质"指不具有上述公开中所报道的相同氨基酸序列的蛋白质。术语"肽"在文中包括特定肽的氨基酸序列，以及这些特别列出的肽的同源物、衍生物、变体、片段、融合蛋白和肽模拟物和它们相应的核酸序列。术语"片段"是指由蛋白质或肽的氨基酸序列的连续亚序列构成的蛋白质或多肽，包括天然产生的片段，如剪接变体和在体内由蛋白酶活性天然产生的片段。这种片段可在氨基末端、羧基末端和/或中间(如自然剪接)截短。这种片段可以通过或不通过氨基末端甲硫氨酸制备。术语"片段"包括来自相同蛋白质或肽的片段，可以相同或不同，共有或没有毗连的氨基酸序列，直接或通过接头连在一起。术语"变体"指一种蛋白质或多肽，其中与文中所述蛋白质或肽的氨基酸序列相比存在一个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入，包括天然产生的所述蛋白质或肽的等位基因变体或者不同剪接变体。术语"变体"包括在肽序列中的一个或多个氨基酸用类似或同源氨基酸或不相似氨基酸的置换。氨基酸可在许多等级上分为类似或同源氨基酸(GunnarvonHeijne，(fi^f全激,^^^^/力、桥》(Se^i^"ceJ"fl/"^/"jWb/ecw/w历o/ogy」，第123-39页，AcademicPress，纽约，NY1987。)优选的变体包括一个或多个氨基酸位置的丙氨酸取代。其它优选的取代包括对蛋白质的整体净电荷、极性或疏水性影响小或没有影响的保守性取代。保守性取代列于下表2中。表2保守性氨基酸取代碱性精酸性.-无电荷极性:赖组谷天谷天苏非极性:苯色半甘丙缬脯甲酸安胺酸酸酸酸酸酸酸酸氨g酰酸酸酸氨酸氨酸酸酸酸氨酸氨氨氨氨氨冬氨冬氨氨氨丙氨胱氨氨氨氨硫氨亮表3列出氨基酸取代的另--种方案<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>其它变体可由保守性较小的氨基酸取代组成，如选择对其维持(a)取代区域中多肽主链的结构的作用，例如片层或螺旋构型，(b)靶位点分子的电荷或疏水性，(c)侧链大小(bulk)的作用具有更显著差异的残基。通常预计对功能有更显著作用的取代是(a)甘氨酸和/或脯氨酸被另一种氨基酸取代或缺失或插入；(b)亲水性残基如丝氨酰或苏氨酰取代疏水性残基(如亮氨酰、异亮氨酰、苯丙氨酰、缬氨酰或丙氨酰)或被后者取代；(c)半胱氨酸残基取代任何其它残基或被后者取代；(d)具有正电性侧链的残基如赖氨酰、精氨酰或组氨酰取代具有负电荷的残基如谷氨酰或天冬氨酰或被后者取代；或(e)具有大侧链的残基如苯丙氨酸取代没有这种侧链的残基如甘氨酸或被后者取代。其它变体包括设计为产生新的糖基化和/或磷酸化位点的，或设计为缺失现有糖基化和/或磷酸化位点的残基。变体包括糖基化位点、蛋白酶裂解位点和/或半胱氨酸残基上的至少一个氨基酸取代。变体还包括在蛋白质或肽氨基酸序列之前或之后的接头肽上具有其它氨基酸残基的蛋白质或肽。例如，可将半胱氨酸残基加在氨基和羧基末端以通过形成二硫键而环化。术语"变体"还包括具有肽的所述氨基酸序列的多肽，它在肽的3'或5'末端侧接有至少1个和多达25个或更多额外的氨基酸。术语"衍生物"指化学修饰的蛋白质或多肽，它们通过天然过程如加工和其它翻译后修饰而被化学修饰，也可通过化学修饰技术如加入一个或多个聚乙二醇分子、糖、磷酸盐和/或其它这种分子被化学修饰，其中这类分子不是天然结合于野生型蛋白质或肽的分子。衍生物包括盐。这种化学修饰在基础教材和更详细的专论以及大量研究文献中进行了详细描述，它们是本领域技术人员所熟知的。应当理解的是，相同类型的修饰可能以相同或不同程度存在于给定蛋白质或多肽的多个位点上。同样，给定蛋白质或多肽可包含许多种类的修饰。修饰可发生在蛋白质或多肽的任何地方，包括肽主链、氨基酸侧链和氨基或羧基末端。修饰包括例如乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素的共价结合、血红素部分的共价结合、核苷酸或核苷酸衍生物的共价结合、脂质或脂质衍生物的共价结合、磷脂酰肌醇的共价结合、交联、环化、二硫键形成、脱甲基化、形成共价交联、形成半胱氨酸、形成焦谷氨酸、甲酰化、，羧基化、糖基化、GPI锚形成、羟基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、蛋白酶解加工、磷酸化、异戊二烯化、外消旋化、糖基化、脂质结合、硫酸化、谷氨酸残基的，羧基化、羟基化和ADP-核糖基化、硒基化(selenoylation)、转运RNA介导的蛋白质的氨基酸加成，如精氨酰化和泛素化。参见例如(f蚤7^^-^V^f〃分7丝廣》(Prate/ra-SfrMC,騰Jm/她/ecw/ar尸ra/er"es」，第二版，T.E.Creighton，W.H.FreemanandCompany,纽约(1993)和Wold，F.，《翻译后蛋白质修饰观点和前景》(PosttranslationalProteinModifcation:PerspectiveandProspects),选自B.C.Johnson编的(f歪/^^^^》译y^关份參f资》fP(w"rara/a"o"a/Co"va/e"/A/ot/折ca"o"。/7Vote/m1」第1-12页，AcademicPress,纽约(1983);Seifter等，7kfeA.五"zywo/.182:626-646(1990)和Rattan等，(f蛋力處^^:',》译y^參^^〃:g^^^Sy"Aewi.Po"ra似/a"o"a/MoA/c加'o"fl^/Jg/"g)，Ann.N.Y.Acad.Sci.663:48-62(1992)。术语"衍生物"包括化学修饰导致蛋白质或多肽变成分支状或者有或没有分支的环状。环状、分支状和分支环状蛋白质或多肽可能由翻译后的天然加工产生并也可完全由合成方法产生。术语"同源物"指其氨基酸序列与本文所述蛋白质或肽的氨基酸序列至少有60%相同的蛋白质，根据常用于比较两种多肽的氨基酸位置相似性的标准方法测定。两种蛋白质之间的相似性或同一性程度可用已知方法计算，包括但不限于以下所描述的那些方法《##"i^ff激」卩Com/^to"o"fl/Afo/ecM/w5〖o/ogy」，Lesk，A.M.编，牛津大学出版社，纽约，1988;(ff激^,:,.唐学浙基^资^;^》(B/ocom/w""gv/^/brma"c51GewomeiVq/7ecto」，Smith,D.W.编，AcademicPress，纽约，1993;(f^^^J^^游^:^教分^^(Tom;MferJ""/""Z)Wa」，第I部分，Griffin,A.M.和Griffin，H.G.编，HumanaPress,新泽西州，1994);(f分ff激学妙浙》(5fegwe"cea"a/戸W"Mo/ecw/ar5/o/og>^，vonHeinje，G.，AcademicPress,纽约，1987);(f^^^/i^界歹/^^(Se《we"ce尸Wme^)，Gribskov，M.禾口Devereux，J.编，MStocktonPress,纽约，1991;CarilloH.和Lipman，D.，SIAM，似a仇，48:1073(1988)。确定同一性的优选方法设计为在测试序列之间产生最大匹配。确定同一性和相似性的方法编纂成公众可得到的计算机程序。用于确定两种序列之间同一性和相似性的优选计算机程序方法，包括但不限于GCG程序包(Devereux，J.等，M/c/e/c^c/^7ewwc/z，12(1):387(1984))，BLASTP，BLASTN和FASTA，Atschul，S.F.等，Mo/ec.5/。/.，215:403-410(1990)。fi丄ASrX程序公众可从NCBI和其它来源获得CB丄ASr手册，Altschul，S.等，NCBINLMNIHBethesda，Md.20894;Altschul，S.等，JAfo/.所o/.，215:403-410(1990)。例如，采用计算机算法如GAP(GeneticComputerGroup,UniversityofWisconsin,Madison,Wis.)，将两种其序列同一性百分比待测定的蛋白质或多肽排列比对以实现其各自氨基酸的最优匹配(通过算法确定的"匹配度")。间隙开放罚分(gapopeningpenalty)(计算为3X(乘)平均对角线；"平均对角线"是所用比较矩阵的对角线平均值；"对角线"是通过具体比较矩阵赋予各优选氨基酸的评分或数值)和间隙延伸罚分(gapextensionpenalty)(通常是间隙开放罚分的1/10倍)以及比较矩阵例如PAM250或BLOSUM62可与此算法结合使用。所述算法也可使用标准的比较矩阵(PAM250比较矩阵参见Dayhoff等，f歪/^處,/^/7錄裕房谱桌Jf^/w。/尸rafe/"Se《Me"ceSfrw""r^，第5巻，增补本3[1978];BLOSUM62比较矩阵参见Henikoff等，尸亂淑/Jca"c/.园，89:10915-10919[1992])。然后用该算法计算同一性百分比。同源物与相应的蛋白质或肽相比，通常具有一个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入。术语"肽模拟物"或"模拟物"指模拟肽或蛋白质的生物活性但在化学性质上不再是肽的生物活性化合物，即它们不再含任何肽键(即氨基酸间的酰胺键)。这里术语肽模拟物用于更广泛含义，包括性质上不再完全是肽的分子如假肽、半肽和拟肽(peptoid)。此广泛含义上的肽模拟物的例子(其中肽的一部分被缺乏肽键的结构取代)在下面描述。无论完全是或部分是非肽，本发明的肽模拟物提供了反应性化学部分的空间排列，这种空间排列非常类似于肽模拟物所依据的肽中活性基团的三维排列。由于这种相似的活性位点的几何结构，肽模拟物对生物系统的作用类似于肽的生物活性。本发明的肽模拟物优选在三维形状和生物活性上基本上类似于本文所述的肽。本领域己知的对肽进行结构修饰以产生肽模拟物的方法的例子包括倒置主链手性中心产生D-氨基酸残基结构，这可能(尤其是在N-末端)导致对蛋白酶降解的稳定性提高而不对活性产生不利影响。在论文"含氚D-丙氨酸、肽T结合"(TritriatedD-ala!-PeptideTBinding),SmithC.S.等，Drag/^ve/opmWi"，15，371-379页(1988)中描述了一个例子。第二种方法是改变稳定性所需的环状结构，如N到C链间的二酰亚胺和内酰胺(Ede等，Smith和Rivier编，(C#^^#//7f激学iY尸w"a^:C/zem/W7am/5/o/ogy)，Escom，Leiden(1991)，268-270页)。例子见构型限制的胸腺五肽样化合物，如美国专利号4,457,489(1985)，Goldstein,G.等所公开的那样，其内容完整纳入本文供参考。第三种方法是用对蛋白水解有抗性的假肽键替换肽中的肽键。所述的一些假肽键一般不影响肽的结构和生物活性。此方法的一个例子是取代逆转化假肽键("胸腺五肽的生物活性逆转化同源物"(Biologicallyactiveretroinversoanalogueofthymopentin)，SistoA等，选自Rivier，J.E.和Marshall,G.R.编的《肽、1"七学、结构禾卩生斗勿学》(Peptides,Chemistry,StructureandBiology),J^scow'丄e/tfe"，1990，722-773页)和Dalpozzo等(1993)，/W.P印"V/e，41:561-566，纟内入本文供参考)。根据此修饰，肽的氨基酸序列可以与上述肽的序列相同，除了一个或多个肽键被逆转化假肽键所取代。优选大部分N-末端肽键被取代，因为这种取代赋予对作用于N-末端的外肽酶的蛋白水解的抗性。也可用其它类似结构的化学基团替代氨基酸的化学基团进行修饰。另一种已知可提高对酶裂解的稳定性而生物活性没有或很少损失的合适假肽键是还原型电子等排物(isostere)假肽键(Couder等(1993)，/^J尸印"(iePratoVjies.，41:181-184，全部纳入本文供参考)。因此，这些肽的氨基酸序列可能与肽的序列相同，除了一个或多个肽键被电子等排物假肽键替代外。本文所用术语"氨基酸序列"优选指至少2个，优选至少4个，更优选至少5个氨基酸的序列。优选大部分N-末端肽键被取代，因为这种取代赋予对作用于N-末端的外肽酶的蛋白水解的抗性。合成具有一个或多个还原型电子等排的假肽键的肽是本领域已知的(Couder等(1993)，上面所引用)。其他例子包括导入酮亚甲基键或甲硫化物键来替代肽键。本文所述肽的拟肽衍生物代表了另一类肽模拟物，拟肽保留了生物活性的重要结构决定簇，但去除肽键，从而赋予对蛋白水解的抗性(Simon等，1992，尸rac.化"Aac/.5W.W"，89:9367-9371，全部纳入本文供参考)。拟肽是N-取代的甘氨酸的寡聚物。已报道了一些N-烷基基团，它们各自对应于天然氨基酸的侧链(Simon等，1992，上面所引用)。所述肽的一些或所有氨基酸可以用对应于所述替代氨基酸的N-取代甘氨酸所替代。术语"肽模拟物"或"模拟物"还包括反-D肽和下面定义的对映异构体。术语"反-D肽"指与NTP肽的L-氨基酸序列相比，由反向顺序排列的D-氨基酸组成的生物活性蛋白质或肽。因此，L-氨基酸NTP肽的羧基末端残基成为D-氨基酸肽的氨基末端并以此类推。例如，NTP肽、SSWDY((SEQIDNO:31))变成TdDdWdSdSd，其中Dd、Sd、Wd和Yd是分别对应于L-氨基酸D、S、W和Y的D-氨基酸。一个实施方式提供了用以下氨基酸序列(SEQIDNO:14)表示的肽，其由所述核酸序列(SEQIDNO:15)编码。核酸序列(SEQIONO:15)和氨基酸序列(SEQIDNO:14)冗TGGAGCTTGTGATCTOCC，CK1CTCGGGCTOTCMACTGCTGGGIVXTACftGTOCMCMGCCCG〇CTTIOTTFTAMCTTTOTTTO，TGAAATOTCTG&C除了所述实施方式的肽和多核苷酸，所述实施方式还包括所述肽和蛋白质的抗体，所述肽禾口/或多核苷酸禾口/或除AD7c-NTP外含有该肽的蛋白质的抑制剂，含有该肽、多核苷酸、抗体和抑制剂的组合物，以及采用上述任何一种来诊断和/或治疗患者的症状(如诊断AD)的方法。实施方式包括重组的肽和蛋白质(以及编码该肽和蛋白质的核酸序列)，分离自其天然来源的肽和蛋白质，以及用合成方法制造的肽和蛋白质。制备重组的肽和蛋白质的方法是本领域熟知的。所述重组的肽和蛋白质可用精通本领域的技术人员已知的任何合适方法制备。所述肽的纯度可在不纯和纯之间变化。优选地，所述肽是基本纯的。纯化肽的方法是本领域熟知的。所述肽可用精通本领域的技术人员已知的任何合适方法纯化。还包括分离自其它氨基酸和化合物的肽，以及一侧或两侧有额外的氨基酸和/或偶联于其它化合物(包括额外的肽)的肽。另一个实施方式提供了除AD7c-NTP外含有氨基酸序列SEQIDNO:14的蛋白质。进一步的实施方式包括由至少含有核酸序列SEQIDNO:15的DNA或由与至少含有核酸序列SEQIDNO:15的DNA杂交的序列编码的蛋白质。根据本发明的实施，所述肽或蛋白质可偶联到选自下组的其它肽("偶联肽")(a)HHARL(SEQIDNO:1);(b)HARL(SEQIDNO:2);(c)HARLI(SEQIDNO:3);(d)HARLIL(SEQIDNO:12);(e)HHARLCL(SEQIDNO:13);(f)ARLIL(SEQIDNO:16);(g)HHARLIF(SEQIDNO:17);(h)THARLIL(SEQIDNO:18);(i)ARLI(SEQIDNO:19);(j)ARL(SEQIDNO:20);(k)HARLCL(SEQIDNO:21);(l)ARLCL(SEQIDNO:22);(m)ARCL(SEQIDNO:23);(n)MFARLIL(SEQIDNO:24);(o)FARLIL(SEQIDNO:25);Cp)FARLI(SEQIDNO:26);(q)FARL(SEQIDNO:27);(r)HARLIF(SEQIDNO:28);(s)ARLIF(SEQIDNO:29);及其同源物、衍生物和变体。某些实施方式包括如下所述的被称为"Harlil序列"的序列或称为"Harlil肽"的肽在检测生物样品中存在SEQIDNO:14的肽或除AD7c-NTP外含有SEQIDNO:14的肽的蛋白质中的应用(a)THARLIL(SEQIDNO:18)(b)HHARLCL(SEQIDNO:13)(c)MFARLIL(SEQIDNO:24)(d)HHARLIF(SEQIDNO:17)实施方式包括具有区域(a)、(b)、(c)、(d)或这些区域的同源物、衍生物或变体(包括但不限于"HARLML"SEQIDNO:32)中任何一个的序列的肽的应用。所述Harlil肽还可在Harlil序列之前或之后在接头肽上含有额外的氨基酸残基。因此，用所述肽可含有侧翼序列。优选地，含有额外的氨基酸残基的Harlil肽的总长度不超过25个氨基酸残基。Harlil肽的同源物、衍生物和变体也可用于本发明的实施方式。根据另一种实施，所述肽偶联于选自下组的额外的肽("偶联肽")(a)LHARLCLANFCGRNRV(SEQIDNO:4);(b)LARLCLANFCGNNNV(SEQIDNO:5);(c)CARYRTGHHARLM(SEQIDNO:6);(d)HHARLPLANFCG(SEQIDNO:7);(e)RTGHHARLC*LANFC(SEQIDNO:8);(f)CESARYRTGHHARLC*(SEQIDNO:9);(g)DNTHHARLIL(SEQIDNO:10);(h)SHHARLIL(SEQIDNO:11);及其同源物、衍生物和变体。根据另一个实施方式，所述肽偶联于非肽类化合物。SEQIDNO:14的肽或除AD7c-NTP外含有SEQIDNO:14的肽的蛋白质可偶联的所有这些肽在文中被称为"偶联肽"。因此，本文所述的实施方式包括采用上述能够偶联于SEQIDNO:14的肽的偶联肽的测定方法，以检测所述肽，检测除AD7c-NTP外含有该肽的蛋白质，检测所述肽的片段和变体，以及诊断阿耳茨海默病。本文所述的其它实施方式包括采用能够偶联于SEQIDNO:14的肽或除AD7c-NTP外含有SEQIDNO:14的肽的蛋白质的抗体的测定方法，以检测所述肽，检测除AD7c-NTP外含有该肽的蛋白质，检测所述肽的片段和变体，以及诊断阿耳茨海默病。本发明还提供了作为偶联物的同源物、变体和/或衍生物的蛋白质、肽和其它化合物。实施方式包括含有实施方式中所述的肽或蛋白质(总的来说有，具有氨基酸序列SEQIDNO:14的肽，除AD7c-NTP外含有具有氨基酸序列SEQIDNO:14的肽的蛋白质，由核酸序列SEQIDNO:15编码的氨基酸序列，由至少含有核酸序列SEQIDNO:15的DNA编码的蛋白质，由在严格条件下与核酸序列SEQIDNO:15杂交的核酸序列编码的氨基酸序列，以及由至少含有在严格条件下与核酸序列SEQIDNO:15杂交的核酸序列的DNA编码的蛋白质)的组合物。还包括含有作为本发明的肽和蛋白质亲和结合伴侣的Harlil肽、肽模拟物、结合伴侣和/或同源物、衍生物或变体的组合物在测定或纯化肽或蛋白质生物标记中的应用，Harlil肽、肽模拟物及其同源物、衍生物或变体在封闭肽或蛋白质上的Harlil肽位点中的应用，或者通过Harlil序列与所述肽或蛋白质相互作用的物质的应用。还包括针对实施方式中所述肽或蛋白质、Harlil肽序列、以及与所述肽、Harlil肽及其同源物、衍生物或变体相对应的核酸的抗体。任何合适的载体、粘合剂、稀释剂等可用于本发明的组合物，这是精通本领域的技术人员已知的，但不限于此。Harlil序列显示出结合于实施方式所述的肽和蛋白质的特异性。当Harlil肽或其它"偶联肽"或其同源物、衍生物或变体被固定时可用来从溶液中纯化实施方式所述的肽或蛋白质。当它被作为亲和试验的一部分用来捕获实施方式所述的肽或蛋白质时，肽的结合是非常特异的且在pH3.5-8之间不受pH影响。这种亲和试验的灵敏度至少和免疫测定一样高。例如，将通过ELISA测定含有约0.5ng/mL肽或蛋白质的阳性尿样稀释约4倍通过这种亲和试验仍能与阴性样品区分。此外，采用更加灵敏的检测方法如采用荧光或化学发光底物或放射标记测定法可提高测定灵敏度。由于Harlil肽(或偶联肽)特异性结合于本文所述的肽或蛋白质，因此可将它们用于诊断测定以检测生物样品中所述肽或所述肽的抗体的存在。本发明的发明人显示，体液中的本文所述肽和/或蛋白质超过正常水平则表明存在AD、唐氏综合征、或其它脑退行性疾病。根据本发明的实施和实施方式，本发明所述肽的尿浓度至少约为22jag/ml则表明存在AD。由于Harlil肽独特的自结合(self-binding)特性，可将该肽作为本发明实施方式所述肽的类似物用于检测试验。在顺序试验或竞争性试验中，本文所述的肽会结合于Harlil肽偶联物固相，并在洗涤过程中保留在固相上阻断免疫球蛋白(如兔IgG)的结合。还可将Harlil肽作为捕获抗体替代物用于夹心试验。据信，实施方式所述的肽参与神经退行性级联。通过寻靶该肽能够中断或重定向这种级联从而提供治疗可能。例如，利用Harlil肽与所述肽相互作用从而封闭反应性位点的能力可能进行治疗干涉。或者，Harlil肽和模拟物可用于将药物靶向表达Harlil序列的细胞。可用于本文所述各种实施方式的抗体包括多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体和抗个体遗传型抗体。多克隆抗体是衍生自用抗原免疫的动物血清的抗体分子的异质群体。单克隆抗体是针对特定抗原的抗体的基本同质群体。单克隆抗体可用精通本领域的技术人员已知的方法获得，如Kohler和Milstein，1975，A^we256:495-497以及美国专利号4,376,110。这种抗体可以是包括IgG、IgM、IgE、IgA、GILD在内的任何免疫球蛋白类型及其任何亚类的抗体。嵌合抗体是其不同部分衍生自不同动物种类的分子，如具有衍生自小鼠的可变区和人免疫球蛋白的恒定区。嵌合抗体及其制造方法是本领域已知的(Cabilly等，1984，Prac.Ato/.81:3273-3277;Morrison等，1984，尸rac.A^/.」cat/.6^X481:6851-6855;Boulianne等，1984，淑,312:643-646;Cabilly等，欧洲专利申i青125023(1984年11月14日公开)；Taniguchi等，欧洲专利申i青171496(1985年2月19日公开)；Morrison等，欧洲专利申i青173494(1986年3月5日公开)；Neuberger等，PCT申请WO86/01533(1986年3月13日公开)；Kudo等，欧洲专利申请184187(1986年6月11日公开)；Morrison等，欧洲专利申请173494(1986年3月5日公开)；Sahagan等，1986，乂/m聽"。/.，137:1066-1074;Robinson等，PCT/US86/02269(1987年5月7日公开)；Liu等，1987，尸rac.Ato/.84:3439-3443;Sun等，1987，Proc.A^".Jcac/.S".84:214-218;Better等，1988，&/e"ce240:1041-1043)。这些参考资料全文纳入本文作为参考。抗个体遗传型(抗-Id)抗体是识别通常与抗体的抗原结合位点有关的独特决定子的抗体。可用需制备抗-W的单克隆抗体免疫与该单克隆抗体来源的种类和基因型相同的动物(例如小鼠品系)来制备抗-Id抗体。免疫的动物通过产生针对这些同种型决定子的抗体(抗-Id抗体)而识别并应答所述致免疫抗体的个体遗传型决定子。因此，所产生的针对实施方式所述肽、蛋白质或多肽的单克隆抗体可用于在合适的动物体内诱导抗-Id抗体。可用这种免疫小鼠的脾细胞来制造分泌抗-Id单克隆抗体的抗-Id杂交瘤。此外，抗-Id抗体可与载体如钥孔虫戚血蓝蛋白(KLH)偶联并用来免疫其它BALB/c小鼠。这些小鼠的血清将含有抗-抗Id抗体，该抗体具有特异于R-PTP酶表位的最终mAb结合特性。因此，抗-Id抗体具有其个体遗传型表位，或"独特位"，其在结构上类似于已评价的表位,如酿脓链球菌OS^叩tococc^/^ogwe)多肽。术语"抗体"还包括完整的分子以及能够结合抗原的片段，如Fab。Fab片段缺乏完整抗体的Fc片段，更快地从循环中清除，且相比完整抗体具有更少的非特异性组织结合(Wahl等，1983，JWwc/.MM24:316-325)。应理解，按照对于完整抗体分子的方法，可用于所述实施方式的抗体的Fab片段和其它片段可用于检测和量化脑膜炎奈瑟氏球菌(vV.wem'"g加^fo)多肽。所述抗体可用于各种方面，例如用来证实一种蛋白质的表达或用来证实蛋白质在何处表达。例如，标记的抗体(例如用荧光标记以进行FACS)可与完整的细菌一起培育，细菌表面存在标记则证实了所述蛋白质的位置。可采用常规方法将所述肽或蛋白质或带有表位的片段、类似物或细胞给予动物以获得抗本文所述肽或蛋白质的抗体。为制备单克隆抗体，采用能提供由连续细胞系培养物产生的抗体的任何技术。实施方式包括编码实施方式所述的肽和蛋白质的多核苷酸。优选地，所述多核苷酸具有核酸序列SEQIDNO:15，或包含核酸序列SEQIDNO:15的多核苷酸。本发明的实施方式还包括在降低严格性的条件下，更优选在严格条件下，最优选在高严格性的条件下能够与本文所述的多核苷酸杂交的多核苷酸。严格条件的例子示于下面的严格性条件表高严格性的条件是至少和例如条件A-F—样严格的条件；严格条件是至少和例如条件G-L—样严格的条件；降低严格性的条件是至少和例如条件M-R—样严格的条件。严格性条件-表I<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>bp1:杂合体长度是杂交的多核苷酸杂交区域的预计长度。当将多核苷酸与序列未知的靶多核苷酸杂交时，假定杂合体长度为杂交的多核苷酸的长度。当杂交已知序列的多核苷酸时，可将多核苷酸的序列进行比对并确定序列互补性最佳的一个或多个区域以确定杂合体长度。缓冲液可用SSPE(lxSSPE是0.15MNaCl，10mMNaH2PO4，和1.25mMEDTA，pH7.4)代替杂交和洗涤缓冲液中的SSC(lxSSC是0.15MNaCl和15mM柠檬酸钠)；杂交完成后进行15分钟洗涤。TB-TR:预计长度小于50个碱基对的杂合体的杂交温度应比该杂合体的解链温度(Tm)低5-10EC，其中的Tm根据以下方程确定。对于长度小于18个碱基对的杂合体，Tm(EC)=2(碱基A+T的个数)+4(碱基G+C的个数)。对于长度在18-49个碱基对之间的杂合体，Tm(EC)=81.5+16.6(logH)[Na+])+0.41(%G+C)-(600/N)，其中，N是杂合体中碱基的数目，[Na+]是杂交缓冲液中钠离子的浓度(对于lxSSC，[Na+]=0.165M)。多核苷酸杂交的严格性条件的其它例子提供于Sambrook，J.，E.F.Fritsch和T.Maniatis，1989，(f分T^虔实邀皇手，(7kfo/簡/wC/om."g,J丄a6固—她麵/」，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY，第9和11章，以及6齊编分^"激学实邀潜裔JYC匿Wtocofe/"編簡/w脂ogyj，1995，F.M.Ausubel等编，JohnWiley&Sons,Inc.,第2.10和6.3-6.4部分，纳入本文作为参考。本发明的实施方式还提供了与这些多核苷酸完全互补的多核苷酸，并还提供了反义序列。反义序列也称为反义寡核苷酸，包括内部产生的以及外部给予的阻断编码本发明多肽的多核苷酸表达的序列。本文所述实施方式的反义序列包括，例如，约15-20个碱基对。例如，可设计通过阻止启动子结合于上游非翻译序列或者通过防止核糖体结合而阻止编码本发明多肽的转录物翻译而抑制转录的反义序列。实施方式所述的多核苷酸可用多种方法制备(例如，通过化学合成、从DNA文库获得、从生物体本身获得)并可采取各种形式(例如，单链的、双链的、载体、探针、引物)。术语"多核苷酸"包括DNA和RNA，以及它们的类似物，如含有修饰的主链的那些。根据其它实施方式，所述多核苷酸包括DNA文库，如cDNA文库。本文所述各种实施方式的方法包括检测、鉴定和/或纯化本文所述肽和蛋白质的方法。本文包括任何合适的方法。根据一个实施方式，从生物样品中纯化肽或蛋白质的方法包括(1)使认为含有本文所述的肽或蛋白质的生物样品接触一种或多种偶联肽以形成偶联物；(2)分离所得偶联物；和(3)将本文所述的肽或蛋白质与一种或多种偶联物分离以获得纯化的肽。优选地，一种或多种偶联肽具有选自下组的氨基酸序列(i)ARLI(SEQIDNO:19);(ii)HARL(SEQIDNO:2);(iii)FARL(SEQIDNO:27);(iv)ARL(SEQIDNO:20);禾口(v)ARLC(SEQIDNO:30);更优选地，所述一种或多种偶联肽可包含上述(i)-(v)中的任何一个并在肽的3'或5，末端侧翼上有至少1个和多达25个或更多额外的氨基酸。再优选地，所述一种或多种偶联肽选自下组(a)LHARLCLANFCGRNRV(SEQIDNO:4);(b)LARLCLANFCGNNNV(SEQIDNO:5);(c)CARYRTGHHARLM(SEQIDNO:6);(d)HHARLPLANFCG(SEQIDNO:7);(e)RTGHHARLC承LANFC(SEQIDNO:8);(f)CESARYRTGHHARLC*(SEQIDNO:9);(g)DNTHHARLIL(SEQIDNO:10);(h)SHHARLIL(SEQIDNO:11);及其同源物。再优选地，所述一种或多种偶联肽具有选自下组的氨基酸序列Ca)HHARL(SEQIDNO:1);(b)HARL(SEQIDNO:2);(c)HARLI(SEQIDNO:3);(d)HARLIL(SEQIDNO:12);(e)HHARLCL(SEQIDNO:13);(f)ARLIL(SEQIDNO:16);(g)HHARLIF(SEQIDNO:17);(h)THARLIL(SEQIDNO:18);(i)ARLI(SEQIDNO:19);(j)ARL(SEQIDNO:20);(k)HARLCL(SEQIDNO:21);(l)ARLCL(SEQIDNO:22);(m)ARCL(SEQIDNO:23);(n)MFARLIL(SEQIDNO:24);(o)FARLIL(SEQIDNO:25);(p)FARLI(SEQIDNO:26);(q)FARL(SEQIDNO:27);(r)HARLIF(SEQIDNO:28);(s)ARLIF(SEQIDNO:29);和这种氨基酸序列的同源物、衍生物或变体。可用本领域熟知的技术和方法从生物样品分离偶联物。同样，可用精通本领域的技术人员已知的任何方法从偶联的肽分离本文所述的肽和蛋白质。所用肽或蛋白质的生物来源优选为被诊断患有AD的患者的尿。在将生物材料施加到柱材料之前，优选按照2000年10月27日提交的题为"优选的神经丝状蛋白片段及其使用方法"(PreferredSegmentsofNeuralThreadProteinandMethodsofUsingtheSame)的美国专利申请序列号No.09/697,590的说明对其进行处理，该申请的内容全文纳入本文作为参考。一旦按上述制备了样品，优选按照制造商的说明将样品偶联到溴化氰激活的琼脂糖(Sigma，St.Louis，MO)。制备好之后将柱材料储存于含0.01%叠氮化物的pH7的25mMTPIS缓冲盐水(TBS)。偶联之后优选如下进行层析。将11mL亲和柱材料和25mL0.025M甘氨酸缓冲液(pH3.5)与25mL尿样品一起培育1小时(如上所述进行处理以获得4倍浓縮的样品的TBS(pH7)溶液)。收集未吸附的材料(流出液)。然后用5倍体积的lxTBS(pH7)洗涤柱并用11mLO.lM甘氨酸(pH2)洗脱。洗脱后立即用NaOH将洗脱液调至pH7，然后用AmiconCentriconYM-10(Millipore，BeverlyMA)浓縮至1mL。优选地，随后分析亲和柱洗脱液中存在的肽活性。用试纸或检测尿中肽的检测试验("肽试验")测定亲和试验活性(参见如NymoxPharmaceuticalCorp.,MaywoodNJ。参见如Fitzpatrick等，造/ze/md鄉。他，3:155-159(2000);delaMonte等，F簡f所os".7:d989-96(2002);Munzar等，Xfe/^'me^5:1-6(2002);Munzar等，iVewra/C7/w7Vewo/A戸.0/2002(1》2-7(2002);Munzar等，j/z/^'merk7印orfe4:61-65(2001))。优选通过考马斯蓝染色(BioRad，Hercules，CA)确定洗脱液中的蛋白质浓度(初始蛋白质浓度可通过BicinchoninicAcid试剂盒(产品编号23223，BioRad)确定)。针对缓冲液在280nm的吸光度修正吸光度。优选采用如下凝胶电泳分析来自亲和柱洗脱液的肽。1叱洗脱液(约110-145ng)在12.5y。十二烷基磺酸钠(SDS)微型胶(AmershamPharmaciaBiotech,瑞典)上运行，用银染色并观察条带。将凝胶切成要观察的条带，置于100plTBS中，并用TBS透析过夜。然后用AmiconCentriconYM-10浓縮条带洗脱液，并用上述肽试验测定活性。观察反应性以确定是否存在所述肽。实施方式的方法还包括诊断试验，如确定存在AD或其它神经退行性病症的试验。根据一种实施，实施方式提供了一种确定存在阿耳茨海默病或其它神经退行性疾病的诊断试验，包括(1)确定生物样品中存在的具有氨基酸序列SEQIDNO:14的肽的量；和(3)确定该样品中存在的具有氨基酸序列SEQIDNO:14的肽的量是否超过表明存在阿耳茨海默病或其它神经退行性疾病的阀值量。优选的实施方式提供了一种确定存在阿耳茨海默病或其它神经退行性疾病的诊断试验，包括(1)使生物样品接触一种或多种偶联肽(2)确定样品中存在的具有氨基酸序列SEQIDNO:14的肽的量；和(3)确定该样品中存在的具有氨基酸序列SEQIDNO:14的肽的量是否超过表明存在阿耳茨海默病或其它神经退行性疾病的阀值量。优选地，所述偶联肽是上文纯化方法中所述的那些。表明存在阿耳茨海默病或其它神经退行性疾病的阀值量优选至少约22pg/ml。本发明的实施方式还涉及表明AD阶段的其它阔值。这些范围可由精通本领域的技术人员基于本文提供的指导方便地确定。优选地，本文所述优选实施方式中肽的存在是通过例如2000年10月27日提交的题为"优选的神经丝状蛋白片段及其使用方法"的美国专利申请序列号No.09/697,590中所述的方法用偶联肽检测和量化的。优选的，具有SEQIDNO:14所示氨基酸序列的肽和/或蛋白质在本文所述的检测AD或其它神经退行性疾病的试验中被用作标准品。发明人意外发现，本文所述的试验可有效检测尿样中存在的AD，其中该试验采用具有SEQIDNO:14所示氨基酸序列的肽作为标准品。实施例提供以下实施例以阐述本发明。然而应理解，本文所述的实施方式不限于这些实施例中所描述的特定条件或细节。在本说明书中，包括美国专利在内的公众可获得的任何和所有参考文献都逐一纳入本文作为参考。实施例l一鉴定通过检测试验检测的肽使用一种或多种本文所述Harlil肽和兔免疫球蛋白包被的微量滴定板。如下处理对象的尿样用无菌塑料容器收集早上第一次排出的尿样。在尿样中加入Stabilur片(GlobeScientific)。处理前将尿液立即在4。C冷冻最多24小时。样品在SorvalRC2-B离心机中以3000g离心15分钟以除去细胞碎片。然后用装有0.22pm醋酸纤维素(Millipore)滤器的Gelman针筒过滤尿液，在滤出的上清液中以1:10加入0.5%的叠氮化钠从而使滤液中叠氮化钠的浓度变为0.05%。然后将该溶液置于AmiconMicroconYM-10顶部并以5000rpm离心1小时，之后用TBS恢复原始体积。然后将AmiconYM-10离心和恢复步骤重复两次，每次离心30分钟。最终的渗余物用TBS恢复至0.5mL。然后将该溶液置于AmiconMicroconYM-100顶部并在FisherScientificMarathon13K/M离心机中以10000rpm离心5分钟。用TBS以1:14稀释Microcon内的体积。在尿样中加入下表所示的合成的多肽，其浓度范围为0.01-5.0mg/mL，然后如下处理表<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>用移液管在各孔中加入50样品和50与碱性磷酸酶偶联的兔抗小鼠抗体并室温孵育60分钟，用TBS/Tween20(0.05%)缓冲液洗涤3次；然后加入150(iLPNPP(对硝基磷酸苯酯(ParaNitroPhenylPhospate))(Moss，Pasadena,MD)并在BioRad550微板阅读器上在405nm处读取颜色反应读数(BioRad，Hercules,CA)。读数得自通过MicroplateManagerIII用含有重组AD7C-NTP的孔的数据建立的标准曲线。连续稀释编号为14的肽得到一致的线性吸光度读数。因此可以确定，上述方法能够确定样品中这种肽的含量或者含有这种肽或其片段的物质的含量。实施例2:采用与上文在实施例1中所述相同的方式，连续稀释14号样品以生成标准曲线，将人血清白蛋白、酸性-l-糖蛋白、人Y球蛋白样品(100pg/mL)以及醋氨酚、alpmz、cephalex、地尔硫卓、呋塞米、开博通、k-dur、福善美、地高辛、立普妥、洛赛克、法莫替丁、Vasotec、舍曲林、硝苯地平、阿替洛尔、格列本脲、氢氯噻嗪、美托洛尔、替马西泮、阿莫西林、氯羟安定、克拉霉素制剂、度冷丁、indur、活络喜、四环素、左甲状腺素钠、百忧解、氟西泮、布洛芬、香豆定、二甲双胍和磷酸可待因样品(25)ug/mL)与正常处理的尿样混合。如实施例1所述读取这些尿样的UV吸光度。与正常尿相比，上述物质对吸光度读数没有影响。实施例3:用与实施例1所述相同的方式检测20名正常个体的尿样，连续稀释14号样品以生成标准曲线。20名正常个体的吸光度读数始终在0.961-1.310的范围内。实施例4:按上文在实施例1中的描述，检测20例AD患者和20例非AD个体的尿样，连续稀释14号样品以生成标准曲线。20名正常个体的吸光度读数范围为0.961-1.310。AD个体的读数范围为0.169-0.754。上述实施例表明，AD个体的尿中含有一定数量的某些在正常对象中未发现的蛋白质。也已经确定这些蛋白质物质含有SEQIDNO:14所含氨基酸序列的一部分或全部。例如，尿中的蛋白质可含有该序列的一部分或全部。这种检测试验及相关方法具有诊断和治疗用途。还意外发现，具有氨基酸序列SEQIDNO:14的多肽可被连续稀释并用于评估所检测个体尿液中类似物质或相同物质的量。精通本领域的技术人员显而易见的是，可对本发明的方法和组合物做出各种修饰和改变而不背离本发明的精神和范围。因此，本发明包括本发明的修饰和改变，只要这些修饰和改变在附加的权利要求及其等价要求的范围之内。权利要求1.一种具有SEQIDNO14所示氨基酸序列的肽。2.如权利要求l所述的肽，其特征在于，所述肽是基本纯的。3.如权利要求1所述的肽，其特征在于，所述肽是重组的肽。4.如权利要求1所述的肽，其特征在于，所述氨基酸序列SEQIDNO:14的一侧或两侧是一个或多个额外的氨基酸。5.如权利要求1所述的肽，其特征在于，所述肽偶联于偶联肽。6.如权利要求l所述的肽，其特征在于，所述肽偶联于选自下组的偶联肽O)HHARL(SEQIDNO:1);(b)HARL(SEQIDNO:2);(c)HARLI(SEQIDNO:3);(d)HARLIL(SEQIDNO:12);O)HHARLCL(SEQIDNO:13);(f)ARLIL(SEQIDNO:16);(g)HHARLIF(SEQIDNO:17);(h)THARLIL(SEQIDNO:18);①ARLI(SEQIDNO:19);(j)ARL(SEQIDNO:20);(k)HARLCL(SEQIDNO:21);(l)ARLCL(SEQIDNO:22);(m)ARCL(SEQIDNO:23);(n)MFARLIL(SEQIDNO:24);(o)FARLIL(SEQIDNO:25);(p)FARLI(SEQIDNO:26);Cq)FARL(SEQIDNO:27);(r)HARLIF(SEQIDNO:28);(s)ARLIF(SEQIDNO:29);及其同源物、衍生物和变体。7.如权利要求l所述的肽，其特征在于，所述肽偶联于选自下组的偶联肽(a)LHARLCLANFCGRNRV(SEQIDNO:4);(b)LARLCLANFCGNNNV(SEQIDNO:5);Cc)CARYRTGHHARLM(SEQIDNO:6);(d)HHARLPLANFCG(SEQIDNO:7);(e)RTGHHARLC承LANFC(SEQIDNO:8);(f)CESARYRTGHHARLC*(SEQIDNO:9);(g)DNTHHARLIL(SEQIDNO:10);(h)SHHARLIL(SEQIDNO:11);及其同源物、衍生物和变体。8.—种肽，由核酸序列SEQIDNO:15编码或由严格条件下与核酸序列SEQIDNO:15杂交的序列编码。9.如权利要求8所述的肽，其特征在于，所述严格条件是高严格性的southern杂交条件。10.—种组合物，含有具有氨基酸序列SEQIDNO:14的肽的。11.如权利要求10所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括载体。12.—种多核苷酸，具有核酸序列SEQIDNO:15。13.—种多核苷酸，编码氨基酸序列SEQIDNO:14。14.一种纯化生物样品中的如权利要求l所述肽的方法，所述方法包括(1)使该生物样品接触一种或多种具有选自下组的氨基酸序列的偶联肽(a)HHARL(SEQIDNO:1);(b)HARL(SEQIDNO:2);(c)HARLI(SEQIDNO:3);(d)HARLIL(SEQIDNO:12);Ce)HHARLCL(SEQIDNO:13);①ARLIL(SEQIDNO:16);(g)HHARLIF(SEQIDNO:17);Ch)THARLIL(SEQIDNO:18);(i)ARLI(SEQIDNO:19);(j)ARL(SEQIDNO:20);(k)HARLCL(SEQIDNO:21);(1)ARLCL(SEQIDNO:22);(m)ARCL(SEQIDNO:23);(n)MFARLIL(SEQIDNO:24);Co)FARLIL(SEQIDNO:25);(p)FARLI(SEQIDNO:26);(q)FARL(SEQIDNO:27);(r)HARLIF(SEQIDNO:28);(s)ARLIF(SEQIDNO:29);以及上述氨基酸序列的同源物、衍生物和变体；从而形成(A)如权利要求1所述的肽；和(B)—种或多种偶联肽的肽偶联物；(2)分离所得肽偶联物；和(3)将具有氨基酸序列SEQIDNO:14的肽从肽偶联物中分离以获得具有氨基酸序列SEQIDNO:14的纯化的肽。15.—种特异性识别以下肽的抗体(a)具有氨基酸序列SEQIDNO:14的肽；(b)由核酸序列SEQIDNO:15编码的肽；或(c)由在严格条件下与核酸序列SEQIDNO:15杂交的核酸序列编码的肽。16.—种纯化生物样品中的如权利要求l所述的肽的方法，所述方法包括(1)使该生物样品接触一种或多种具有选自下组的氨基酸序列的偶联肽(a)LHARLCLANFCGRNRV(SEQIDNO:4);(b)LARLCLANFCGNNNV(SEQIDNO:5);(c)CARYRTGHHARLM(SEQIDNO:6);(d)HHARLPLANFCG(SEQIDNO:7);(e)RTGHHARLC*LANFC(SEQIDNO:8);(f)CESARYRTGHHARLC*(SEQIDNO:9);(g)DNTHHARLIL(SEQIDNO:10);(h)SHHARLIL(SEQIDNO:11);及其同源物、衍生物和变体，从而形成(A)如权利要求1所述的肽；和(B)—种或多种偶联肽的肽偶联物；(2)分离所得偶联物；和(3)将具有氨基酸序列SEQIDNO:14的肽与一种或多种偶联肽分离以获得纯化的具有氨基酸序列SEQIDNO:14的肽。17.—种纯化生物样品中的如权利要求l所述的肽的方法，所述方法包括(a)使该生物样品接触一种或多种具有选自下组的氨基酸序列的偶联肽(i)ARLI(SEQIDNO:19);(ii)HARL(SEQIDNO:2);(iii)FARL(SEQIDNO:27);(iv)ARL(SEQIDNO:20);禾口(v)ARLC(SEQIDNO:30);其中所述肽的3'或5'末端侧面包含至少一个到至多达25个额外的氨基酸，从而形成(A)如权利要求1所述的肽；和(B)—种或多种偶联肽的肽偶联物；(b)分离所得偶联物；和(c)将具有氨基酸序列SEQIDNO:14的肽与所述偶联肽分离以获得纯化的具有氨基酸序列SEQIDNO:14的肽。18.—种确定阿耳茨海默病或其它神经退行性疾病的诊断试验，其包括(1)确定生物样品中权利要求1所述肽的含量；和(3)确定该样品中权利要求1所述肽的含量是否高于标志阿耳茨海默病或其它神经退行性疾病的阀值量。19.一种用于确定阿耳茨海默病或其它神经退行性疾病的诊断试验，其包括(1)使生物样品接触一种或多种具有选自下组的氨基酸序列的偶联肽(a)HHARL(SEQIDNO:1);(b)HARL(SEQIDNO:2);(c)HARLI(SEQIDNO:3);(d)HARLIL(SEQIDNO:12);(e)HHARLCL(SEQIDNO:13);(f)ARLIL(SEQIDNO:16);(g)HHARLIF(SEQIDNO:17);(h)THARLIL(SEQIDNO:18);(i)ARLI(SEQIDNO:19);①ARL(SEQIDNO:20);Ck)HARLCL(SEQIDNO:21);(l)ARLCL(SEQIDNO:22);Cm)ARCL(SEQIDNO:23);(n)MFARLIL(SEQIDNO:24);(o)FARLIL(SEQIDNO:25);(p)FARLI(SEQIDNO:26);(q)FARL(SEQIDNO:27);(r)HARLIF(SEQIDNO:28);(s)ARLIF(SEQIDNO:29);和上述氨基酸序列的同源物、衍生物和变体；(2)确定该样品中权利要求1所述肽的含量；和(3)确定该样品中权利要求1所述肽的含量是否高于标志阿耳茨海默病或其它神经退行性疾病的阀值量。20.—种用于确定阿耳茨海默病或其它神经退行性疾病的诊断试验，其包括(1)使生物样品接触一种或多种具有选自下组的氨基酸序列的偶联肽..(a)LHARLCLANFCGRNRV(SEQIDNO:4);(b)LARLCLANFCGNNNV(SEQIDNO:5);(c)CARYRTGHHARLM(SEQIDNO:6);(d)HHARLPLANFCG(SEQIDNO:7);(e)RTGHHARLC*LANFC(SEQIDNO:8);(OCESARYRTGHHARLC*(SEQIDNO:9);(g)DNTHHARLIL(SEQIDNO:10);(h)SHHARLIL(SEQIDNO:11);及其同源物、衍生物和变体；(2)确定该样品中权利要求l所述肽的含量；和(3)确定该样品中权利要求1所述肽的含量是否高于标志阿耳茨海默病或其它神经退行性疾病的阀值量。21.—种用于确定阿耳茨海默病或其它神经退行性疾病的诊断试验，其包括(a)使生物样品接触一种或多种具有选自下组的氨基酸序列的偶联肽(i)ARLI(SEQIDNO:19);(ii)HARL(SEQIDNO:2);(iii)FARL;(SEQIDNO:27)(iv)ARL(SEQIDNO:20);禾口(v)ARLC(SEQIDNO:30);其中所述肽的3'或5'末端侧面包含至少一个到至多达25个额外的氨基酸；(b)确定该样品中权利要求l所述肽的含量；和(c)确定该样品中权利要求1所述肽的含量是否高于标志阿耳茨海默病或其它神经退行性疾病的阀值量。22.—种蛋白质，含有如权利要求1所述的肽，所述蛋白质不是AD7c-NTP。23.—种用于确定阿耳茨海默病或其它神经退行性疾病的诊断试验，其包括(1)确定该样品中权利要求22所述蛋白质的含量；和(3)确定该样品中权利要求22所述蛋白质的含量是否高于标志阿耳茨海默病或其它神经退行性疾病的阀值量。24.—种用于确定阿耳茨海默病或其它神经退行性疾病的诊断试验，其包括-(1)使生物样品接触一种或多种具有选自下组的氨基酸序列的偶联肽〔a)HHARL(SEQIDNO:1);〔b)HARL(SEQIDNO:2);〔c)HARLI(SEQIDNO:3);〔d)HARLIL(SEQIDNO:12);(e)HHARLCL(SEQIDNO:13);〔f)ARLIL(SEQIDNO:16);(g)HHARLIF(SEQIDNO:17);(h)THARLIL(SEQIDNO:18);:i)ARLI(SEQIDNO:19);(j)ARL(SEQIDNO:20);〔k)HARLCL(SEQIDNO:21);:l)ARLCL(SEQIDNO:22);(m)ARCL(SEQIDNO:23);〔n)MFARLIL(SEQIDNO:24);〔o)FARLIL(SEQIDNO:25);(p)FARLI(SEQIDNO:26);(q)FARL(SEQIDNO:27);r)HARLIF(SEQIDNO:28);(s)ARLIF(SEQIDNO:29);和上述氨基酸序列的同源物、衍生物和变体；(2)确定该样品中权利要求22所述蛋白质的含量；和(3)确定该样品中权利要求22所述蛋白质的含量是否高于标志阿耳茨海默病或其它神经退行性疾病的阀值量。25.—种用于确定阿耳茨海默病或其它神经退行性疾病的诊断试验，其包括(1)使生物样品接触一种或多种具有选自下组的氨基酸序列的偶联肽(a)LHARLCLANFCGRNRV(SEQIDNO:4);(b)LARLCLANFCGNNNV(SEQIDNO:5);(c)CARYRTGHHARLM(SEQIDNO:6);(d)HHARLPLANFCG(SEQIDNO:7);(e)RTGHHARLC*LANFC(SEQIDNO:8);(f)CESARYRTGHHARLC*(SEQIDNO:9);(g)DNTHHARLIL(SEQIDNO:10);(h)SHHARLIL(SEQIDNO:11);及其同源物、衍生物和变体；(2)确定该样品中权利要求22所述蛋白质的含量；和(3)确定该样品中权利要求22所述蛋白质的含量是否高于标志阿耳茨海默病或其它神经退行性疾病的阀值量。26.—种用于确定阿耳茨海默病或其它神经退行性疾病的诊断试验，其包括(a)使生物样品接触一种或多种具有选自下组的氨基酸序列的偶联肽(i)ARLI(SEQIDNO:19);(ii)HARL(SEQIDNO:2);(iii)FARL(SEQIDNO:27);(iv)ARL(SEQIDNO:20);禾口(v)ARLC(SEQIDNO:30);其中所述肽的3'或5'末端侧面包含至少一个到至多达25个额外的氨基酸；(b)确定该样品中权利要求22所述蛋白质的含量；和(c)确定该样品中权利要求22所述蛋白质的含量是否高于标志阿耳茨海默病或其它神经退行性疾病的阀值量。全文摘要实施方式涉及一种肽和含有该肽的蛋白质、核酸、抗体以及检测该肽或蛋白质的测试方法，并涉及鉴定患有阿耳茨海默病和其它神经退行性疾病或具有阿耳茨海默病和其它神经退行性疾病发病风险的患者的方法。文档编号C12N15/12GK101151372SQ200680010083公开日2008年3月26日申请日期2006年2月23日优先权日2005年2月23日发明者J·杰梅尔,P·埃弗拜克申请人:尼莫克斯股份有限公司