膜转位肽的制作方法

专利名称：膜转位肽的制作方法
膜转位肽发明领域本发明涉及分离被称为膜转位肽(MTPs)的新型化合物的方法。该MTPs 的特征在于，具有将其自身及与MTP结合的非转位部分转运穿过膜的能力。
背景技术：
将核酸、蛋白质、肽、氨基酸、小分子、病毒等(下文将被共同称为"非 转位部分")递送至细胞内或递送至特定类型的细胞内的能力可用于肿瘤学、发 育生物学和基因治疗的多种应用，以及对模型系统中特定蛋白质、核酸和小分 子的操作模式的一般性理解也有用。大多数重要的治疗性蛋白质和肽不易于转 位穿过生物膜。然而，已发现一些反式激活因子和同源异型蛋白能够促进膜转 位，其中包括Tat衍生肽(Fawell & 1994 Prac. M^/. 5W. t/SJ91:664-668)、触角足同源结构域蛋白的第三螺旋(Derossi"a/.， 1994， J!5/o/.C/^附. 269:10444-10450; U.S. Pat. Nos. 5,888,762 and 6,015,787)和VP22 (Schwarze "/.， 2000, 7>e"(is T^(^maco/. 5W. 21:45-48)。这些天然衍生的肽一般被隔离于细胞 质中的膜囊中，这常常阻止结合的非转位部分接近其预期的靶(Potocky w d 2003, J6oz7 278:50188-94)。目前，通过两种不同的途径来工程化新型肽。第一种途径通过化学合成6-10 个氨基酸肽的随机文库来生成候选肽(J.Eichler W a/., 1995， i 饥化v.15:481-496; K丄am, 1996,爿油c朋cw Dn/gDm. 12:145-167; M. Lebl W 1997, e"巧/wo/. 289:336-392)。第二种途径中，通过将随机的寡核苷酸文库克 隆至Ff丝状噬菌体基因中而合成候选肽，这样使得更大的肽在噬菌体的表面表 达(H. Lowman， 1997,^4"". i ev. fifop/2ys. 5wmo/. Sfn^cf, 26:401-424; G. Smith ef o/.， 1993, Me仇￡/iz. 217:228-257)。也已经制备出长度高达38个氨基酸的随机肽文 库，而且使用该系统，有可能制备出更长的肽。使用上述两种策略任意一种制 备的肽文库随后通常与预选的结合基质的蛋白靶相混合。洗脱结合的肽，并确 定其序列。根据这一信息，合成新的肽，并确定其生物学特性。噬菌体展示以 往被用来鉴定转位蛋白，但是通过这种方法分离出的肽相对很少，并且那些已经分离到的肽通常为细胞类型特异性的肽，并需要通过内吞作用进入细胞(Gao e^/. 2002，MW C/ ew.， 10:4057-65)。肽依赖内吞作用进入细胞的现有技 术的缺点之一是，这种机制导致转位肽及结合的非转位部分进入包含体，在包 含体中他们均将遭到破坏，从而不能引起所需的细胞作用。现有技术的又一缺点在于，通过噬菌体展示和化学合成而产生的文库的容 量限制在106-109范围内。如果不继而使用费时的突变过程，这一限制导致较低 亲和力肽的分离。上述文库容量方面的限制导致了体外生成肽文库技术的发展， 其中包括mRNA展示(Roberts, & Szostak, 1997, /Voc. A^/. 5W. C7&4， 94， 12297-12302)、核糖体展示(Mattheakis e "/., 1994,iVw/.C7&4， 91, 9022-9026)、和顺式(CIS)展示(Odegrip ef a/.， 2004,尸rac. iVa" jcad [/&4, 101 2806-2810)等等。这些文库优于噬菌体展示文库的方面在于通过该方法产 生的文库容量比通过噬菌体展示而可能产生的文库容量要大2至3个数量级。 其原因是，不同于诸如噬菌体展示等技术，其中不存在中间的体内步骤。然而，目前还没有记载使用体外展示系统而特异性和选择性地鉴定膜转位 肽(MTPs)的方法。而且，这种方法能鉴定可穿过细胞层(例如内皮)的MTPs。因此，仍需能在MTP发现和肽药物开发领域提供具有需要的较大进步的方法。发明概述本发明提供了选择被称为膜转位蛋白或MTP的新化合物的方法，该新的化 合物可将其自身和非转位部分转位穿过如细胞膜的脂膜。根据其有效地将结合 的部分纳入膜包裹的隔室内的能力来选择本发明的MTP，所述隔室包括体内和 体外的很多细胞类型。所鉴定的本发明MTP也可包括用于诊断和治疗目的的分子。因此，本发明的第一方面提供了从肽展示文库中分离显示膜转位活性的化 合物的方法，其中所述文库包括多种编码展示肽的核酸序列，且该方法包括如 下歩骤a)表达多种核酸构建体，其中，每个核酸构建体包括可操作地连接至核酸序列的启动子序列，如此 以来，多种核酸构建体的表达导致了多种核酸-肽偶联体的形成，且每一偶联体包括至少一种展示肽，其中所述的展示肽与编码展示肽的相应核酸构建体相结 合.b) 将多个核酸-肽偶联体暴露于膜包裹的隔室群，从而使转位反应发生；c) 移除与膜包裹的隔室未结合的核酸-肽偶联体；以及d) 从膜包裹的隔室中回收被纳入的核酸-肽偶联体，并且当包括膜转位蛋白 (MTP)时，表征核酸序列编码的肽。在本发明的优选实施方式中，膜包裹的隔室为细胞。因此，本发明提供了 从肽展示文库中分离显示细胞膜转位活性的化合物的方法，其中所述文库包括 多种编码展示肽的核酸序列，且该方法包括如下步骤a) 表达多种核酸构建体，其中，每个核酸构建体包括可操作地连接至核酸序列的启动子序列，如此 以来，多种核酸构建体的表达导致多种核酸-肽偶联体的形成，且每一偶联体包 括至少一种肽，其中所述的肽与编码展示肽的相应核酸构建体相结合；b) 将多个核酸-肽偶联体暴露于一种或一种以上的细胞类型，从而使转位反 应发生；C)移除与一种或多种细胞类型未结合的核酸-肽偶联体；以及d)从细胞中回收被纳入的核酸-肽偶联体，并且当包括膜转位蛋白(MTP)时，表征核酸序列编码的肽。在另一个实施方式中，膜包裹的隔室优选为脂质囊。例如，人工构建的脂质包裹的隔室，如微团或脂质体。优选地，脂质囊是脂质体。优选地，膜包括脂双层。在上述发明的另一个特定实施方式中，所述方法在(c)后进一步包括移除 核酸-肽偶联体的步骤，其中所述的核酸-肽偶联体连结至膜包裹隔室(例如，脂 质体或一种或一种以上的细胞类型)表面，但没有被纳入隔室。因此，本发明 的方法优选地进一步包括步骤(C')移除与细胞表面结合的核酸-肽偶联体。该 实施方式相对噬菌体展示而言显示了本技术领域的显著进步，因为其区分了表 面结合的MTPs和被纳入的MTPs。令人惊喜的是，这显著提高了经过一轮、两 轮或多轮的选择之后被鉴定出的MTPs的数目。确实，在对顺式(CIS)展示文 库进行5轮选择后，9/23的肽被鉴定为MTPs (实施例1)。相反，通常在用于6鉴定MTPs的噬菌体展示选择中，只发现了很少数量的MTPs (Gao 2002, 所owg.C/ze附.10:4057-4065)。在另一实施方式中，所选择的MTP的膜转位活性不涉及或不需要内吞作用。 优选地，MTP能在无内吞机制的情况下穿过靶膜。因而，在优选的方法中，所 述的一种或一种以上的细胞类型是没有内吞能力的，例如红血细胞。本发明的另一方面提供了通过本发明的方法所鉴定的MTP。优选地，MTP 为被分离的肽。本发明进一步包括本发明的MTP的衍生物。在另一优选的实施 方式中，本发明的MTP或衍生物连接、结合或者附着/偶联至非转位部分。如以 下详述，非转位部分可为肽、核酸或另一化合物。优点在于，上述连接、结合、 附着或偶联的方式易于通过酶促反应或其它的化学方法/降解而被断裂。如果转位是单向的，至少对于转位穿过膜的化合物的部分是单向的，则是 优选的。这样是有好处的，因为MTP可能能够转位进入膜包裹的隔室或从膜包 裹的隔室转位出来。因而， 一旦MTP转位至膜包裹的隔室内，至少肽的一部分 保留在隔室中。保留在隔室中的肽的一部分可为MTP本身、结合的非转位部分、 或者MTP和非转位部分两者。优选地，至少非转位部分保留在膜包裹的隔室例 如靶细胞中。因此，更优选地，MTP连接、结合或者附着/偶联至(例如通过可 断裂的键的方式)非转位部分，且在转位至膜包裹的隔室中之后，非转位部分 从MTP释放至隔室或细胞。方便的是，非转位部分的释放是通过酶切或化学方 法，例如化学降解，这些将在下文中有进一步的描述。本发明进一步提供包括MTP的治疗性分子，其中所述的MTP偶联至或功 能性地连接至治疗性分子，例如治疗性肽或核酸。方便的是，治疗性分子为如 上所述的非转位部分，其包括用作诊断剂或治疗剂的任何化合物。非转位部分和潜在性治疗性分子的非限制性实例包括核酸(例如siRNA分 子)、酶、激素、细胞因子、抗体或抗体片段、肽片段(例如抗体识别的肽)、 止痛剂、退热剂、抗炎剂、抗生素、抗病毒剂、抗真菌药物、心血管药物、影 响肾功能和电解质新陈代谢的药物、作用于中枢神经系统的药物和化疗药物等 等。本发明的又一方面提供了包括编码本发明MTP的核酸序列的核酸分子，该 核酸序列任选地进一步编码非转位肽或非转位部分，并任选地进一步包括调节 性核酸序列。同时也提供了包含本发明核酸分子的表达载体。本发明的又一方面提供了一种组合物(例如治疗性组合物)，其包括膜包裹的隔室(例如脂质体)和本发明的MTP。优选地，该组合物进一步包括偶联至 MTP的非转位部分。最优选地，非转位部分是治疗性分子。进一步优选地，治 疗性组合物是通过将一种或一种以上的治疗性分子或/和本发明的MTP，或者两 者一起添加至一种或一种以上脂质体的制剂中并使转位发生而制备的。本发明的MTP文库由例如肽或肽的衍生物(如由天然的或非天然的氨基酸 组成的肽模拟物和肽类似物)组成。根据本发明，通过本发明分离的膜转位肽 (MTP)优选为非天然的氨基酸序列，其能越过或横跨脂质膜，优选地，越过 或横跨脂双层。通常，本发明的MTP能越过靶膜，从而肽被释放至膜内空间，即细胞的胞 质溶胶或脂质体的内空间。然而，在某些情况下，MTP可仅仅嵌入至靶膜中， 进而其能横跨膜。在这种情况下，至少MTP的一部分处于膜中，优选地，至少 MTP的一部分和/或结合的非转位部分中的一种处于内膜空间中。优选地，本发 明的MTP能越过靶膜并进入细胞质，例如红血细胞的细胞质。优选地，MTP 为大约2-25个或大约8-20个氨基酸残基的非天然氨基酸序列。优选地，通过本发明的方法来选择这些化合物，以进入膜包裹的隔室(例 如目标细胞)，同时保持与编码性核酸连接，从而也将核酸转运至细胞内。这些化合物的特异性实例包括线性肽或环肽(优选的长度为2-25个氨基酸 或大约8-20个氨基酸残基)、上述线性肽和环肽的组合(任选地，肽在N端或C 端、或两端有修饰)、及其盐和衍生物、其功能性类似物、和在序列的末端带有 氨基酸或多肽的延长的肽链。根据本发明，体外肽展示文库通过本领域技术人员已知的合适方法而制得。 例如，体外产生的核酸-肽偶联体的文库可通过下述合适的方法而适宜地产生， 例如Robert, & Szostak (1997,Ato/. ^cad 94, 12297-12302)、Mattheakis ef a/"(1994, iVa".爿cad Sci, 91,9022國9026)和Odegrip ""/.，(2004,户rac. 7V"f/. ^cad t/&4, 101 2806-2810)以及WO2004/022746所描述 的方法。诸如在文库的最大库容在噬菌体展示技术或化学合成的限度内的某些 情况下，这些方法可择一使用。然后根据转位越过(或至少为横跨)靶膜例如 目标类型细胞的膜的能力，对体外产生的核酸-肽偶联体的文库进行选择。在本发明所述方法的另一步骤中，编码MTP的文库成员通过使用合适的核 酸酶或蛋白酶或其两者的结合，从靶膜或细胞的表面移除编码非膜转位肽的核 酸-肽偶联体而被进一步选择。然后回收和表征能越过膜，进而进入细胞或囊(例 如脂质体)，并将结合的核酸部分转运至细胞的MTP。本发明还提供了编码MTP的核酸-肽偶联体的选择，其中的MTP连接至两 种或更多种MTP或本领域技术人员可想到的其它任何组合上。例如，核酸序列 文库的一个或一个以上(优选"每个")成员可编码2、 3、 4或更多MTP或潜 在的MTP序列。本发明进一步提供了编码连接至两种或更多种非转位部分的 MTP的核酸-肽偶联体的选择。本文引用的所有文献以整体引用的方式纳入本文。如果没有特别限定，本 文所有的技术术语和科学术语具有本发明所述领域的普通技术人员通常理解的 含义。本发明通过附图进一步说明，其中

图1显示非固定的Jurkat细胞的FACS分析和荧光显微观察。肽7、 13和 19为通过本发明的方法分离的膜转位肽。肽24为阴性对照FLAG表位肽。图2显示了通过本发明的方法所选择出的膜转位肽与已知的HIV-TAT的膜 转位肽之间的肽序列比较。详细描述为了有助于理解本发明，本文对几个术语进行了定义。本文所用的"肽"、"膜转位肽"或"MTP"是指以线性链的形式连接在一 起的多个氨基酸，包括二肽、三肽、寡肽和多肽。二肽包括两个氨基酸；三肽 包括3个氨基酸；寡肽通常是指具有2至大约50个或更多个氨基酸的肽。大于 50个氨基酸的肽通常被称为多肽或蛋白质。本发明的"肽"和"膜转位肽"或 "MTP"不被限制于任何特定的氨基酸数目。优选地，它们包含约2-约50或约 2-约40个氨基酸，更优选地，它们包括约2-约30个氨基酸或约2-约25个氨基 酸。最优选地，肽或MTP包括约2-约20个氨基酸或约8-约20个氨基酸。例如， 本发明所鉴定的MTP的长度可为18、 19、 20、 21、 22、 23、 24或25个氨基酸， 通常，蛋白质的膜横跨结构域的长度是22-25个氨基酸，因此，特别在MTP横 跨而非越过靶膜的情况下，MTP的长度可为22、 23、 24或25个氨基酸。本文所用的"膜转位肽"(MTP)是指氨基酸序列(如上所述)，其可包含 天然氨基酸和非天然的氨基酸。所以，所谓的"肽模拟物"和"肽类似物"在 本发明的上下文中也可为"膜转位肽"，其中所述的"肽模拟物"和"肽类似物" 可包括模拟特定氨基酸或肽的非氨基酸性的化学结构。该模拟物或类似物的特 性通常表现为相似的物理性质，诸如大小、带电性或疏水性，以及在他们的天 然肽对等物中所发现的合适的空间定位。肽模拟化合物的特定实例是其中的一 个或多个氨基酸之间的酰胺键被例如为碳-碳键或其它非酰胺键的键所替代的化 合物，这是本领域所熟知的(例如，见尸e/ "fifeBasWDn/gr^/g/z, pp. 378-422， ACS, Washington D.C. 1995中的Sawyer)。本发明针对从肽群(或肽库)中鉴定和表征MTP， g卩，在核酸序列文库中 表达的潜在的或假定的MTP。尽管本文用到术语"肽"，应当理解的是，本发明 并不排除那些可能按照传统的命名法而被恰当地称为多肽或蛋白质的MTP或更 大的肽结构域和基序的鉴定。进一步地，术语"膜转位肽"(MTP)可包括越过膜的肽，从而MTP以及 任何结合的非转位部分从膜的一边穿过到膜的另一边，并且，该术语也可包括 仅仅"横跨"靶膜的肽。"横跨"是指，MTP可插入(或贯穿)靶膜，从而至少 MTP的一部分留在膜中。因此，例如，通过本发明的方法选择的MTP可横跨靶 膜，从而导致了 MTP的一部分留在膜(或脂双层)中以及MTP的一部分或结 合的非转位部分被纳入(即被发现位于各自囊或细胞的内部)。然而优选地，本 发明的MTP越过靶膜，从膜的一侧穿过到另一侧。有一种形式是，本发明的 MTP能越过多个膜，例如多层Caco-2细胞或内皮细胞，这样，MTP能从组织 的一侧移动到组织的另一侧或到组织的层中。MTP的"衍生物"是指能将自身和任选的结合的順联的非转位部分穿过靶 膜的肽序列，其包含对通过本发明的方法鉴定的MTP的初级肽序列的一个或一 个以上的突变或修饰。因此，MTP的衍生物可具有引入至本发明的MTP的一个 或一个以上，例如1、 2、 3、 4、 5和更多个化学修饰的侧链。另外，或可选择 地，MTP的衍生物可含有对本发明的MTP的初级肽序列的一个或一个以上，例 如1、 2、 3、 4、 5和更多氨基酸突变、替换或缺失。因此，本发明包括为改善 MTP的一个或一个以上的性质而对MTP进行的突变试验的结果。例如，使用本 领域已知的方法(例如通过修饰编码性DNA或RNA序列)而随机突变或特异性突变MTP的1、 2、 3、 4、 5和更多个氨基酸残基，并通过本领域已知的任何 方法，根据预定的要求(例如对转位至特定细胞类型的改善，或对特定细胞类 型选择性的改善)而选择所获得的衍生肽的文库或群。所选择出的显示出膜转 位能力的肽为MTP的衍生物，并落入到本发明的范围之内。"膜转位蛋白"短语中的术语"膜"包括任何人工的或天然的膜，其包括 单层或双层的脂肪族分子，例如脂肪酸或脂质分子。因此，该术语包括微团的 膜、脂质体膜或本领域技术人员己知的其它囊的膜、和任何类型天然细胞的膜， 其中包括细菌、真菌、植物、动物或人，例如血细胞(如红细胞)或上皮细胞(包括皮肤细胞和肠壁细胞)。优选地，膜是脂双层并包裹人工脂质体，或是胞 内机能不全的细胞。本文所述的"非转位部分"是指不能使其自身穿过膜(例如为脂单层、脂 双层或细胞膜)的实体；或指不能使其自身充分有效地越过膜从而产生预期胞 内效果的部分。这种非转位部分包括核酸和其它聚合物、肽、蛋白质、肽核酸(PNAs)、抗体、抗体片段和膜不透性小分子等。优选地，非转位部分是治疗性 分子，这些在本文的其它部分有进一步的描述。本发明范围内的术语"氨基酸"以其最广泛的含义使用，其旨在包括天然 的L型a氨基酸或氨基酸残基。本文使用通常所使用的天然氨基酸的单字母或 三字母简称(Lehninger， A丄.，(1975)历0c/^附W7, 2d ed.， pp. 71-92， Worth Publishers, New York)。标准的单字母代码和标准的三字母代码的对应关系是本 领域技术人员所熟知的，复述如下A=Ala; C=Cys; D=Asp; E=Glu; F=Phe; G=Gly; H=His; I=Ile; K=Lys; L=Leu; M=Met; N=Asn; P=Pro; Q=Gln; R=Arg; S=Ser;T=Thr;V=Val; W=Trp;Y=Tyr。 一般性术语"氨基酸"进一步包括D氨基 酸以及化学修饰的氨基酸(例如氨基酸类似物)、通常不包含在蛋白质中的天然 氨基酸(如正亮氨酸)和具有本领域已知的氨基酸特性的化学合成化合物。例 如苯丙氨酸或脯氨酸的类似物或模拟物同天然的Phe或Pro—样对肽化合物起到 相同的构象限制作用，所以他们属于氨基酸定义的范畴。这种类似物或模拟物 在本文被称为各自氨基酸的"功能性类似物"。氨基酸的其它实例见通过引用被 纳入本文的下述文献Robert and Vellaccio， 7T e尸e/ ^/asv ^wa/ys/s, Gross and Meiehofer， eds., Vol. 5p. 341, Academic Press, Inc., N.Y. 1983.本发明针对从肽群(或库)中鉴定和表征MTP，即潜在的或假定MTPs。 具体地说，本发明的MTPs的选择是通过使用体外产生的肽库的体外展示而进 行的。本文所用的术语"体外展示"、"体外肽展示"和"体外产生的文库"是指 这样的系统，其中肽库以被表达的肽与编码它们的核酸相结合的方式被表达， 而且这种结合不随细胞或细菌与所述核酸而转化。该系统与噬菌体展示和其它 "体内展示"系统形成鲜明的对比，在后者的系统中，肽与编码它们的核酸的 结合随细胞或细菌与所述核酸而转化。本文的上下文中所用的膜转位肽可"偶联"至非转位部分。本文所用的术 语"偶联"以其最广泛的含义使用，从而包括本领域技术人员已知的所有联结或 连接的方法。例如，非转位部分可以是MTP的C端或N端的氨基酸延伸。另 外，在MTP和非转位部分之间可存在短的氨基酸连接子序列。本发明进一步提 供了MTP连接的分子，例如任选地通过连接子序列化学偶联至非转位部分。一 般情况下，MTP将通过非转位部分中不影响非转位部分活性的位点而被连接至 非转位部分。再一次地，认为MTP被偶联至非转位部分。任选地，在被纳入后 这种连接可被细胞质中的还原性环境所破坏。如本文所用的，术语"偶联"可与术语"连接"、"结合"或"附着"互换 使用。广泛的共价和非共价形式的偶联是本领域的技术人员已知的，并落入至 本发明的范围之中。例如双硫键、化学性连接和肽链都是共价连接的形式。在 优选非共价方式的偶联时，联结的方式可为，例如生物素-抗生蛋白(链菌素) 连接或与其类似的连接。抗体(或抗体片段)-抗原间的相互反应也适用于将本 发明的MTP偶联至非转位部分。合适的抗体-抗原的配对是荧光素-抗荧光素间 的相互反应。用这种方式制备单向和靶向的转运系统，借此，MTP及其结合的非转位部 分之间的偶联方式优选地在一旦MTP及其结合的非转位部分(至少是非转位部 分本身)越过靶膜时被断裂/剪切。可使用偶联方式与剪切系统的任一合适的组 合，例如酶切、配体竞争、辐射等等。优选地，当靶膜为细胞膜时(这时非转 位部分将被递送至细胞)，偶联方式为在细胞内(例如在细胞质内)能被酶(优 选为内切酶)剪切的肽键。或者，偶联优选为易于在细胞的胞内还原性环境剪 切的二硫桥。当膜包裹的隔室不是细胞，例如为脂质囊、脂质体或其类似物时，优选使用偶联方式与剪切方式的替代组合。同样，只要非转位部分可被单向性 地递送至隔室内部(如需要)，可使用任何合适的方式。偶联形式的非转位部分可以是活性的，也可以不是活性的，但在任何情况下优选地是，其从MTP上解离后(也就是一旦偶联被断裂)是活性的。本发明通过在体外产生的文库中筛选膜转位性质，从而表现出在肽药物开 发领域的显著进步。合成编码多种肽的体外产生的文库并首先对结合、贯穿(例 如横跨膜)或纳入至靶细胞或脂质体群进行选择。不能以上述一种或两种方式 与靶细胞或脂质体相结合文库成员通过洗涤或本领域技术人员已知的其它的合 适方法被移除。例如，密度足够大的细胞和脂质体(或其它靶膜包裹的隔室) 可以通过旋转穿过非水相的油层，从未结合的文库成员中分离结合膜的文库成 员。优选地，所述油为矿物油。其它合适的油包括比重比水小的油。在这一方 面，矿物油在25'C下具有的比重为0.84g/ml。优选地，诸如血红细胞的细胞通 过离心穿过矿物油而从未结合文库成员中分离出来。如上面所提到的，MTP可 贯穿或越过靶膜，编码MTP或表面结合肽的文库成员在这一过程中保持与靶的 结合或被纳入至细胞。随后通过非特异性蛋白酶(例如胰蛋白酶)或核酸酶(例如DNaseI)、或上 述两者的组合，或本领域技术人员已知的任何其它的方法将表面结合文库成员 从细胞表面移除。只有编码MTP的文库成员保留在细胞群中。然后回收被纳入的MTPs，并通过对结合的核酸进行测序以及通过例如表达 或合成编码的MTP以确认所需的膜转位特性，从而对其逐一进行表征。也可确 定MTP的最终亚细胞定位。如前所述，该步骤(即，从MTPs中移除与膜结合 的文库成员)不能用于噬菌体展示文库，这是因为这些噬菌体展示文库对蛋白 酶(例如胰蛋白酶)有天然抗性(见例如WO-A-9卯58655)，并且由于病毒衣 对噬菌体核酸的保护而导致不能使用核酸酶。噬菌体展示文库的又一限制在于， 噬菌体颗粒对细胞膜的固有的非特异性结合，该非特异性结合对本领域的技术 人员而言是熟知的。优点是，本发明的MTPs被分离并被分别表征。然而，可通过本发明的方 法来获得MTPs的混合群，例如在本发明的方法中当一种以上核酸-肽偶联体越 过膜并被纳入至例如脂质体或细胞中时。这时，本发明也包括所述的MTPs的 混合群。优选地，本发明提供了不是通过内吞作用而令人惊讶地越过细胞膜的MTPs。这些MTPs可通过在选择中使用没有已知的内吞转运机制的细胞(例如 血红细胞)，或通过使用膜包裹的隔室(例如脂质体)进行进一步的选择。任选地，本发明可用于细胞类型特异性MTPs的分离。合成体外产生的编 码多种肽的核酸文库，并在与不同的非靶细胞群一起进行较早时的温育以移除 可交叉反应的MTP (即那些与非耙细胞类型相结合的MTP)后，根据结合或纳 入至所感兴趣的靶细胞群(例如癌细胞群)而进行选择。实施该方法的手段将 为本领域技术人员所周知。通常，通过洗涤或本领域技术人员已知的其它方法 移除不能结合至所感兴趣靶细胞群的文库成员。然后通过非特异性蛋白酶(例 如胰蛋白酶)、或核酸酶(例如DNaseI)、或上述两者的结合、或本领域技术人 员已知的其它方法将表面结合的文库成员从细胞表面移除。在本发明上述方法 中，只有编码MTP的文库成员保留在细胞群中。然后回收被纳入的MTPs，并 通过对结合的核酸进行测序、表达或合成编码的MTP进行测序以确认所需的膜 转位特性，而对其进行逐一表征，而且，如果有可能，也可通过确定MTP的亚 细胞定位进行表征。本发明也可用于对能越过诸如Caco-2细胞或人上皮细胞的细胞层的MTPs 的分离。合成编码多种靶肽的体外产生的核酸文库，然后根据结合、贯穿或纳 入至感兴趣的细胞群进行选择，其中所述的靶细胞群，例如为生长于层中的 Caco-2细胞。通过洗涤或本领域技术人员已知的其他方法移除不能结合至靶细 胞群的文库成员。优选地，然后通过非特异性蛋白酶(例如胰蛋白酶)、或核酸 酶(例如DNaseI)、或上述两者的结合、或本领域技术人员已知的其它方法将表 面结合的文库成员从细胞表面移除。再一次地，只有编码MTP的文库成员保留 在细胞群中，并免遭蛋白酶和核酸酶的裂解。然后回收被纳入的MTPs，并通过 对结合的核酸进行测序、以及任选的表达或合成编码的MTP以确认所需的上皮 细胞层的转位特性，而对其进行逐一表征。或者，细胞可在聚碳酸酯滤器上排 列成单层，并如Stevenson等(1999， 7/ t. /尸力ar瓜177, pp 103-115)所述进行选择。如果其转位通过细胞的话，可将放置在细胞顶面的体外肽文库回 收在基底外测面。使用这种方法，有可能选择能越过生物膜(例如肠细胞壁或 皮肤)的MTPs。用这种方式分离的MTPs具有作为非转位部分的口服递送剂的用途。举例 来说，本发明的MTP可偶联至诸如胰岛素的蛋白质药物并配制成合适的药物组 合物，从而在进入肠时MTP将胰岛素转位至血液循环系统。再举一例，本发明 的MTP可偶联至小分子并配制成合适的药物组合物，从而在进入肠时MTP将 小分子转位至血液循环系统。在又一实例中，可将MTP以适当的药物组合物包 被在包含蛋白质、肽或小分子药物的纳米颗粒表面，从而在进入肠时MTP将纳 米颗粒转位至血液循环系统。在本发明的另一组合物中，MTP及其结合的非转位部分(即治疗性分子) 与脂质伟群(即脂质囊或其它人工膜包裹的隔室)相混合，以产生包含MTP和 治疗性分子的脂质体治疗性群。可通过例如静脉注射的方式将脂质体治疗性群 施用至患者。当治疗性脂质体有必要特异性地靶向特定细胞类型时，脂质体组 合物可与识别耙细胞类型的抗体结构域或其类似物进行进一步地配制。该方法 对本领域技术人员而言是公知的。本发明的MTPs以及结合至非转位肽的MTPs可通过重组DNA技术和标准 的蛋白表达和纯化步骤进行制备。因此，本发明进一步提供了编码本发明的 MTPs、及其衍生物或治疗性分子的核酸分子。例如，根据常规技术(Sambrook J. et al, Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY)将编码相关肽的DNA插入至合适的表达载体(例如 pGEM ， PromegaCorp.，USA)中，并转化至合适的宿主细胞中进行蛋白表达。 合适的宿主细胞是那些能在培养物中生长并顺从外源DNA转化的细胞，包括细 菌、真菌细胞以及较高等的真核来源细胞(优选哺乳动物细胞)。或者，可使用 合适的体外(转录和)翻译系统(例如大肠杆菌S30提取系统，Promega corp.,USA)来体外合成MTPs。应用于DNA序列(例如在表达载体中或构建体中)的术语"可操作地连接" 是指排列序列，以使序列能协调作用，从而达到所期望的目的，即，启动子序 列起始转录，并使之继续进行通过所连接的编码性序列，直至终止序列。选择和分离MTP后，通过合适的手段将诸如治疗性分子的功能性群体联结 至MTP。如之前所述，MTP可偶联至治疗性分子的任一合适形式，例如抗体、 酶和小分子化学性化合物。治疗性分子的优选形式是能在靶细胞内诱导RNAi 的siRNA分子。通常，使用化学连接子将siRNA连接至诸如MTP的肽。例如，通过马来酰亚胺-巯基键(马来酰亚胺基在肽上，而巯基在核酸上)或二硫键(游离的半胱氨酸基在肽上，而巯基在核酸上)将核酸或PNA连接至肽。按照常规标准配制本发明的药物制剂和组合物，并以口服、静脉、局部或 其它标准途径的形式施用。药物组合物的形式可为片剂、丸剂、洗剂、凝胶剂、 液体、粉剂、栓剂、混悬剂、脂质体、微颗粒或本领域已知的其它合适剂型。因此，本发明也包括根据本发明方法分离的MTP在治疗性或诊断性处理中 的用途。具体地说，本发明提供了MTP将非转位部分(如前文所述)递送至一 种或一种以上膜包裹的隔室群中的用途。优选地，所述的膜包裹的隔室是脂质 体或一种或一种以上的细胞类型的群。尤其优选的本发明的MTP的用途是将 非转位部分(尤其是诸如siRNA分子的治疗性分子)递送至靶细胞类型或群体。 靶细胞或细胞群可为体内的，即在动物或人受试者中；或为间接体内的，即从 动物或人受试者中移除后并将其重新导入；或者另外，细胞、细胞群或脂质体 是体外的。可使用本领域技术人员已知的任一施用途径。具体而言，优选使用 对靶细胞类型或靶细胞群优选的施用途径。例如，施用至受试者或患者的优选 途径包括皮下注射、摄食或栓剂。示例性地，为了治疗受试者的病毒感染，本发明的MTP可偶联至合适的抗 病毒剂，然后将MTP和抗病毒分子以裸露的形式或以包含在如人工脂质体中的 形式施用至受试者。相似地，如果受试者患有诸如癌症的细胞性疾病，本发明 的MTP可偶联至合适的抗癌分子/药物(例如siRNA分子或其它治疗性实体)， 并通过合适的施用途径将其施用至受试者。MTPs可用于将其自身或非转位部分 递送至细菌细胞。因此，通过将本发明的MTP偶联至抗细菌剂能治疗受试者的 细菌感染。进一步，在这方面有时需要治疗性组合物，诸如偶联至治疗性分子的MTP， 被递送至受试者中特异性的细胞类型或细胞群。这可通过下述方式以间接体外 的方式完成，例如，将治疗性组合物添加至已从受试者或患者中移除的细胞群 中。另外，可根据需要如前所述地选择MTP以转位至特异性的细胞类型。另外， MTP可直接偶联至抗体分子、抗体片段(例如Fab、 F(ab)2、 scFv等)或其它 合适的靶向性试剂，从而MTP和任何其它的被偶联部分靶向需要治疗和诊断的 特异性细胞群。在另一个实施方式中，MTP和其结合的非转位部分可包含在脂16质体群中，其中脂质体(例如脂质体膜)又包括合适的靶向性部分，例如抗体 和抗体片段。然后可将所得的脂质体施用至受试者和患者。在上述用途中，优选地，MTP通过在靶细胞类型中可剪切的相互作用偶联 至非转位部分或治疗性分子，例如通过酶切，或源于细胞内还原性环境的方式。 本发明将通过下述非限制性的实施例得到进一步的阐释。实施例除非另外指出，实施例中使用市售的反应试剂和分子生物学和生物化学中 的标准技术。材料和方法本申请所使用的下述方法在上述的Sambrook， J. et al.， 1989:analysis of restriction enzyme digestion products on agarose gels and preparation of phosphate buffered saline中有描述。通常用途的反应试剂从SIGMA-AldrichLtd (Poole， Dorset, U.K.)处购买。 寡核苷酸得自Eurogenetec Ltd (Southampton, U.K.)。氨基酸和S30提取物得自Promega Ltd( Southampton, Hampshire, U.K. )。 Vent 和Taq DNA聚合酶得自New England Biolabs(Cambridgeshire, U.K.)。 FITC标记 的肽得自Pepscan Systems (Lelystad, Netherlands )。实施例l(i) 用于选择MTPs的顺式展示文库的构建 文库构建及体外转录和翻译的实施在文献Odrgrip et al., 2004, Proc. Natl.Acad. SciUSA， 101 2806-2810中有描述。通过PCR将18-mer NNB文库(其中N为任一核苷酸，B为C、 T或G) 附着至tac启动子，然后通过PCR扩增将其连接至-RepA-CIS-ori区域，从而制 得tac-NNB-RepA-CIS-ori构建体。(ii) 具有细胞膜转位能力的肽的选择3(TC下在大肠杆菌S-30溶菌产物系统中用2pg文库DNA进行体外转录和 翻译30分钟，然后用封闭缓冲液进行稀释(含1%BSA的PBS)。通常，每50^1S-30溶菌产物中添加2吗线性DNA。向表达的文库中添加5^1 PBS洗涤的红血 细胞(RBC)中，并在冰上孵育30分钟。在2000 rpm下离心RBC达5分钟，然后移除上清液。RBC沉淀物在200^1添加有2mM CaC12、2mM MgCl和l吗DNasel的PBS中重新悬浮，并在室温下温育15分钟。用PBS洗涤细胞一次，通过离心形成松 散的沉淀物，然后将该沉淀物再次重新悬浮于20(^1 PBS中。将RBC混悬液置 于200ial邻苯二甲酸二丁酯上，并在11000rpm下离心4分钟。移除水相，并将 RBC沉淀物从油中慢慢吸出，再重新悬浮在100plPBS中。在500(il PB缓冲液(Qiagen)中溶解细胞，使用Qiagen柱纯化DNA，然 后将纯化的DNA重新悬浮于50^1无菌水中。在平行选择中，用lkig/ml胰蛋白酶代替DNaseI在37"C下处理RBC达30 分钟，此时，旋转细胞，移除上清液，然后将沉淀物重新悬浮于200^1 PBS中。 旋转细胞通过邻苯二甲酸二丁酯，并且将如上所述回收的DNA用于DNase处理 的细胞。如Odegrip等的文献(2004， Proc.Natl. Acad. Sci USA, 101 2806-2810)所 述，分别从两种选择中扩增N末端文库区域，并用Rep-CIS-ori进行重新组装, 从而产生用于下轮选择的输入用DNA。5轮选择后，使用PCR扩增回收的DNA， 纯化后用和iVcoI消化。然后将上述DNA连接至被相似消化的M13 gpVIII 噬菌粒载体，并转化至大肠杆菌XL-1蓝细胞中，然后平铺在2%葡萄糖、2xTY、 100 pg/ml氨卡青霉素平板上。使单克隆生长过夜，分离噬菌体DNA并对其测 序以确定其肽序列。(m)膜转位能力分析合成所选择的肽，同时在N端用FITC标记，并使用Jurkat细胞通过FACS 分析细胞结合。在PBS中洗涤Jurkat细胞(100 000)，室温下在100 pl添加有1% 胎牛血清的PBS中与1吗标记肽温育15分钟，在PBS中洗涤两次，然后在Becton Dickinson FACS分析仪中分析。在没有固定的情况下用荧光显微镜下观察结合 细胞的肽以监测细胞的纳入。23种肽中，有9种与细胞相结合。实例如图l所示。图1显示了非固定的Jurkat细胞的荧光显微镜检测以及FACS分析。肽7、 13和19为通过所述方法分离的示例性膜转位肽。通过显微镜所观察到的细胞内的荧光(左边和中间的图片)和FACS得到细胞内的荧光强度(右边的曲线图) 可观察标记。FACS分析的曲线图表明了FITC-荧光(X轴)对细胞数目(Y轴) 的计数。肽24是作为阴性对照的FLAG表位肽，其通过显微镜下或FACS分析 时不使细胞产生荧光。如上所述，用DNaseI或胰蛋白酶进行平行选择，以移除膜结合的或非转位 的肽-repA-DNAl体，从而避免对细胞溶解后对MTP回收的污染。被纳入的肽 -repA-DNAl体对这些酶中的任何一个的处理具有抗性。在另一个方法中，或者 使用DNaseI消化repA DNA，从而其不能被扩增，或者使用胰蛋白酶消化肽-repA 蛋白以及任何潜在的蛋白-蛋白间的相互反应。己发现，这两种方法在选择所需 MTPs方面是成功的。(iv) MTP的序列分析选择膜转位活性肽(MTP)进行序列分析，以确定膜转位活性肽序列是否 与己知的膜转位基序具有序列相似性。结果如图2所示。如所显示的那样，所选择的肽(表示为D4，最上面的一行，SEQIDNO: 1) 显示出与已知的mV-TAT蛋白的膜转位基序(最下面的一行)具有某种程度的 序列同源性(如中间的一行所示)。结果进一步说明了所述选择方法的功效，其中所述的选择方法用于分离显 示出细胞膜转位活性的化合物。然而需要指出的是，根据所述及的方法分离到的其它MTPs并没有显示出 与已知转位结构域的序列同源性。这提供了对新型MTPs的鉴定。实施例2(i) 用于选择MTPs的顺式展示文库的构建 下述实施例描述了能够越过或贯穿合成脂质膜的MTPs的选择。文库构建以及体外转录和翻译根据上述实施例1所述进行。(ii) 合成的具有膜转位能力的肽的选择 体外转录和翻译根据上述实施例1所述进行。人造油性隔室的乳剂通过如下步骤制备将50plPBS (以10pl等分)缓缓 加至0.5 ml冰冷的含0.5% Triton X-100和4.5% Span80 (山梨糖醇酐三油酸酯 (sorbitane trioleate))的轻矿物油，并于冰上以1600rpm搅拌5分钟。乳剂混合物在3000g下旋转5分钟，移除油相，使乳剂保留在管底部。然后将体外转录 和翻译混合物加至lml PBS中的乳剂混合物中，并缓缓翻转5次进行混合，然 后在冰上孵育30分钟。然后加入2.5pg DNaseI以及2mM CaCl2和2mM MgCl (最终浓度)，并在室 温下温育15分钟。作为DNaseI的替代，可加入lpg/ml胰蛋白酶，并在37"C下 温育30分钟。通过每次加入lml PBS并在3000g下离心5分钟，再去除洗液来洗涤乳剂5 次。通过加入lml己垸、漩涡、简短离心和移除己烷层来破坏和洗涤乳剂。洗 涤步骤可重复1次或两次以上，残留的己垸通过在Speedvac (Farmingdale， NY) 中室温下干燥5分钟来移除。通过加入100plPB缓冲液(Qiagen)来回收DNA，且如实施例1所示制备 用于下一轮的选择的DNA。在如实施例1所示将DNA克隆至噬菌体之前，选择步骤可重复多次，例如 5次。通过测序可鉴定肽序列，并且如实施例1所示检测肽。
权利要求
1. 从肽展示文库中分离显示膜转位活性的化合物的方法，其中所述文库包括多种编码展示肽的核酸序列，该方法包括如下步骤a)表达多种核酸构建体其中，每个核酸构建体包括可操作地连接至核酸序列的启动子序列，以使多种核酸构建体的表达导致多种核酸-肽偶联体的形成，且每一偶联体包括至少一种展示肽，所述展示肽与编码展示肽的相应核酸构建体相结合；b)将多个核酸-肽偶联体暴露于膜包裹的隔室群，从而使转位反应发生；c)移除与膜包裹的隔室未结合的核酸-肽偶联体；以及d)从膜包裹的隔室中回收被纳入的核酸-肽偶联体，并且当包含膜转位肽(MTP)时，表征核酸序列编码的肽。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述的膜包裹的隔室群是一种或一种以上类型的细胞群。
3. 根据权利要求2所述的方法，其中一种或一种以上类型的细胞群包括细 胞层。
4. 根据权利要求3所述的方法，其中步骤(d)被修改为回收转位通过细胞 层的核酸-肽偶联体。
5. 根据权利要求3或4所述的方法，其中所述的细胞为Caco-2细胞。
6. 根据权利要求1所述的方法，其中所述的膜包裹的隔室群为脂质体群。
7. 根据以上任一项权利要求所述的方法，其在(c)部分后进一步包括移除 核酸-肽偶联体的步骤，其中所述的核酸-肽偶联体结合至膜包裹的隔室表面，但 并没有被纳入隔室内。
8. 根据权利要求7所述的方法，其中所述的移除包括将膜包裹的隔室暴露 于蛋白酶、核酸酶或蛋白酶和核酸酶的组合。
9. 根据以上任一项权利要求所述的方法，其中通过离心隔室通过非水层将 未结合膜的肽-核酸偶联体与膜包裹的隔室分离。
10. 根据权利要求9所述的方法，其中所述非水层为矿物油。
11. 根据以上任一项权利要求所述的方法，其中所述的肽展示文库为体外肽 展示文库。
12. 根据权利要求11所述的方法，其中体外肽展示文库为顺式体外肽展示 文库。
13. 根据以上任一项权利要求所述的方法，其进一步包括将步骤(d)中的 一种或一种以上表达的膜转位肽与相应的核酸构建体相关联的步骤，从而鉴定 膜转位肽化合物的核酸序列。
14. 根据以上任一项权利要求所述的方法，其中所述MTP包括长度为2-50 个残基的氨基酸序列。
15. 根据以上任一项权利要求所述的方法，其中所述MTP包括长度为2-25 个残基的氨基酸序列。
16. 根据以上任一项权利要求所述的方法，其中所述MTP包括长度为2-20 个残基的氨基酸序列。
17. 通过以上任一项权利要求所述的方法获得的膜转位肽(MTP)或其衍生物。
18. 根据权利要求17所述的MTP或其衍生物，其偶联至非转位部分。
19. 根据权利要求18所述的MTP,其中偶联的非转位部分是治疗性分子。
20. 根据权利要求18或19所述的MTP，其中所述的偶联可在细胞内被剪 切，从而非转位部分或治疗性分子被胞内递送。
21. 根据权利要求20所述的MTP，其中所述的偶联借助二硫键或可酶切肽键。
22. 根据权利要求19-21任一项所述的MTP，其中所述的治疗性分子是 siRNA分子、肽核酸、或者抗体或抗体片段。
23. 通过权利要求1-16任一项所述的方法获得的编码MTP的核酸。
24. 包含权利要求23所述核酸的表达载体或构建体。
25. —种脂质体组合物，其包括一种或一种以上的脂质体以及一种或一种以 上的权利要求14-19任一项所述的肽。
26. 根据权利要求25所述的脂质体组合物，其进一步包括诸如抗体或抗体 片段的靶向部分。
27. 权利要求17所述的MTP在将非转位部分递送至耙细胞中的应用。
全文摘要
本申请提供了从肽展示文库中选择膜转位肽(MTPs)的方法，其中所述的转位肽越过或贯穿脂质膜。表达编码展示肽的多种核酸构建体，从而形成多种核酸-肽偶联体，且每一偶联体包含至少一种展示肽，其中所述展示肽结合有编码该展示肽的相应核酸构建体；将偶联体暴露于膜包裹的隔室群中，从而使转位反应发生；移除与膜未结合的偶联体；任选地，移除与膜结合的偶联体；并回收被纳入的核酸-肽偶联体。所述的膜包裹的隔室可为人造小囊，例如脂质体，或为一种或一种以上细胞类型的群。
文档编号C12Q1/68GK101258242SQ200680026758
公开日2008年9月3日 申请日期2006年7月24日 优先权日2005年7月22日
发明者克里斯·厄尔曼, 凯文·菲茨杰拉德, 戴维·孔伯, 托马斯·利安德森, 邓肯·麦格雷戈 申请人:伊索杰尼卡有限公司