专利名称：一种乳糖诱导型表达载体及其转化的粘质沙雷氏菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种乳糖诱导型表达载体，其转化的粘质沙雷氏菌及应用。
技术背景2,3-丁二醇是一种重要的化工原料，用于制备树脂、化妆品、油墨、香料、炸药及 医药中间体，广泛用于化工、食品、燃料以及航空航天等多个领域。例如，2,3-丁二醇 可用于白酒工业中作为风味添加剂及用来制备香料3 —羟基一2—丁酮。目前国内2,3-丁二醇市场价为10万元/吨，而内消旋2，3-丁二醇的价格是该价格的两倍左右。由于 化学方法合成2，3-丁二醇较为困难，至今尚未实现工业化生产，因此利用生物发酵方法 生产2,3-丁二醇是未来的发展方向。生物发酵方法生产2，3-丁二醇，涉及许多技术环节，包括转化过程中菌种的选择及 其改造、发酵底物的选择、发酵条件及产量、产物的分离提纯方法等。正确的选择技术 路线，改进工艺方法，能够提高产率，降低生产成本，解决日益严重的能源危机和环境 污染等问题。粘质沙雷氏菌(Sen"flria mflrc^ce似)能产生多种具工业应用潜力的物质，如壳貭酶、 蛋白酶、脂酶、核酸酶、抗生素、表面活性剂等，也是丙酮酸、琥珀酸、内消旋2，3-丁 二醇等重要化工原料的有潜力的生产菌种。粘质沙雷氏菌可利用碳源广，如单糖、蔗糖、甘油、纤维二糖等；而且由于粘质沙 雷氏菌是兼性厌氧菌，在厌氧条件下，作为发酵工业菌株具有节能优势。但是由于沙雷 氏菌遗传特性的限制，单纯优化发酵条件难以大幅度提高代谢产物产率。随着有机体越来越多的生物合成途径被人们所认识， 一些微生物基因组全序列的测 定及多基因之间的协同作用和代谢网络的刚柔兼性研究、代谢工程和生物信息学研究的 兴起，基因、宿主有机体、载体系统和分子生物学工具的发展，通过DNA重组技术合 理设计细胞代谢途径及遗传修饰，改良菌株，不仅可以提高细胞己有的化学物质产量或 产生宿主细胞本身不能合成的新物质，而且可以扩展细胞的底物使用范围，形成降解毒 性物质新的催化活性，提高一些有重要经济价值的初级代谢产物和次生代谢产物。如何 通过DNA重组技术改造粘质沙雷氏菌，提高用粘质沙雷氏菌发酵生产2,3-丁二醇的产率，是本领域迫切需要解决的问题。 发明内容本发明的目的之一是提供一种乳糖诱导型表达载体，可用于转化粘质沙雷氏菌。本发明的另一目的是提供一种基因重组技术改造的粘质沙雷氏菌，该转化菌在野生型粘 质沙雷氏菌中导入外源内消旋-2,3-丁二醇脱氢酶(meso-2，3-BDH)基因，用于改变内消旋 -2,3-丁二醇的代谢途径。本发明的再一目的是提供一种生产内消旋-2，3-丁二醇的方法，以克服现有技术中内 消旋-2,3-丁二醇难于大规模生产的问题。本发明的技术构思是这样的2,3-丁二醇是微生物的次生代谢物，其代谢途径中，内消旋-2，3-丁二醇脱氢酶 (meso-2，3-BDH)是由联乙醯(2， 3-丁二酮)合成乙偶姻(3-羟基-2-丁酮)的关键酶，乙 偶姻是合成内消旋2，3-丁二醇的前体。因此，在粘质沙雷氏菌中过量表达该酶在理论上 可以直接提高乙偶姻和间接提高内消旋-2，3-丁二醇的产量。外源基因在宿主菌中的表达可以分为诱导型表达和组成型表达。很多外源基因都是 在可操控的诱导启动子的作用下进行表达的，未诱导的时候该基因不表达或者极少量表 达，需要时则可改变条件(加入某种化学物质、改变温度等)诱导该基因的高效表达， 这样避免了其对宿主生长发育的不利影响，又可高效利用该基因表达的酶。本发明的第一方面，提供了一种乳糖诱导型表达载体，该载体以pUC18/19为基础 质粒，可操作的插入含有乳糖操纵子阻遏蛋白编码基因的表达盒。在一个优选的方案中，含有乳糖操纵子阻遏蛋白编码基因的表达盒插入到pUC18/19的 I位点(AATAATT)，含有乳糖操纵子阻遏蛋白编码基因的表达盒为以pET28aW为模 板，用上游引物 (5'-ACACCATCGAATGGCGCAA-3，) 和下游引物 (5'-TCACTGCCCGCTTTCCAGT-3')组成的引物对扩增获得的基因片段。本发明具体公开的一种乳糖诱导型表达载体命名为pLHZH。它是双链环状DNA， 长度为3.8kb。该载体含有编码lacl阻遏蛋白的laciq基因，氨节青霉素抗性基因(Amp『)， oriC01El复制起点，lac启动子，lac操纵子，lac操纵子位于多克隆位点之前。本发明公开的乳糖诱导型表达载体pLHZH，用如下方法制备以质粒表达载体pET28aW为模板，用上游引物(5'-ACACCATCGAATGGCGCAA-3') 和下游引物(5，-TCACTGCCCGCTTTCCAGT-3，)组成的引物对和高保真p/w polymerase进行PCR扩增，获得包含laciq基因平末端DNA片段，序列见序列 表；将克隆载体pUC18/19用限制性核酸内切酶S印I进行平末端酶切，然后用T4 DNA 连接酶将平末端laciq基因片段与内切酶消化过的pUC18/19进行连接，得到诱导型表达载体。本发明的第二方面，还提供了经基因重组技术改造的粘质沙雷氏菌(&rmria mwr"ce"力，通过内消旋-2,3-丁二醇脱氢酶(meso-2,3-BDH)基因转化野生型粘质沙雷氏 菌得到，可高水平表达内消旋-2,3-丁二醇脱氢酶。在一个优选的方案中，内消旋-2，3-丁二醇脱氢酶(meso-2，3-BDH)基因插入到乳糖诱 导型载体pLHZH，用于转化粘质沙雷氏菌。重组表达载体pLHZH-BDH载体是双链环 状DNA，长度为4.6kb， meso-2,3-BDH编码基因插入多克隆位点AwiH I和So/1之间， 物理图谱如图2所示。在一个优选的方案中，编码meso-2，3-BDH的基因是以克雷伯氏菌(幻e&sie/Zfl ; "eM附om'"e) 基 因 组 DNA 为 模 板， 以 弓l 物 3: 5，-CGCgQM￡￡ATGAAAAAAGTCGCACTTGTTACCG-3， 和 弓| 物 4: 5'-ACGCOie0^eTTAGTTAAATACCATCCCGCCGTC-3'为引物对，进行PCR扩增得到 的DNA片段，序列见序列表。在一个优选的方案中，粘质沙雷氏菌优选6"e/rafj'a /rarce"朋s B17。本发明的第三方面，还提供了一种大规模生产内消旋-2，3-丁二醇的方法，通过发酵 培养meso-2,3-BDH基因转化的粘质沙雷氏菌生产内消旋-2,3-丁二醇。在一个优选的方案中，可用乳糖作为诱导剂诱导内消旋-2，3-丁二醇脱氢酵的表达， 提高内消旋-2，3-丁二醇的产率。本发明以克隆载体pUC18/19为基础质粒，通过在适当位点插入乳糖操纵子的lac" 调节基因，将其改造成诱导表达载体。在本发明的实施例中，该载体可在宿主菌(粘质 沙雷氏菌&/rfl//fl(B17 )中诱导表达内消旋-2,3- 丁 二醇脱氢酶 (meso-2，3-BDH)。不仅常用的诱导剂异丙基硫代-卩-D-半乳糖苷(IPTG)可实现高水平诱导表达，而且用廉价的乳糖替代IPTG作为诱导剂也可以实现高水平表达。本发明公开的 诱导表达载体不仅简便易得，而且在在大规模工业发酵中具有广泛的实用价值。另一方面，本发明提供了一种利用基因重组技术改造的粘质沙雷氏菌，通过导入外 源性内消旋-2，3-丁二醇脱氢断meso-2，3-BDH)基因，该菌株高水平表达内消旋-2，3-丁二 醇脱氢酶。内消旋-2,3-丁二醇脱氢酶是内消旋-2,3-丁二醇代谢途径中的关键酶，该酶表 达量的提高，直接提高了宿主菌次生代谢物内消旋-2,3-丁二醇的产生和积累。其优势体 现在(1) 克服了沙雷氏菌遗传特性的限制，提高了内消旋-2,3-丁二醇的产生和积累；(2) 而且对宿主菌的生长没有明显不良影响，所使用的发酵培养基、发酵条件与 野生型宿主菌相同；(3) 可利用廉价乳糖方便的进行诱导诱导表达。因而，本发明改造的粘质沙雷氏菌用于大规模发酵生产内消旋-2，3-丁二醇，具有 巨大的应用价值。
图1为诱导型质粒表达载体pLHZH的物理图谱。 图2为重组质粒pLHZH-Bdh的物理图谱。 图3为重组质粒pLHZH-Bdh双酶切鉴定的琼脂糖电泳图。 图4为基因工程菌诱导表达后的全菌体SDS-PAGE电泳图。 泳道1为标准蛋白分子量(分别为97.2，66.4，44.3，29kD)，泳道2、3为转化的Se/rflrif/ /mwce5re"s B17/pLHZH-Bdh，泳道4、 5为空白的Se/ra"or marrceycem1 B17。
具体实施方式
本发明使用的縮写中，iaciq指乳糖操纵子阻遏蛋白编码基因(或称为调节基因)，meso-2，3-BDH指内消旋-2，3-丁二醇脱氢酶，pLHZH指laciq基因可操作的插入pUC18/19 质粒sspl限制性内切酶位点得到的乳糖诱导性表达质粒，pLHZH-BDH指meso-2，3-BDH 基因可操作的插入pLHZH质粒多克隆位点得到的表达质粒。诱导表达本发明构建的pLHZH-BDH表达载体，带有编码乳糖操纵子阻遏蛋白的 基因(lacl"和编码内消旋-2，3-丁二醉脱氢酶的基因(meso-2，3-BDH)。转化宿主菌粘质沙雷氏菌后，可组成型表达的乳糖操纵子阻遏蛋白。在缺乏乳糖的环境中，阻遏蛋白 与控制内消旋-2，3-丁二醇脱氮酶基因表达的操纵基因结合，阻止了内消旋-2，3-丁二醇脱 氢酶的表达；培养基中加入适当浓度的乳糖或异丙基硫代-P-D-半乳糖苷(IPTG)等乳 糖类似物后，乳糖与阻遏蛋白结合，引起阻遏蛋白构象改变，脱离控制内消旋-2，3-丁二 醇脱氢酶的基因表达的操纵基因，使得内消旋-2,3-丁二醇脱氢酶得以表达。本发明所说的"可操作的连接"指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够 影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果启动子控制序列的转录，那么它 是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能翻译的位置时，那么它是可操 作地连于编码序列。本发明用于合成乳糖操纵子阻遏蛋白的基因和内消旋-2,3-丁二醇脱氛酶的基因的 PCR引物由上海生物工程有限公司合成。质粒pUC18/19购于上海硕盟生物科技有限公 司，质粒pET32a(+)购于Invitrogen公司。wwcescens B17来自上海市工业微生 物研究所，克雷伯氏菌(《&^//0戸e謂om'ae)购于中国农业微生物菌种保藏中心(ACCC 10082)，所用酶如无特别说明均为TaKaRa公司产品。下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，下面结合实施例，对本发明做 进一步地说明，其目的仅在于更好的理解本发明而绝非限制本发明的保护范围，本领域 技术人员可以根据本发明作出各种改变和变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本 发明的权利要求所定义的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常 规条件，例如Sambrook等人，《分子克隆实验室手册》(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1、诱导型表达载体pLHZH的构建以表达质粒pET28a(+)(Kanf, iaciq，购自Invi加gen)为模板，以引物1和引物2为引 物对进行PCR扩增。其中，引物1: 5，-ACACCATCGAATGGCGCAA-3，；引物2: 5，-TCACTGCCCGCTTTCCAGT-3，。在一灭菌的0.2mL PCR薄壁管中，依次加入20jiL 无菌水、5pL的10xPCR缓冲液、lnL的dNTP (lOmM， TaKaRa)、 lpL的引物1 (终 浓度50pmol)、 lpL的引物2 (终浓度50pmol)、 0.5^L的质粒pET28a(+)溶液(浓度 50ng/pL)、 0.5^L的p/w DNA聚合酶(5U/pL， TaKaRa)，用无菌水补足至总体积50pL, 将PCR管置于PCR循环仪中。在PCR反应中，PCR反应的温度变化过程为先升温至94。C，保持5分钟，接着按以下的温度变化程序循环29次升温至94。C，保持30 秒，降温至56'C，保持30秒，升温至72。C，保持2分钟；最后于72。C保持10分钟， 结束扩增反应，获得平末端laciq基因片段。将pUC18质粒用限制性内切酶&pI酶切， 用T4 DNA连接酶将lacr"基因片段和线性pUC18质粒连接成为环状质粒。将连接产物 用CaCl2法转化大肠杆菌DH5a(Invitrogen)感受态细胞，在含有100ng/mL氨苄青霉素 的LB固体培养基上培养16hr后，挑取若千个菌落于液体LB培养基中培养过夜，收集 菌体进行菌落PCR鉴定，阳性克隆再提取质粒进行二次PCR鉴定。经过1.0%琼脂糖凝 胶电泳检测，证明所得质粒为携带lad阻遏蛋白的质粒载体pLHZH (其物理图谱如图1 所示)。实施例2、 meso-2，3-BDH基因的克隆以克雷伯氏菌(尺/efc/e/to ; "ewwo附'ae)基因组DNA为模板，以引物3和引物4为引 物 对 进 行 PCR 扩 增。 其 中， 引 物 3: 5'-CGCGGATCCATGAAAAAAGTCGCACTTGTTACCG-3，(带下划线的碱基为5a加H I 识别位点)；引物4: 5，-ACGCGTCGACTTAGTTAAATACCATCCCGCCGTC-3，(带下划线 的碱基为S"/1识别位点)。在一灭菌的0.2mL PCR薄壁管中，依次加入5pL无菌水、2.5pL 的10xPCR缓冲液、lpL的dNTP(10mM， TaKaRa)、 ljtL的引物1 (终浓度50pmo1)、 lpL 的引物2 (终浓度50pmol)、0.5pL的基因组DNA溶液(浓度50ng^L)、0.5pL的pfo DNA 聚合酶(5U/pL， Qiagen),用无菌水补足至总体积25pL，将PCR管置于PCR循环仪中。 在PCR反应中，PCR反应的温度变化过程为先升温至94'C，保持5分钟，接着按以 下的温度变化程序循环29次升温至94'C，保持30秒，降温至58'C，保持30秒，升 温至72'C，保持1.5分钟；最后于72'C保持10分钟，结束扩增反应。经PCR扩增，得 到带有BamH I和1酶切位点的meso-2，3-BDH基因，并将得到的meso-2，3-BDH基因 用5a附H I和1进行双酶切，并与同样用BawH I和&/I双酶切的表达质粒pLHZH 用T4 DNA连接酶进行连接，将连接产物用CaCl2法转化大肠杆菌DH5a (Invitrogen)感 受态细胞，在含有10(^g/mL氨苄青霉素的LB固体培养基上培养16hr后，挑取若干个 菌落于液体LB培养基中培养过夜，收集菌体并提取质粒，经B"/wH I和SWI双酶切后， 用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测(图3)，得到3.8kb和0.7kb的条带，表明得到带有 meso-2,3-BDH基因的重组质粒pLHZH-Bdh(其物理图谱如图2所示)。实施例3、 meso-2,3-BDH基因的表达将重组质粒pLHZH-Bdh用改良氯化钙法转化宿主细胞Se/r如a /m^c^ce;w B17，得 到基因工程菌Se/r""fl附a/r^cew B17/pLHZH-Bdh。将基因工程菌接种于添加适当抗生 素的LB液体培养基中(LB培养基组成为酵母粉0.5%、胰蛋白胨l%、NaCl l%，pH7.0)， 30'C摇床培养过夜；再以5%的接种量转接到装有30mL LB培养基的250 mL摇瓶中， 30。C摇床培养5小时，加入0.5mL 120%乳糖溶液(终浓度2%),然后继续培养6小时后， 离心收集菌体。将收集的菌体进行全菌SDS-PAGE电泳，结果如图4所示。图中泳道l 为标准蛋白分子量(分别为97.2,66.4,44.3，29kD)，泳道2、3为转化的Swfl^加arcercew B17/pLHZH-Bdh，泳道4、 5为空白的Serra"amarcesce附B17。从图4可以看出，转化 菌在29kD分子量标准条带附近有一条增加的表达条带，分子量约为31kD，与 meso-2，3-BDH预期的分子量一致，说明meso-2，3-BDH在基因工程转化菌中成功表达。序列表<110〉华东理工大学<120> —种乳糖诱导性表达载体及其转化的粘质沙雷氏菌<130><160> 2< 170> Patentln version 3.1<210> 1<211> 1160<212> DNA<213> 大肠杆菌(Esr/ier!'c/H'fl co//)<220> <221> <222> <223><400> 1acaccatcgaatggcgcaaaacctttcgcggtatggcatgatagcgcccggaagagagtc60aattcagggtggtgaatgtgaaaccagtaacgttatacgatgtcgcagagtatgccggtg120tctcttatcagaccgtttcccgcgtggtgaaxcaggccagccacgtttctgcgaaaacgc180gggaeiaasgtggaagcggcgatggcggagctgaattacattcccaaccgcgtggcacaac240aactggcgggcaaacagtcgttgctgattggcgttgccacctccagtctggccctgcacg300cgccgtcgcaaattgtcgcggcgattaaatctcgcgccgatcaactgggtgccagcgtgg360tggtgtcgatggtagaacgaagcggcgtcgaagcctgtaasgcggcggtgcacaatcttc420tcgcgcaacgCgtC3gtgggctgatcattaactatccgctggatgaccagg"gccattg480ctgtggaagctgcctgcactaatgttccggcgttatttcttgatgtctctgaccagacac540ccatcaacagtattattttctcccatgaagacggtacgcgactgggcgtggagcatctgg600tcgcattgggtcaccagcaaatcgcgctgtUgcgggcccattaagttctgtctcggcgc660gtctgcgtctggctggctggcataaatatctcactcgcaatcaaattcagCCg"3gCgg720aacgggaaggcgactggagtgccatgtccggttttcwcaaaccatgcaaatgctgaatg780agggcatcgttcccactgcgatgctggUgccaacgatcagatggcgctgggcgcaatgc840gcgccattaccgagtccgggctgcgcgttggtgcgg"atctcggtagtgggatacgacg900ataccgaagacagctcatgttatatcccgcCgttB3CC8Ccatcaaacaggattttcgcc960tgCtggggCJlaaccagcgtggaccgcttgctgcaactctctcagggccjiggcggtgaagg1020gcaatcagctgttgcccgtctC3Ctggtg3caccctggcgcccaatacgc1080aaaccgcctc tccccgcgcg ttggccgatt cattaatgca gctggcacga caggtttccc 1140 gactggaaag cgggcagtga 1160<210> 2<211> 771<212> DNA<213> 克雷伯氏菌(尺/efe/e/Za / "ewwomae) <220><221>阅读框<222> (1)-(771) <223><400> 2"gaaaaaagtcgcacttgtUccggcgccggccaggggattggtaaagctatcgccctt60cgtctggtgaaggatggatttgccgtggccattgccgattataacgacgcCBCcgccMa120gcggtcgcctcggaaatcaaCC3ggCCggCggacacgccgtggcggtgaa agtggatgtc180tccgaccgcgatcaggtatttgccgccgttgeiacaggcgcgcaaaacgctgggcggcttc240gacgtcatcgtcaataacgccggtgtggcaccgtctacgccgatcgagtccattaccccg300gagattgtcgacaaagtctacaacatcaacgtcaaaggggtgatctggggtattcaggcg360gcggtcgaggccttUagaaagaggggcacggcggg磁atcatcaacgcctgttcccag420gccggccacgtcggcaacccggagctggcggtgtatagctccagtaaattcgcggtacgc480ggcttaacccagaccgccgctcgcgacctcgcgccgctgg gcatcacggtcsacggctac540tgcccggggattgtcaaaacgccaatgtgggccgaaattgaccgccaggtgtccgaagcc600gccggtaaaccgctgggctacggtaccgccgagttcgcca aacgcatcaictctcggtcgt660ctgtccgagccggaagatgtcgccgcctgcgtctcctatcttgccagcccggattctgat720tacatgaccggtcagtcgttgctgatcgacggcgggatggtatttaacta77权利要求
1. 一种乳糖诱导表达载体，其特征在于，该载体以含有lac启动子和操纵子的克隆质粒为出发载体，可操作的插入含有乳糖操纵子阻遏蛋白编码基因的表达盒。
2、 根据权利要求1所述的诱导型表达载体，其特征在于，出发载体为pUC18/19，含 有乳糖操纵子阻遏蛋白编码基因的表达盒可操作的插入pUC18/19质粒的5^/7 I位点。
3、 根据权利要求1所述的诱导型表达载体，其特征在于，其中所述的含有乳糖操 纵子阻遏蛋白编码基因的表达盒为-以pET28aW质粒为模板上游引物5' -ACACCATCGAATGGCGCAA-3，下游引物5' -TCACTGCCCGCTTTCCAGT-3'经PCR扩增所获得的片段。
4、 根据权利要求1 3中的任一项所述的诱导型表达载体，其特征在于，该载体称 为pLHZH，含有lac启动子和操纵子、编码lacl阻遏蛋白的lacr基因以及oriC0El复 制起点。
5、 一种基因重组技术改造的粘质沙雷氏菌，其特征在于，用内消旋-2,3-丁二醇脱 氢酶(meso-2， 3-BDH)基因转化粘质沙雷氏菌。
6、 根据权利要求5所述的改造的粘质沙雷氏菌，其特征在于，内消旋-2,3-丁二醇 脱氢酶(meso-2,3-BDH)基因可操作的插入诱导表达载体pLHZH，得到重组表达载体 pLHZH-BDH，再用重组表达载体pLHZH-BDH转化野生型粘质沙雷氏菌得到的转化菌。
7、 根据权利要求6所述的基因重组技术改造的粘质沙雷氏菌，其特征在于，所述 的meso-2，3-BDH基因来自克雷伯氏菌(X/efe/e/to/7"ew附om'ae)。
8、 根据权利要求6所述的基因重组技术改造的粘质沙雷氏菌，其特征在于，所述 的野生型粘质沙雷氏菌为5"em^'a mmrescms B17。
9、 一种生产内消旋-2,3-丁二醇的方法，其特征在于，用权利要求6 8中的任一项 所述的基因重组技术改造的粘质沙雷氏菌发酵生产内消旋-2, 3-丁二醇。
10、 根据权利要求10所述的方法，其特征在于，可用乳糖作为诱导剂发酵生产内消旋-2, 3-丁二醇c
全文摘要
本发明公开了一种乳糖诱导型表达载体，可用廉价的乳糖替代昂贵的异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)作为诱导剂，可广泛应用于外源基因的表达以及粘质沙雷氏菌代谢途径的改造，例如用于将内消旋-2，3-丁二醇脱氢酶(meso-2，3-BDH)基因导入粘质沙雷氏菌。本发明还公开了一种用基因重组技术改造的粘质沙雷氏菌，通过导入外源内消旋-2，3-丁二醇脱氢酶(meso-2，3-BDH)基因，改变菌中天然的内消旋-2，3-丁二醇的代谢途径。本发明提供的基因重组技术改造的粘质沙雷氏菌，以期高水平表达内消旋-2，3-丁二醇脱氢酶，提高内消旋-2，3-丁二醇在宿主菌中的产生和积累，提高粘质沙雷氏菌内消旋-2，3-丁二醇的产率。
文档编号C12P7/02GK101235383SQ20071003698
公开日2008年8月6日 申请日期2007年1月30日 优先权日2007年1月30日
发明者周文瑜, 学 曹, 虎 朱, 沈亚领, 魏东芝 申请人:华东理工大学