专利名称：简便快速生物活性物质筛选方法
技术领域：
本发明属于生命科学领域，具体涉及一组能够简便、快速并且准确和较高 通量的通用筛选生物活性物质的活性大小和量的多少的方法。
背景技术：
自从20世纪初发现青霉素并将其实现应用以来，生物工程和技术领域蓬 勃发展，到目前，人类已经开发出成千上万种的生物活性物质服务社会发展， 包括抗生素、维生素、氨基酸、有机酸、酶制剂、核酸类似物、激素等等诸多 物质，涉及到医药、食品、化工等等诸多领域。初期，这些物质都来自于自然 界，为人类所发现和利用，但是这些天然物质一般活性弱，产量低，并且不太 适合于直接使用，如某些抗生素具有很大的副作用等等。在技术发展的中期， 人类使用诸如"诱变"、"代谢控制"、"细胞融合"等方法提高这些物质的产量 和活性，甚至在一定程度上能够改造其特性，这些技术促成了现代生物工业的 建立。随着现代生物技术的发展，人们已经可以在实验室中通过诸如"定向进 化"等技术高效地改造天然物质的特性，甚至人为加速进化进程，创造出自然 界不存在的物质为我们所用。无论从自然界中发现天然生物活性物质还是人为 改造或创造生物活性物质，都需要对获得的天然样本文库或改造后文库进行筛 选，保留高活性和高产量的目的样品，淘汰无价值的非目的样品。但是在一般 情况下，文库内样品的数量相当庞大，因此，传统的逐一检测的筛选方法耗时、 耗力，工作量大，效率低，虽然曾在历史上发挥过重要作用，但现在已经不适 合于现在实际应用。近期，欧美等发达国家开发出全自动高通量筛选工作站， 应用了最先进的计算机技术和机器人技术，能够实现高效高通量筛选，但是此 类大型设备价格相当昂贵，即使在发达国家，也只有财力雄厚的大型实验室有 能力购置，难以在短期内推广应用。因此，使用现有的通用低成本仪器设备， 开发一种简便、快速并且准确和较高通量的通用筛选技术方法，具有重要的现 实意义。
发明内容
本发明的目的是设计一种简便、快速并且准确和较高通量地筛选生物活性 物质的活性大小和量的多少的方法，适合于抗生素、维生素、氨基酸、有机酸、 酶制剂、核酸类似物、激素等等诸多物质的筛选，这些生物活性物质可以是来 自于天然的动物细胞、植物细胞、微生物细胞，也可以是来自于基因工程技术 或其它技术改造的细胞或克隆，前提是该待筛选物质具有合适的检测模型。该 方法有以下三个实施阶段1. 培养阶段 (1) 固体培养
对于适合固体培养的生物，使用该方法。在待筛选物质的培养基中加入
1%-2%的琼脂(或其它适当浓度的适合凝固剂)，高温高压灭菌处理，对于不能 高温高压灭菌的培养基，按照其培养基特殊说明除菌后，加入灭菌的琼脂溶液， 琼脂溶液应冷却到4(TC左右再加入，加入量应控制其加入后琼脂终浓度为 1%-2%。将含琼脂的培养基在无菌条件下倒在具有水平底部的皿中，皿和皿盖 必须事先灭菌，由于皿的底部体积可以测量得到，因此，控制倒入的琼脂培养 基的体积，就可以控制形成的固体培养基平板的厚度。使用灭菌打孔器制备完 全一样的小琼脂块，用灭菌镊子将其转移至灭菌培养皿中。使用灭菌牙签，将 待筛选的文库中的样品转移接种到小琼脂块上培养，培养条件视待筛选物质的 特性而定。由于小琼脂块的体积和形状完全一致，因此可以保证每个样品所获 得的营养一致，在培养条件一致的情况下，所获得数据具有可靠的可比性。 (2 ) 液体培养
对于适合液体培养的生物，使用该方法。使用多孔细胞培养板，如96孔 板，如果是一次性已灭菌板，无需灭菌，若重复使用，可以使用放射性元素灭 菌，在对无菌要求不是非常严格的情况下，可以使用酒精等消毒物质浸泡、紫 外线照射等等简便方式灭菌。使用移液装置(如多道移液器、连续进样器等等) 将事先除菌的培养液加入，加入量视培养情况而定。使用灭菌牙签，将待筛选 的文库中的样品转移接种到培养液中培养，培养条件视待筛选物质的特性而 定。如果样品需要通气培养，则事先对培养板板盖做如下改进使用钻子在板 盖上打孔，然后在板盖外侧覆盖上一层通气过滤除菌层(可以使用八层纱布、 海绵或其它功能相当物质)。
U) 鉴定板检测
将能与待测活性物质反应并能被检测的物质以凝胶状固态的形式(如将检 测物质加入1°/。-2%的琼脂溶液中，铺板，冷却凝固后即成为固态)铺于透明水
平鉴定平板上。如果待测物质以固体琼脂块的方式培养获得,则在无菌条件下 将培养后的小琼脂块排列在鉴定板上；如果待测物质以液体培养的方式获得， 则使用培养板复制器取微量的培养液，转移到鉴定板上。待测物质与检测物质 反应之后， 一般能够在待测物质周围形成透明圈、变色圏等等发生颜色改变的 区域。使用扫描仪将鉴定板扫描成电子图片，使用计算机图像处理软件识别并 区分背景色和颜色改变区域，从而可测量颜色改变区域的尺寸大小和颜色，将 获得的数值输入数据统计处理软件，进行统计分析。 一般情况下，区域所占面 积越大，待测物质活性和含量越高，而颜色变化与活性及含量的关系则要根据实际情况判断处理。 (2 ) 酶标仪检测
对于液体培养的物质，将能与待测物质发生颜色反应的检测物质加入到培 养液中，混勻反应之后，使用酶标仪测定其在某一波长处的吸光度。
3. 保存阶段
将选定的目的菌株转移接种到菌种斜面或者制备菌种冻存管。
具体实施例方式
实施例1
(1 ) 将经过紫外线辐射诱变处理的胞外脂肪酶产生细菌GZ分离于固体培 养基平板(培养基为传统的牛肉膏蛋白胨培养基)上，37'C恒温培养48个小 时。
(2) 在水平底部面积为50平方厘米的灭菌皿中，倒入体积为25立方厘米 的灭菌培养基A (%):麸皮7,豆饼粉3, (NH4)2S04 0.25, pH7. 0，琼脂2。 将皿置于水平台面上，待培养基凝固以后，使用直径为0.5厘米的灭菌打孔器 将培养基平板制备成小琼脂块，再用灭菌镊子将小琼脂块转移到灭菌培养皿 中，如果没有立即使用，应置于低温环境中保存。
(3) 将培养好的细菌GZ平板取出，在无菌条件下，使用灭菌牙签将单个 菌落分别转移接种到步骤(2)中所制备的小琼脂块上，将小琼脂块置于37'C 恒温培养48个小时。
(4) 在透明的水平的底部面积为50平方厘米的灭菌皿中，倒入体积为25 立方厘米的已经加热熔解的鉴定凝胶B制备鉴定平板。鉴定凝胶B配方橄榄 油乳化液5%,琼脂2%，使用蒸馏水补足体积。将皿置于水平台面上，待鉴定 凝胶B凝固以后，将步骤O)中培养好的小琼脂块在无菌条件下转移到鉴定 平板上，整齐排列，鉴定平板所用的皿和皿盖都要事先灭菌。将带有小琼脂块 的鉴定平板放置于48'C培养24个小时。
(5) 将鉴定平板取出，由于细菌GZ分泌的脂肪酶水解了鉴定平板上的橄 榄油乳化液，因此在小琼脂块周围产生了透明圈，未被脂肪酶作用的区域为乳 白色。用扫描仪对平板进行扫描，获得图像。
(6) 使用photoshop软件的"色彩范围"选择功能选定图像上的水解圈区 域，使用"度量工具"测定水解圈尺寸大小，在"信息"栏读取尺寸信息。将 各个透明圈的尺寸信息导入Excel软件，进行统计分析，选取目的菌株。
(7) 将选中的小琼脂块上的菌株接种到牛肉膏蛋白胨培养基斜面上保存。
实施例2U)将经过紫外线辐射诱变处理的胞外脂肪酶产生细菌GZ分离于固体培养 基平板(培养基为传统的牛肉膏蛋白胨培养基)上，37°C恒温培养48个小时。
(2) 在一次性已灭菌的96孔细胞培养板的每个孔中加入200|iL的灭菌培 养基CU):麸皮7,豆饼粉3， (NH4)2SO40. 25， PH7， 0。如果重复使用96孔 板，可以使用钴60灭菌，或者将96孔板清洗干净，使用75%酒精浸泡24个 小时，再置于紫外线下照射l小时。加入培养基可以使用多道移液器或者连续 进样器等装置。
(3) 使用灭菌牙签将步骤(1)中培养得到的各个细菌菌落接种于96孔板 上每个孔内的培养基中，盖上板盖，置于恒温摇床之上，以220rpm的转速， 37'C恒温培养48个小时。
(4) 制备例1(4)中的鉴定平板，使用培养板复制器取微量的步骤(3)中 的培养液，点加于鉴定平板之上，将鉴定平板放置于48'C培养24小时。
(5) 同例一(5)(6)
(6) 将选中的菌株从孔中转移接种到牛肉膏蛋白胨培养基斜面上保存。 实施例3
(1) 同例2(1)(2)(3)
(2 ) 使用多道移液器或者连续进样器等设备向96孔板的每个孔中加入
10|iL的橄榄油乳化液，混匀，48C培养24小时后加入灿烂绿鉴定液(终浓 度为0.004%)。混匀后置于室温静置5分钟。
(3) 将96孔板放入酶标仪，测定640nm处的吸光度。
(4) 将测得的数据导入Excel软件进行统计分析处理，选择目的菌株。 (5 ) 将选中的菌株从孔中转移接种到牛肉膏蛋白胨培养基斜面上保存。
实施例4
(1) 将细胞培养板的板盖使用记号笔在对应于孔洞处做记号，使用电 动钻头打孔，打孔直径与培养板的孔洞直径相当为宜，在皿盖外表面覆盖上八 层纱布，灭菌处理。灭菌最好使用放射性物质灭菌法(如钴60法)。
(2) 同实施例2或者实施例3。
权利要求
1.一种通过制备无菌培养基小琼脂块，培养待筛选样品的固体发酵方法。其特征在于制备体积和形状完全一样的无菌培养基小琼脂块，将样品接种于其上培养，可保证每个样品获得的营养一致。
2. —种培养好氧样品用的对培养板板盖进行改造的方法。其特征在于使 用钻子在板盖上打孔，然后在板盖外侧覆盖上一层通气过滤除菌层。
3. —种包括培养和检测的筛选方法，其具体步骤包括a. 培养阶段(1) 固体培养适用于适合固体培养的生物。其特征在于在适合于待筛选物质的培养基 中加入适当浓度的适合凝固剂。将培养基在无菌条件下倒在具有水平底部的皿 中，由于皿的底部体积可以测量得到，因此，控制倒入的培养基的体积，就可 以控制形成的固体培养基平板的厚度。使用灭菌打孔器制备完全一样的小琼脂 块，用灭菌镊子将其转移至灭菌培养皿中。使用灭菌牙签，将待筛选的文库中 的样品转移接种到小琼脂块上培养，培养条件视待筛选物质的特性而定。 (2 ) 液体培养适用于适合液体培养的生物。其特征在于使用多孔细胞培养板，用移液 装置将事先除菌的培养液加入，加入量视培养情况而定。使用灭菌牙签，将待 筛选的文库中的样品转移接种到培养液中培养，培养条件视待筛选物质的特性 而定。如果样品需要通气培养，则事先对培养板板盖按权利要求2所述的方法 进行改进。b. 检测阶段(1) 鉴定板检测其特征在于将能与待测活性物质反应并能被检测的物质以凝胶状固态的 形式铺于透明水平鉴定平板上。如果待测物质以固体琼脂块的方式培养获得， 则在无菌条件下将培养后的小琼脂块排列在鉴定板上；如果待测物质以液体培 养的方式获得，则使用培养板复制器取微量的培养液，转移到鉴定板上。待测 物质与检测物质反应之后， 一般能够在待测物质周围形成透明圈、变色圈等等 发生颜色改变的区域。使用扫描仪将鉴定板扫描成电子图片，使用计算机图像 处理软件识别并区分背景色和颜色改变区域，从而可测量颜色改变区域的尺寸 大小和颜色，将获得的数值输入数据统计处理软件，进行统计分析。(2 ) 酶标仪检测其特征在于对于液体培养的物质，将能与待测物质发生颜色反应的检测物质加入到培养液中，混匀反应之后，使用酶标仪测定其在某一波长处的吸光 度。C.保存阶段其特征在于将选定的目的菌株转移接种到菌种斜面或者制备菌种冻存管。
全文摘要
本发明涉及一组能够准确和较高通量的通用简便快速生物活性物质筛选方法。该方法属于生命科学领域。生物活性物质样品文库的筛选需要保留高活性和高产量的目的样品，淘汰无价值的非目的样品。但是在一般情况下，文库内样品的数量相当庞大，因此，传统的逐一检测的筛选方法耗时、耗力，工作量大，效率低。而全自动高通量筛选工作站价格昂贵，无法普及。本发明采用常规的仪器设备，设计出一种包括培养和检测的全套筛选方法，适用于大多数样品和情况下的筛选。
文档编号C12N1/00GK101307292SQ20071000981
公开日2008年11月19日 申请日期2007年11月15日 优先权日2007年11月15日
发明者峻 林 申请人:峻 林