专利名称：：植物叶片各级脉和分蘖基部特异表达启动子及应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于基因工程和植物学领域，更具体的，本发明涉及一类组织特异表达启动子及其应用。
背景技术：
：作为单子叶植物研究的模式植物，水稻是一种重要的经济作物，其提供了世界上、特别是亚太地区大部分人口的食品和营养来源。在中国，水稻种植面积约占全国粮食作物面积的30%，产量接近粮食总产量的一半。同时，水稻具有生长周期较短，转化体系成熟，占地面积小等优势。认识水稻生长发育的分子基础，研究水稻基因的表达调控机制以提高水稻单产，改良其种植结构，是科学工作者长期以来研究的目标。水稻生长过程中有着单子叶植物特有的组织器官发育过程例如平行叶脉的发育过程，分蘖过程以及不定根的发生等等。通过对这些生长过程的研究，以及相关联的科学问题，既可以了解单子叶植物特有的生长过程，又可直接应用于农业生产。对基因在植物中表达模式的研究是探究基因功能的重要内容和提示。通过特定基因的启动子区与报告基因的融合，可以追踪到基因在植物体内的时间和空间的表达模式。基因的表达模式往往暗示所具有的生理功能，是基因研究的重要组成部分。例如，Oshoxl是水稻中一个Horaebox家族的转录因子，它在叶原形成层中表达，调控原形成层的命运，而通过增加生长素的运输特性可以促进原形成层细胞分化的命运(ScarpellaE.等，Development2002，127:3655-3669)。在船Z^基因在花中的特异表达等在揭示基因本身的功能的同时也能作为标记性指示对特异组织生长发育做深入界定和分析(ParenicovaL.等，PlantCell.2003，15:1538-1551)。在种子发育过程中胚和胚乳特异启动子，也往往参与了种子发育过程。从应用角度而言，一些特异性基因可作为标记基因，应用于特定生长过程的研究和特定组织或细胞类型的改造。在水稻中，人们已经发现了若干的标记基因，例如OsMZP在叶原基的特异性表达，可以用来标记前特化中的形成层细胞(ScarpellaE.等，Development2002，127:3655-3669)。基因可标记胚乳的盾片外层。水稻中的&5r/7基因，可标记根部的第二皮层细胞。利用/0C7用于标记胚表皮层(Ll)，6s/W^4示记胚发育的维管层(L3)。植物基因工程研究中需要使外源目的基因能在特定的组织中高效表达，分离植物中一些具有组织专一性、不同表达水平的启动子和有关的调控元件在基因工程研究中有广泛的用途。叶脉和分蘖部作为植物重要组成部分，在植物生长、发育或营养吸收等过程中起着无可替代的作用，因此分离植物叶脉和分蘖部特异表达的启动子对植物品质的改良有着重要的作用。
发明内容本发明的目的在于提供一类植物叶脉(叶不同级脉)或分蘖基部特异表达启动子。本发明的另一目的在于提供所述启动子的应用。在本发明的第一方面，提供一种在植物叶脉或分蘖基部特异表达的启动子，所述的启动子选自下组(1)具有SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、或SEQIDNO:3所示的核苷酸序列的启动子；(2)核苷酸序列在严格条件下能够与(1)限定的多核苷酸序列杂交且具有指导目的基因在植物叶脉或分蘖基部特异表达功能的启动子；(3)核苷酸序列与SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、或SEQIDNO:3有95%以上同源性且具有指导目的基因在植物叶脉或分蘖基部特异表达功能的启动子；或(4)核苷酸序列与SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、或SEQIDNO:3所示的核苷酸序列完全互补的启动子。在本发明的另一优选例中，所述的目的基因是结构基因。在本发明的另一优选例中，所述的目的基因可编码具有特定功能的蛋白。在本发明的另一优选例中，所述的目的基因是外源基因。在本发明的另一优选例中，所述的目的基因包括(但不限于)生长素合成和降解相关基因，生长素转运基因，细胞分裂分化相关基因，营养运输相关基因等。在本发明的另一优选例中，所述的目的基因位于所述植物叶脉(不同级叶脉)或分蘖基部特异表达启动子的下游，且与所述启动子区直接邻近的编码基因的序列。通常，所述启动子与目的基因的间隔小于1000bp(优选的，小于500bp;更优选的，小于100bp;最优选的，小于50bp)。在本发明的另一优选例中，所述的植物是单子叶植物。在本发明的另一优选例中，所述的植物包括(但不限于)禾本科植物、石蒜科植物、百合科植物、鸢尾科植物、或薯蓣科植物等。更优选的，所述的植物是禾本科植物。例如所述植物包括但不限于水稻、小麦、大麦、玉米、高粱等。在本发明的另一优选例中，具有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列的多核苷酸(或其具有相同功能的变异体)能够指导目的基因在植物分蘖基部特异表达;或具有SEQIDNO:2或SEQIDNO:3所示的核苷酸序列的多核苷酸(或其具有相同功能的变异体)能够指导目的基因在植物叶脉特异表达。更优选的，具有SEQIDNO:2所示的核苷酸序列的多核苷酸(或其具有相同功能的变异体)能够指导目的基因在植物叶脉的二级脉中表达；或具有SEQIDNO:3所示的核苷酸序列的多核苷酸(或其具有相同功能的变异体)能够指导目的基因在植物叶脉的中脉和一级脉中表达。在本发明的第二方面，提供一种载体，所述的载体含有所述的植物叶脉(叶不同级脉)或分蘖基部特异表达启动子，作为启动子元件。在本发明的另一优选例中，所述的载体还含有与所述的植物叶脉或分蘖基部特异表达启动子可操作地连接的目的基因。在本发明的第三方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，所述的细胞含有所述的载体；或其基因组中整合有外源的所述的植物叶脉或分蘖基部特异表达启动子。在本发明的第四方面，提供一种使目的基因在植物叶脉或分蘖基部特异表达的方法，所述的方法包括将构建物转化植物细胞，所述的构建物含有所述的植物叶脉或分蘖基部特异表达启动子以及与所述的启动子可操作地连接的目的基因；筛选出转入了所述构建物或染色体中整合有所述构建物的植物细胞；和将所述植物细胞再生成植株。在本发明的另一优选例中，所述的方法包括(a)提供携带表达载体的农杆菌，所述表达载体中含有构建物，所述的构建物含有所述的植物叶脉或分蘖基部特异表达启动子以及与所述的启动子可操作地连接的目的基因；(b)将植物细胞、组织或器官与步骤(a)中的农杆菌接触，从而使所述的构建物转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；(c)选择出转入了所述构建物的植物细胞、组织或器官；以及(d)将步骤(c)中的植物细胞、组织或器官再生成植物。在本发明的第五方面，提供所述的启动子的用途，用于指导目的基因在植物的叶脉或分蘖基部特异表达。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。图1显示了携带C^尸/W2-GUS融合基因的转基因植物的分蘖组织，可见特异表达的启动子GUS染色(蓝色)，图中以箭头表示发生染色的部分区域。图2显示了携带0^>/7V4-GUS融合基因的转基因植物的中脉和一级脉组织，可见特异表达的启动子GUS染色(蓝色)，图中以箭头表示发生染色的部分区域。图3A显示了携带Os尸/iV3-GUS融合基因的转基因植物的二级脉组织，可见特异表达的启动子GUS染色(蓝色)，图中以箭头表示发生染色的部分区域。图3B显示了携带OsP/iV3-GUS融合基因的转基因植物染色后的切片观察。图中以箭头表示染色的二级脉维管组织。图4显示了&尸/#启动子表达载体的构建方法，通过将pBI101上的多克隆位点以及GUS基因用EcoRI和HindIII酶切引入pCAMBIA1300中构建而成。具体实施方式本发明人经过广泛而深入的研究，首次发现一类能够指导目的基因在植物的叶不同级脉或分蘖基部特异性表达的启动子。更特别的，本发明人发现，OsPIN2启动子能够指导目的基因在植物分蘖基部表达；OsPIN3启动子或OsPIN4启动子能够指导目的基因在植物叶脉中表达(更优选的，OsPIN3启动子能够指导目的基因在植物的二级脉中表达；OsPIN4启动子能够指导目的基因在植物的中脉和一级脉中表达)。在此基础上完成了本发明。如本文所用，所述的"植物"主要是指单子叶植物，包括(但不限于)禾本科植物、石蒜科植物、百合科植物、鸢尾科植物、或薯蓣科植物等。更优选的，所述的植物是禾本科植物，包括但不限于水稻、小麦、大麦、玉米、高粱等。如本文所用，所述的"可操作地连接"是指两个或多个核酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。例如启动子区被置于相对于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的转录受到该启动子区域的引导，从而，启动子区域被"可操作地连接"到该核酸序列上。如本文所用，所述的"启动子"或"启动子区(域)"是指一种核酸序列，其通常存在于目的基因编码序列的上游(5'端)，能够引导核酸序列转录为mRNA。一般地，启动子或启动子区提供RNA聚合酶和正确起始转录所必需的其它因子的识别位点。在本文中，所述的启动子或启动子区包括启动子的变体，其通过插入或删除调控区域，进行随机或定点突变启动子等来获得。如本文所用，"组织特异性启动子"又称"器官特异性启动子"，在这类启动子调控下，基因往往只在某些特定的器官或组织部位表达，并表现出发育调节的特性。本发明中，所述的"组织特异性启动子"是植物叶脉(叶不同级脉)或分蘖基部特异表达启动子。通常，如果在某组织或器官中mRNA以比在其它组织或器官中高至少10倍，优选至少高100倍，更优选至少高1000倍水平被表达，则该启动子被认为是组织或器官特异性的。植物特异性启动子及其指导的基因表达本发明提供一种植物叶脉(叶不同级脉)或分蘖基部特异表达启动子，所述的启动子具有SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、或SEQIDNO:3所示的核苷酸序列的多核苷酸，各启动子的命名和来源如下具有SEQIDNO:1所示核苷酸序列的启动子0sPIN2启动子，来自于。s尸/T^基因(LOC一Os01g45550)的ATG上游；具有SEQIDNO:2所示核苷酸序列的启动子OsPIN3启动子，来自于6^P/A^基因(LOCJ)s01g51780)的ATG上游;具有SEQIDNO:3所示核苷酸序列的启动子OsPIN4启动子，来自于^尸/tW基因(LOC—Os01g69070)的ATG上游。此外，本发明还包括上述启动子的一些具有相同功能的变异体。包括核苷酸序列在严格条件下能够与SEQIDNO:1、SEQIDN0:2、或SEQIDN0:3所示的多核苷酸序列杂交且具有指导目的基因在植物叶不同级脉或分蘖基部特异表达功能的启动子；或核苷酸序列与SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、或SEQIDNO:3有95%以上同源性且具有指导目的基因在植物叶不同级脉或分蘖基部特异表达功能的启动子；或核苷酸序列与SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、或SEQIDNO:3所示的核苷酸序列完全互补的启动子。多核苷酸的杂交是本领域技术人员熟知的技术，特定的一对核酸的杂交特性指示它们的相似性或同一性。因此，本发明还涉及与SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、或SEQIDNO:3所示的核苷酸序列杂交且两个序列之间具有至少50%，较佳地至少70%，更佳地至少80%(例如85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%)相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，"严格条件"是指(l)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2XSSC，0.1%SDS，60°C;或(2)杂交时加有变性剂，如50%(v/v)甲酰胺，0.1%小牛血清/0.l%Ficoll,42。C等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90%以上，更好是95%以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸也具有指导目的基因在植物叶不同级脉或分蘖基部特异表达的功能。在本发明的实例中，本发明人发现，在所述的启动子的指导下，可以使P-葡萄糖苷酶(GUS)基因特异地在水稻的分蘖基部或叶脉中表达。因此可见，本发明的启动子是一种组织或器官特异性的启动子。所述的启动子对于定点地改良植物的品质是特别有用的。(3-葡萄糖苷酶(GUS)能催化裂解一系列的/3-葡萄糖苷，产生具有发色团或荧光的物质，可用分光光度计、荧光计或组织化学等方法对GUS活性进行定量和空间定位分析。在本
技术领域：
中，GUS基因已被广泛地用作转基因植物、细菌和真菌的报告基因，特别是其可被用于研究外源基因表达的具体细胞和组织部位。本发明的启动子是组织或器官特异性的，更特别的，对于Os尸/V2启动子而言，其是植物分蘖基部特异性的，其可指导目的基因在植物分蘖基部特异性表达；对于Os尸/A^启动子或C^尸/W启动子而言，其是植物叶脉特异性的，能够指导目的基因在植物叶脉中特异性表达。更优选的，C^Pi7V3启动子能够指导目的基因在植物的二级脉中表达；(^P/W启动子能够指导目的基因在植物的中脉和一级脉中表达。作为一种实施方式，所述的启动子在植物特定的组织中表达相关的结构基因。本发明的启动子可以被可操作地连接到目的基因上，该目的基因相对于启动子而言可以是外源(异源)的。所述的目的基因通常可以是任何核酸序列(如一种结构性核酸序列)，所述的目的基因优选编码具有特定功能的蛋白，例如某些在农业或植物改良上具有重要特性或功能的蛋白。合适的目的基因包括但不限于生长素合成和降解相关基因，生长素转运基因，细胞分裂分化相关基因，营养运输相关基因等。本发明的启动子还可以被可操作地连接到被改进的目的基因序列上，该目的基因相对于启动子是外源(异源)的。所述的目的基因可以被改进来产生各种期望的特性。例如，目的基因可以被改进来增加必需氨基酸的含量，提高氨基酸序列的翻译，改变翻译后的修饰(如磷酸化位点)，将翻译产物转运到细胞外，改善蛋白的稳定性，插入或删除细胞信号等。此外，启动子和目的基因可以设计成下调特定基因。这一般是通过将启动子连接到目的基因序列上来实现，该序列以反义反向被引导。本领域的普通技术人员熟悉这种反义技术。任何核酸序列可以以这种方式被调节。任何一种前述的启动子和目的基因序列可被包含在重组载体中。所述的重组载体一般包括(从5'到3'方向)引导目的基因转录的启动子，和目的基因。如果需要，所述的重组载体还可以包括3'转录终止子，3'多聚核苷酸化信号，其它非翻译核酸序列，转运和靶向核酸序列、抗性选择标记、增强子或操作子。用于制备重组载体的方法是本领域熟知的。术语"重组表达载体"指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要其能够在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都是可以被采用的。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含有本发明所述的启动子和/或目的基因序列的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如二氢叶酸还原酶、新霉素抗性、潮霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)等。重组载体中除了含有本发明的启动子，还可含有一种或多种其它启动子。所述的其它启动子例如是组织特异性的、组成型的或诱导型的。例如甘露氨酸合成酶的花椰菜花叶病毒19S和35S(CaMV19SCaMV35S)、增强的CaMV、烟草RB7等。作为本发明的优选方式，所述的重组载体是pCAMBIA1300。pCAMBIA1300是CAMBIA公司开发的可以同时用于大肠杆菌、农杆菌和植物转化的穿梭质粒载体，是一种可应用于植物活体转化的双元载体。通过改造，即利用pCAMBIA1300上的多克隆位点，将编码W^基因的序列连接入载体，再将目标基因的启动子区域构建到^/6"基因的前面，转化植株，启动子将激活GUS基因的表达，所述启动受到启动子区各顺式作用元件的调控，模拟了基因在体内被激活转录的状况。包含上述适当的启动子和目的基因的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞等。本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法、水稻幼胚转化法等。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得转基因的植物。本发明的组织特异性启动子在理论研究和农艺改良中具有重要的应用价值。这些启动子可以被应用于标记特定组织，引导特定的功能基因在特定的组织中表达，以及应用于特有组织的生长发育研究和针对性改良。由0sPIN2启动子、0sPIN3启动子、0sPIN4启动子分别引导GUS基因在不同的植物组织中表达可知，在植物中，0sPIN2(L0C—0s01g45550)、0sPIN3(L0C—0s01g51780)、0sPIN4(L0C—0s01g69070)这三个基因分别在蘖分生的基部、平行脉的中脉和一级脉、以及二级脉中特异的表达。本发明的主要优点在于揭示一类可指导目的基因在植物的叶不同级脉或分蘖基部特异表达启动子，所述的启动子对于定点地改良植物品质是特别有用的。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。实施例1tts尸/W启动子区域的PCR扩增利用NCBI中的Os尸Z/V2、Os尸/tV3、Os尸iT^4的cDNA序歹ij(GenBank登录号分别是AK063976、AP003288,AK066552),在水稻基因组数据库(TIGR)中通过BLAST(ProgramBLASTN)检索其所对应的基因组DNA序列(在水稻基因组数据库中^尸/vV2、fe尸/W3、Os尸77V4对应的TIGR网站的登录号分别是L0C—0s01g45550，L0C—0s01g51780，L0C—0s01g69070)。在Os尸7^2、&尸/yV3、fc尸H4基因组序列中ATG上游分别取1698bp，1657bp，1920bp包含启动子区的序列，设计引物(见表1)，通过ExTaqDNA聚合酶扩增出PCR产物，获得0sPIN2、0sPIN3、0sPIN4启动子片段。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>将前述PCR获得的各启动子片段克隆入TA载体(TAKARA)中，测序验证序列正确。实施例2Os尸i^启动子表达载体的构建分别利用引物自带的限制性内切酶位点HindlII/BamHI,SalI/BamHI，Pstl/Xba11，酶切前述制备的含有OsPIN2、OsPIN3、OsPIN4启动子片段的TA载体，回收DNA片段，将之克隆入经同样酶切的自身携带GUS基因的pCAMBIA1300+pBI101中，形成携带启动子和GUS融合序列的重组载体。其中，pCAMBIA1300+pBI101是将pBI101(购自CLONTECH)上的多克隆位点以及GUS基因用EcoRI和HindIII酶切引入pCAMBIA1300(购自pCAMBIA公司)构建而成，构建方法如图4所示。工作原理是利用插入的启动子去启动GUS在组织中的表达来反映该启动子对应基因的表达情况。实施例3水稻转基因株系的建立将实施例2构建的3个启动子表达载体转入农杆菌，通过农杆菌介导法感染水稻的幼胚，构建出转基因株系。具体实验方法及步骤如下1.菌种构建以常规的CaCl2处理法(参见《分子生物学实验技术》，郝福英等编著，北京大学出版社，北京，1998)制备根癌农杆菌EHA105(购自CAMBIA公司)感受态，通过电击转化法将前述构建的Os尸77V启动子表达载体转入农杆菌中，在含卡那霉素(Km)的LB培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，琼脂15g/L，卡那霉素50mg/L，用NaOH调pH至7.5)上，在28t:下培养2天。挑取单菌落，在含卡那霉素的YEP酵母培养基(蛋白胨10g/L，酵母浸膏10g/L，NaCl5g/L，卡那霉素50rag/L，pH7.0)中28。C培养约24小时至对数期。按线的量接种到相同的培养基中，28'C下培养24小时。将培养液于4。C、3000rpm下离心10min，取沉淀(菌体)，用等体积AAM-As培养基(AA培养基无机盐和氨基酸MS维他命，干酪素500mg/L，蔗糖68.5g/L，葡萄糖36g/L，乙酰丁香酮，pH5.2)悬浮，静置2小时。2.共培养外植体(幼胚)的准备取粳稻(中花ll)未成熟种子，经75%的乙醇漂洗lmin后用无菌水漂洗3遍，之后用0.1%升汞浸泡15min，再用无菌水漂洗3遍；然后取幼胚接种于ND2培养基(N6大量元素，N6微量元素和N6维他命，脯氨酸500rag/L，干酪素300mg/L，蔗糖30g/L，2,4-D2rag/L，琼脂8g/L，pH5.8)上，在25。C、黑暗条件下培养3天。3.转化外植体将经培养后的外植体浸入上述3.l所得菌体悬液，静置20min，用无菌滤纸吸干后转移到ND2-As培养基(ND2培养基加入乙酰丁香酮(30umol/L))上，25°C、黑暗条件下共培养3天。用无菌水将培养后的外植体洗涤5次以除去表面吸附的农杆菌，然后用含羧苄青霉素250rag/L和头孢霉素100mg/L的无菌水浸泡2小时。用无菌滤纸吸干后转移至ND2CH(ND2培养基加入水解酪蛋白500mg/L，2,4-二氯苯氧乙酸2rag/L)培养基，25。C下培养，筛选抗性愈伤，每2周继代一次。3.再生筛选得到的抗性愈伤转移到NN1B2H分化培养基(N6大量元素、N6微量元素、N6维他命，干酪素300rag/L，蔗糖30g/L、6-苄基腺嘌呤2rag/L，潮霉素50mg/L，琼脂10g/L，pH5.8)上，25。C下培养分化。分化出来的小苗转移到含50mg/L潮霉素的MS分化培养基(DUCHEFABIOCHEMIE公司)上，25。C下培养至约IOcm高，移至人工气候室培养至成熟。水稻在人工气候室中，每天于26'C下培养12小时；再于18"C下培养12小时。实施例4GUS活性的检测GUS缓冲液的配方如下:(pH7.0)lOOmM磷酸缓冲液，0.5mMK3[Fe(CN)6]，0.5mMK4[Fe(CN)6],100mMEDTA，1mM5-溴-4-氯-3-B引哚-b-D-葡糖苷酸。GUS活性检测取花序浸入GUS(lmg/ml)缓冲液中，抽真空半小时后在37"C过夜，室温酒精脱色。切片取染色脱色的叶片固定于FAA溶液(配方90ml70%乙醇，5ml甲醛，5ml醋酸)中，包埋入环氧树脂812中，6(TC聚合后切片厚度为3陶并观察。结果见图1-3。其中，图1显示了携带C^/W2-GUS融合基因的转基因植物的分蘖组织，可见特异表达的启动子GUS染色(蓝色)。图2显示了携带Os尸/iV4-GUS融合基因的转基因植物的中脉和一级脉组织，可见特异表达的启动子GUS染色(蓝色)。图3A显示了携带CWV7V3-GUS融合基因的转基因植物的二级脉组织，可见特异表达的启动子GUS染色(蓝色)。图3B显示了携带O^P/TV3-GUS融合基因的转基因植物染色后的切片观察。图中以箭头表示GUS染色的二级脉组织。实施例5应用实例利用所述的组织特异表达启动子，本发明人可以进行作物改良和一系列生物学问题的研究。为了更好地研究生长素对水稻叶脉发育的影响，本发明人利用所述的在叶脉中特异表达的启动子，在叶脉一级脉(0sPIN4启动子)和二级脉(0sPIN3启动子)部位特异表达生长素合成相关基因吲哚乙酸-赖氨酸合成酶基因(iaaL)或吲哚乙酰胺水解酶基因(iaaH)，来改变特异部位的生长素(IAA)活性，从而改变水稻组织的生长和发育。对于改良作物，利用所述的在分蘖基部特异表达的启动子(0sPIN2启动子)，在分蘖基部引导细胞分裂伸长相关基因的特异表达，可以改良作物的分蘖性状。所述的0sPIN2、0sPIN3、0sPIN4启动子在水稻以外的单子叶植物中也具有指导目的基因组织特异性表达的功能。此外，本发明人还分别采用Os尸i^2、6^尸/yV3、Os尸i^4基因组序列中ATG上游1705bp、1654bp和1923bp，同前述实施例1-4的方法将这些基因片段与GUS相融合，插入到表达载体中，转化入宿主细胞，通过农杆菌法制备转基因水稻。GUS活性检测的结果发现，Os尸/yV2、Os尸/;V3、fc/YiV4基因组序列中ATG上游1701bp、1661bp和1923bp的多核苷酸也具有指导GUS基因在分蘖组织、二级脉、中脉和一级脉中表达的功能。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。序列表<110>中国科学院上海生命科学研究院<120〉植物叶片各级脉和分蘖基部特异表达启动子及应用<130〉068090<160〉9<170>Patentlnversion3.3<210〉1<211>1844<212>DNA<213〉稻属(0ryzasativaL.)<220〉<221>启动子(Promoter)<222〉(144)..(1841)<400〉1aactatatcaatgtgaaaatatatttcatgacaattctattgatattttttaatat肌犯60agttttgtatattaatgaattattaagattttaaaattttgtcccacgaaaacggagata120agtacatcttagcatatgatt肌gcaatcatcactagccaagcgcaatcttttgcaatac180agttcttcccc肪gtca^tcggccacattctctttcatgcasgctagcaa240ccagcctgccttgttatttttttaaggaatagaatgaggg3tggatgtccacactccacg300cttctcgatcatgctcttaaacsttacaatttttgtaaaacatatatttc360ataaaaaaagttttaaatccagtatgcagctttatgataccatttgtgcc420ctaaagtaattcgca犯tcattcagctatttaaccgttcagccattcaac480gtacctcgttggccctctcaccatagacaaacctctgtaatcttgcggga540gactattttgatgcctcaagaggatattgccttgttcgtttaattaaaaaCC3tCC3肌C600ggttatgaatttctttttaaa幼犯tatgat^C3CtC3tacetacatatctatacaeictc660tttatctaaactcaactcacacatcgagatat犯aa卿ggagacaaatc720c犯catatgaatagtagcataMataatgttcatatatgaatttgtcactttttttctca780atgtgtaagtcttgtttttttttggactgatatactttat840attgtcaatttctttcataactatttatatcgaaattg肌agaaaaattt900atatgagggaacatcccctcgatcttgcacgagtttaccattcgccattcggttgtatag960cacttgttcatgtata肌cctaeLetatgcgc犯tttc犯tagtttaactaa1020tccaatctttgttgatttgttgctatagtacttcaacaataccgagctactgttatttgc1080atattggaacactagtctttcacacgtattgttgtactacatccgtccca1M0cggagggagtagctgctagctggagUgctagtgttctcgttcatggacg1200gtcggggcaccgtgageigccggataagtgcagacagtggtcagtacaact1260tctgcagtatcccgtacgcgcgctcgatcatcagcttgcatagtcacgga犯犯gCCC3C1320cacgtacataaccgataagatcaatcgatcggtttcacggagcaatgcaaatctatcttc1380agagcagc犯tgcctctatgactctattcgcatccagtgatgca犯tccatcgccaagat1440gcaatctatatacccccggtacccattgcattgtgtatcacaacgctagcttgtacatgt1500gcgcgcatgaactacgggctt犯tttgCELCctccgagcgaaacattgatcgtttcttatg1560幼gcacacgcccactggtgggtcagtcacgatcgcgcattcaa犯tctctcatgttttta1620cagtaaaatccaccctggagcctggatgacggg卿atgtagaccgctcctcaactctgt1680gctcgttggacttggacgcagcctataagtggctgaccccgagttctccgagttagcaag1740aagccactccactcggccgctcctgcatgtataactagctagttctagctcgctcaggca1800ctcgatccaccgccgggcgcgttggattgagataggctgaggag1844<210〉2<211〉2033<212〉DNA<213〉稻属(0ryzasativaL.)<220><221><222〉启动子(Promotor)(4)..(2033)<400>2ccttctgaagagacccccttttacaagcatcttggcctaggtgataggttttacaagcatcttagctgcaggatagagtttaggatgggcggtggtaaagttaaaaagatgcaaaactgggattgacggccacaaattcttcagag咖agctgatgaagatgcaaaccctgagcaaagatgatgcaatgttgctatttatttcaccgaagcactcattccagtcttttgccatatttgggaactgtaaatgtacatctcttcgttgcttgattgcttcctcttgccttcgacctatcagctttgtaggactggtacatttttttttttcccgagaaaatgacagcaaacctgaaaggactttgaacagcatactttcaaaggaatgagcccgtcactgccaatttacgaggatgtgaaaacaattgatatattcatacatattgtagtcgaaatatcagaattttttaacagcatgtaatacggtctagaaaccaatgcacaacaactcaaatat肌acagtgagtgctgttcacggtcaagtgagaccgtgaggaccaaacgctgatgatcagtgaaacaccaaaccgacaagctatggctggaattgtcacccaatttctttttctcaagtcttgttgaa幼ag犯aaaga组gctattctgactttaaactgttgctactgcttagcatgctgcataatgtttccctactgataactgcagaatgtagaagagacatagtccattaaacacggccacatctttgccgtgatacgtcagtccagacaggc组gcacacgaaaacagtttctttgccctaaaaaaatcttaaagagttttatgcaagctctacctgaaggccactacaaagattgacagattttctctgttatggcattaatgttaataaatatagtc犯caacataaagagaagaatatca犯acttcacacsctattattctgaactgggtttcactgttattatgtctaataactttttgcagattgaaaacaatgaatcaggatttagtccagaattccacataaatatggtcaaatcattatcattattcagcacacataggaacgataacggaactggcatttatccagcttccaaagactctgctaatgctaaaacctgcatggaaaagtgtctgtggtctatataagacagctacagtatgcccaaaacaggagagttggagtgttcttcaggttcatccattatggttcgttcttgaagcgacagttccactatatgtagctatgat犯tggtggaagctgttcaccccagagcagtgctctgggattttctattcctctgctctcttttcaggtcatttccacaacagtttgatccatgcaaagaa60tgatccatgcaaagaagtga120ggaacctgctagcttgcaag180agcataaagagaagtcgtaa240tgggga犯acgc犯agcaag300agaaacatggaaaatctggt360tccacaattaacttctttat420gcaggaacctggagcaaagt480aataaacagcacaattatct540actccaaatggcaatttgat600taggatcagtacaagtaagg660acagagaggtgaggccgcca720Ugtgtaaaagtacaaatca780caatgccactactaaaattt840cca犯gcttctgtgttattt900ctgctgactagaaacaaaaa960gagcacatgctttggtcatt1020atcatggggaaacaaactgg1080tgatttcgcacatcatcaag1140acatgtaactctgtcaaagt1200tataaaacatcgagagtctc1260aaggttcataaaaaatacat1320aggtctaaaggcccactgag1380ttttgcactgggttttcacc1440cataagaaaacaccaggaga1500agcagtgttttacttcttta1560ctcaaiacagatgtccttact1620atgggcaatttggacaattt1680tttgcacaaaacctggcttc1740ctttctacatcccagttgggi800gtcctgg犯ggacatctacc1860actggcctacctatccataa1920caacaagtttgtggcgaagt1980cgatccttatgac2033<210〉3<211〉1811<212〉DNA<213〉稻属(0ryzasativaL.)<220〉<221〉启动子(Promotor)<222〉(121)..(1777)<400>3aggttaatccaggagatgctagtcgacctagctagctagctagctagagcacctttgcagG0caatactgacctgaccggccacctgatgttgaaactagcataagcatacagtactatagc120attgtgctagcatttccttcaaaatatcattaactgttcctttatttgcgttaagtaatt訓attaccaccgttattccaaaatataagggattaatttaactatgaatttgtattgct肌a240atttcttatatctcgagacggagatagtatctaagctagttttUatcgggacggctaag300gaggcggccgaccaaattttattaagaaagaaagatgttacaactttaacaatatcgaca360ttaaactgtcgagggsgagaacgtgggagaacagag邓犯gagaac肌aagicaaaaaeica420cacaggaccgctttatagcggggttcttagccaacttatctaaaaataacggcctccctc480tacaccaggatctcatctctaatatcattgtatatccctaacactgagcactctaaaaat540accagcctccctccacaccatgatctcatctctaatatcattgtatatccctaacaccaa600gcataacctttgctcaaagatcctggcgttcctctctttccgcataaaccaacaaaccat660catacaatgaagtacggtggtgtttgaatcttctgaagatgaagatgaagataaagatta720agtgtttcacgtaaaacaagatggtaataacgtgtgattaattgagttttaattattaca了80aMttgaaaaattgattaatctgatattttagagcaacttttatatagaaagttttcaaa840aaaaaaccgcaccgtttagcagtttgaaaaacatgctacgagtatccaaaatttcatcca900attcttatcggagaaacgaatgcagccagttgcatgcgctaggtggagctaagtttgatg960aaactgaagagatgttgataatcaaaacgagtacgtcctttcagcagagatgattgtctg1020aaatcaaaatattttagacgacgacgttggttcagagattcaattcatagacatatatac1080tagtaaggtaaactatagattcacgtataatatacatgaacaccctgaaactgaaaccga1140aagctagctagtgatcagaccacacagatgatcactacttgcctttcggcaacggtagtc1200acacacacctcaagaacacatgc.ttgcttgcatatagcattgccagtttgccactaattg1260catgcagtctccatcatcgaagc肌agcaaagaaaaacscacacatgtacacacacacac1320tctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctgcacgcgcgcgtgcatgca1380tgcaaagatttcaaataatcccaagcgcgcgagagcgagaaagcaaaaaagcgcgcgaac1440aagatcccgttaacctaaccggccgtcgcgtcaacttccaaccccccactaacactcaca1500ctcgcactcaccaccatgcagcaatgtcatccgaatcaaaattaccaagctagctaatcc1560accaatcctccccagccgttcgttcggatcgatccgacggccaccatcccactctgatcg1620atccatgcatatattcctccccagtgactagctcgcccccgctataaagcccagctcaca1680ctacacccactcatccacagcgatcaaccgcattacacttggttaattaattaattctcc1740attagcagctagctagggttctagggttaatttagttgatcagttcgccggaaccggaga1800agaagagigaag1811<210>4<211〉28<212〉DNA〈213>人丁序列<220><221〉misc_feature<223>引物<400〉4cccaagcttgcaatcatcactagccaag28<210><211><212〉<213〉<220〉<221><223>526DNA人工序列misc—feature引物<400〉5cgggatccagcctatctcaatccaac26<210〉<211〉<212><213><220><221〉<223〉627DNA人工序列misc一feature引物<400>6gcgtcgacagtgataggatgggcggtg27<210><211><212〉<213〉<220><221〉<223〉28醒人工序列raise—feature引物<400>7cgggatccgtcataaggatcggttgtgg28<210〉8<211〉28<212〉腿<213>人工序列<220〉<221>misc—feature<223>引物<400>8aactgcagattgtgctagcatttccttc28<210>9<211〉28<212>DNA<213>人T.序列<220><221〉misc—feature<223〉引物<400>9gctctagaactaaattaaccctagaacc28权利要求1.一种在植物叶脉或分蘖基部特异表达的启动子，其特征在于，所述的启动子选自下组(1)具有SEQIDNO1、SEQIDNO2、或SEQIDNO3所示的核苷酸序列的启动子；(2)核苷酸序列在严格条件下能够与(1)限定的多核苷酸序列杂交且具有指导目的基因在植物叶脉或分蘖基部特异表达功能的启动子；(3)核苷酸序列与SEQIDNO1、SEQIDNO2、或SEQIDNO3有95％以上同源性且具有指导目的基因在植物叶脉或分蘖基部特异表达功能的启动子；或(4)核苷酸序列与SEQIDNO1、SEQIDNO2、或SEQIDNO3所示的核苷酸序列完全互补的启动子。2.如权利要求l所述的启动子，其特征在于，所述的植物是单子叶植物。3.如权利要求l所述的启动子，其特征在于，具有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列的多核苷酸能够指导目的基因在植物分蘖基部特异表达；或具有SEQIDNO:2或SEQIDNO:3所示的核苷酸序列的多核苷酸能够指导目的基因在植物叶脉特异表达。4.如权利要求3所述的启动子，其特征在于，具有SEQIDNO:2所示的核苷酸序列的多核苷酸能够指导目的基因在植物叶脉的二级脉中表达；或具有SEQIDNO:3所示的核苷酸序列的多核苷酸能够指导目的基因在植物叶脉的中脉和一级脉中表达。5.—种载体，其特征在于，所述的载体含有权利要求1所述的植物叶脉或分蘖基部特异表达启动子，作为启动子元件。6.如权利要求5所述的载体，其特征在于，所述的载体还含有与所述的植物叶脉或分蘖基部特异表达启动子可操作地连接的目的基因。7.—种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，所述的细胞含有权利要求6所述的载体；或其基因组中整合有外源的权利要求1所述的植物叶脉或分蘖基部特异表达启动子。8.—种使目的基因在植物叶脉或分蘖基部特异表达的方法，其特征在于，所述的方法包括将构建物转化植物细胞，所述的构建物含有权利要求l所述的植物叶脉或分蘖基部特异表达启动子以及与所述的启动子可操作地连接的目的基因；筛选出转入了所述构建物或染色体中整合有所述构建物的植物细胞；和将所述植物细胞再生成植株。9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的方法包括(a)提供携带表达载体的农杆菌，所述表达载体中含有构建物，所述的构建物含有权利要求1所述的植物叶脉或分蘖基部特异表达启动子以及与所述的启动子可操作地连接的目的基因；(b)将植物细胞、组织或器官与步骤(a)中的农杆菌接触，从而使所述的构建物转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；(C)选择出转入了所述构建物的植物细胞、组织或器官；以及(d)将步骤(C)中的植物细胞、组织或器官再生成植物。10.权利要求l所述的启动子的用途，其特征在于，所述的启动子用于指导目的基因在植物的叶脉或分蘖基部特异表达。全文摘要本发明公开了一类植物叶片各级脉和分蘖基部特异表达启动子，所述的启动子能够指导目的基因在植物叶片各级脉或分蘖基部特异性表达。本发明还公开了所述启动子的应用，可用于标记特定组织，引导特定的功能基因在特定的组织中表达，以及应用于特有组织的生长发育研究和针对性改良。因此本发明的组织特异性启动子在理论研究和农艺改良中具有重要的应用价值。文档编号C12N15/87GK101245349SQ20071003764公开日2008年8月20日申请日期2007年2月16日优先权日2007年2月16日发明者倩胥,薛红卫申请人:中国科学院上海生命科学研究院