专利名称：：一种小牛胸腺脱氧胞苷激酶的快速提纯方法
技术领域：
：本发明属于一种提纯方法，具体涉及一种小牛胸腺脱氧胞苷激酶的快速提纯方法。技术背景脱氧胞苷激酶(dCK)是细胞质内的四大激酶之一，它广泛存在于哺乳动物体内及一些细菌细胞内。细胞体内，dCK可以催化天然核苷的磷酸化，也可催化一些核苷类药物的磷酸化"n"。研究表明，抗病毒核苷类药物在人体内通过dCK催化迸行磷酸化，产生与逆转录酶结合的底物，而发挥药效。但是，在一些患者体内细胞的dCK含量很低，无法催化核苷类药物的磷酸化，因而导致了病毒的抗药性[5]。因此，对核苷类药物进行体外磷酸化，是近年来核苷类药物研究的一大方向。传统的小牛胸腺dCK的提纯主要分为粗提和柱层析两步。所谓粗提就是将小牛胸腺粉碎匀浆，再对匀浆液进行盐析，透析后得dCK粗酶。将得到的dCK粗酶进行多次柱层析，就可得精提的dCK了气该方法的缺点在于柱层析过程较为繁琐，耗时较长，重复性不高，容易导致dCK的失活和较大的实验误差。
发明内容本发明所要解决的技术问题是克服了传统的小牛胸腺dCK的提纯方法的繁琐，耗时较长、易使dCK的失活和较大的实验误差的缺陷，提供了一种快速、简便、所提dCK活性较好的小牛胸腺dCK的提纯方法。本发明提供的是一种利用先进的快速蛋白质层析系统(FPLC)快速提纯小牛胸腺dCK的方法，包括如下步骤对小牛胸腺进行粉碎匀浆、盐析、透析提取dCK粗酶；再利用FPLC的分子筛凝胶柱和离子交换柱层析对上述dCK粗酶进行分离纯化。具体步骤如下1、小牛胸腺dCK粗酶的提取(1)将小牛胸腺用剪刀剪碎，放入破碎仪中与0.001M0.1M的Tris-HC1缓冲溶液(含5mM锍基乙醇，pH6.07.0)—起进行匀浆化。(2)将上述匀浆液低温超速离心1020min，取上清液。向上清液中加入1%10%链霉素硫酸盐溶液进行沉淀。(3)将上述沉淀液低温超速离心1020min，，取上清液。向上清液中加入10%30%的硫酸铵进行沉淀。(4)将上述沉淀液低温超速离心1020min，取上清液。向上清液中加入硫酸铵10%20%进行沉淀。(5)将上述沉淀液低温超速离心1020min，留取沉淀物。用少量0.001M0.1M的Tris-HCl缓冲溶液(含5mM锍基乙醇，pH6.07.0)溶解沉淀。用0.001M0.1M的Tris-HC1缓冲溶液(含5mM锍基乙醇，p服.07.0)对上述溶解液进行透析40小时以上，可得小牛胸腺DCK粗酶液。2、FPLC提纯小牛胸腺dCK(1)分子筛凝胶层析。将上述粗酶液在FPLC系统中层析，条件是分子筛凝胶柱S印hodexG75;洗脱液0.001M0.01M的Tris-HCl缓冲溶液(含5mM疏基乙醇pH6.07.5);平衡2个柱床；洗脱12个柱床；流速0.250.75ml/min。所得的锋谱图如图1。(2)离子交换层析。将上述粗酶液在FPLC系统中用离子交换柱进行分离，条件是离子交换柱HiTripQFFlml;洗脱液A:0.001M0.01M的Tris-HC1缓冲溶液(含5mM锍基乙醇，pH6.07.5);洗脱液B:0.001M0.01M的Tris-HC1缓冲溶液(含5mM巯基乙醇，pH9.010.0)+lM2M的NaCl;平衡1025个柱床；冲洗25个柱床；洗脱梯度洗脱液B在510个柱床内保持3%7%，然后在5个柱床内保持10%15%，然后在510个柱床内保持20%25%，然后在510个柱床内保持40%50%;流速0.75lml/min。阴离子交换层析得到三个峰，分别是流穿峰，A峰、B峰和C峰，所得的峰谱图如图2。聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和HPLC酶活表征(1)SDS-PAGE凝胶电泳将阴离子层析和分子筛凝胶层析得到的收集峰进行电泳表征。其中分子筛凝胶层析经过电泳后得到三条条带；阴离子交换层析得到一条条带。条件是分离胶浓度为7%15%;浓縮胶浓度为4%5%;电流为1015mA(浓縮胶)、2030mA(分离胶);电泳时间为4080min，电泳槽ReadyGelPrecastGelSystem(Bio-Rad)。电泳图见图3。(2)HPLC酶活测定以单位蛋白的dCK催化CDA的磷酸化的量为一个酶活单位。利用HPLC测定CDAMP的生成量。HPLC层析的洗脱液A为去离子水；洗脱液B为HPLC用甲醇；洗脱梯度为在510min内洗脱液A保持95W10(m，洗脱液B保持(m5y。;然后在510min内洗脱液A减少至75%50%，洗脱液B增加至25%50%;最后在510rain内洗脱液A保持75%50%，洗脱液B保持25%50%。表一是各纯化步骤所得的收率和纯化倍数:表一各纯化步骤所得的收率和纯化倍数<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>图1为用快速蛋白质层析系统(FPLC)对小牛胸腺dCK粗酶凝胶分子筛层析得到的色谱图。图2为用快速蛋白质层析系统(FPLC)对凝胶分子筛层析的到的收集液阴离子交换层析所得的色谱图。图3为用快速蛋白质层析系统(FPLC)阴离子层析所得的蛋白峰进行SDS-PAGE电泳分析所得的电泳图。图中MW为蛋白质分子量标准，Sample为FPLC阴离子层析所得的蛋白峰。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。实施例11、小牛胸腺dCK粗酶的提取(1)将小牛胸腺用剪刀剪碎，放入破碎仪中与0.01M的Tris-HCI缓冲溶液(含5mM锍基乙醇，pH7.0)—起进行匀浆化。(2)将上述匀浆液离心(10000g/10min)后，取上清液。向上清液中加入10%链霉素硫酸盐溶液进行沉淀。(3)将上述沉淀液离心(10000g/10min)后，取上清液。向上清液中加入22.5%的硫酸铵进行沉淀。(4)将上述沉淀液离心(10000g/10min)后，取上清液。向上清液中加入硫酸铵13.7%进行沉淀。(5)将上述沉淀液离心(10000g/10min)后，留取沉淀物。用少量0.01M的Tris-HCI缓冲溶液(含5mM锍基乙醇，pH7.0)溶解沉淀。用0.01M的Tris-HCI缓冲溶液(含5mM锍基乙醇，pH7.0)对上述溶解液进行透析40小时以上，可得小牛胸腺DCK粗酶液。2、FPLC提纯小牛胸腺dCK(1)分子筛凝胶层析。将上述粗酶液在FPLC系统中层析，条件是分子筛凝胶柱S印hodexG75;洗脱液0.01M的Tris-HCI缓冲溶液(含5mM锍基乙醇pH7.0);平衡2个柱床；洗脱1个柱床；流速0.5ml/min。得峰谱图。(2)离子交换层析。将上述粗酶液在FPLC系统中用离子交换柱进行分离，条件是离子交换柱HiTripQFF1ml;洗脱液A:0.01M的Tris-HCI缓冲溶液(含5mM锍基乙醇，pH7.0);洗脱液B:0.01M的Tris-HCI缓冲溶液(含5mM锍基乙醇，pH9.0)+2M的NaCI;平衡20个柱床；冲洗5个柱床；洗脱梯度洗脱液B在5个柱床内保持3%，然后在5个柱床内保持10%，然后在5个柱床内保持20%，然后在5个柱床内保持40%;流速1ml/min。阴离子交换层析得到三个峰。聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和HPLC酶活表征(1)SDS-PAGE凝胶电泳将阴离子层析和分子筛凝胶层析得到的收集峰进行电泳表征。其中分子筛凝胶层析经过电泳后得到三条条带；阴离子交换层析得到一条条带。条件是分离胶15%;浓縮胶5%;电流10mA(浓縮胶)、20mA(分离胶)；电泳时间60min;电泳槽ReadyGelPrecastGelSystem(Bio-Rad)。电泳结果表明阴离子交换层析得到的峰为一种纯的酶。(2)HPLC酶活测定以单位蛋白的dCK催化CDA的磷酸化的量为一个酶活单位。利用HPLC测定CDAMP的生成量。实施例21、小牛胸腺dCK粗酶的提取(1)将小牛胸腺用剪刀剪碎，放入破碎仪中与0.01M的Tris-HCI缓冲溶液(含5mM锍基乙醇，pH7.0)—起进行匀浆化。(2)将上述匀浆液离心(10000g/10min)后，取上清液。向上清液中加入10%链霉素硫酸盐溶液进行沉淀。(3)将上述沉淀液离心(10000g/10min)后，取上清液。向上清液中加入22.5%的硫酸铵进行沉淀。(4)将上述沉淀液离心(10000g/10min)后，取上清液。向上清液中加入硫酸铵13.7%进行沉淀。(5)将上述沉淀液离心(10000g/10min)后，留取沉淀物。用少量0.01M的Tris-HCI缓冲溶液(含5mM锍基乙醇，pH7.0)溶解沉淀。用0.01M的Tris-HCI缓冲溶液(含5mM锍基乙醇，pH7.0)对上述溶解液进行透析40小时以上，可得小牛胸腺DCK粗酶液。2、FPLC提纯小牛胸腺dCK分子筛凝胶层析。将上述粗酶液在FPLC系统中层析，条件是分子筛凝胶柱-S印hodexG75;洗脱液0.01M的Tris-HCI缓冲溶液(含5mM巯基乙醇pH7.0);平衡2个柱床；洗脱1个柱床；流速0.5ml/min。得峰谱图。聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和HPLC对提纯小牛胸腺dCK进行酶活表征。实施例31、小牛胸腺dCK粗酶的提取(1)将小牛胸腺用剪刀剪碎，放入破碎仪中与0.01M的Tris-HCI缓冲溶液(含5mM锍基乙醇，pH7.0)—起进行匀浆化。(2)将上述匀浆液离心(10000g/10min)后，取上清液。向上清液中加入10%链霉素硫酸盐溶液进行沉淀。(3)将上述沉淀液离心(10000g/10min)后，取上清液。向上清液中加入22.5%的硫酸铵进行沉淀。(4)将上述沉淀液离心(10000g/10min)后，取上清液。向上清液中加入硫酸铵13.7%进行沉淀。(5)将上述沉淀液离心(10000g/10min)后，留取沉淀物。用少量0.01M的Tris-HCI缓冲溶液(含5mM锍基乙醇，pH7.0)溶解沉淀。用0.01M的Tris-HCI缓冲溶液(含5mM锍基乙醇，pH7.0)对上述溶解液进行透析40小时以上，可得小牛胸腺DCK粗酶液。2、FPLC提纯小牛胸腺dCK离子交换层析。将上述粗酶液在FPLC系统中用离子交换柱进行分离，条件是离子交换柱HiTripQFF1ml;洗脱液A:0.01M的Tris-HCI缓冲溶液(含5mM锍基乙醇，pH7.0);洗脱液B:0.01M的Tris-HCI缓冲溶液(含5mM锍基乙醇，pH9.0)+2M的NaCI;平衡20个柱床；冲洗5个柱床；洗脱梯度洗脱液B在5个柱床内保持3%，然后在5个柱床内保持10%，然后在5个柱床内保持20%，然后在5个柱床内保持40%;流速1ml/min。阴离子交换层析得到三个峰。聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和HPLC对提纯小牛胸腺dCK进行酶活表征。权利要求1.一种小牛胸腺脱氧胞苷激酶(dCK)的快速提纯方法，包括如下步骤(1)小牛胸腺dCK粗酶的提取对小牛胸腺进行粉碎匀浆、盐析、沉淀溶解和透析提取小牛胸腺dCK粗酶；(2)利用FPLC的凝胶分子筛和阴离子交换层析中之一或两者结合提纯小牛胸腺dCK。2.如权利要求1所述的一种小牛胸腺脱氧胞苷激酶(dCK)的快速提纯方法，其特征在于歩骤(1)所述的小牛胸腺匀浆是将小牛胸腺用剪刀剪碎，放入破碎仪中与0.001M0.1M的Tris-HC1缓冲溶液(含5mM巯基乙醇，p朋.07.0)—起进行匀浆化，得到匀浆液。3.如权利要求2所述的一种小牛胸腺脱氧胞苷激酶(dCK)的快速提纯方法，其特征在于所述Tris-HC1缓冲溶液(含5mM锍基乙醇，pH7.0)浓度为0.OIM。4.如权利要求1所述的一种小牛胸腺脱氧胞苷激酶(dCK)的快速提纯方法，其特征在于步骤(1)所述的盐析包括链霉素硫酸盐盐析和两步硫酸铵盐析。5.如权利要求4所述的一种小牛胸腺脱氧胞苷激酶(dCK)的快速提纯方法，其特征在于所述的为1%10%链霉素硫酸盐，硫酸铵浓度分别为10%30%、10%20%。6.如权利要求1所述的一种小牛胸腺脱氧胞苷激酶(dCK)的快速提纯方法，其特征在于步骤(1)所述的沉淀溶解是用少量0.001M0.1M的Tris-HCl缓冲溶液(含5mM巯基乙醇，p服.07.0)溶解盐析后的沉淀。7.如权利要求6所述的一种小牛胸腺脱氧胞苷激酶(dCK)的快速提纯方法，其特征在于所述Tris-HC1缓冲溶液(含5raM毓基乙醇，pH7.0)浓度为0.OIM。8.如权利要求1所述的一种小牛胸腺脱氧胞苷激酶(dCK)的快速提纯方法，其特征在于步骤(1)所述的透析为用0.001M0.1M的Tris-HC1缓冲溶液(含5mM锍基乙醇，p朋.07.0)对溶解液进行透析40小时以上。9.如权利要求8所述的一种小牛胸腺脱氧胞苷激酶(dCK)的快速提纯方法，其特征在于所述Tris-HC1缓冲溶液(含5mM锍基乙醇，pH7.0)浓度为0.OIM。10.如权利要求1所述的一种小牛胸腺脱氧胞苷激酶(dCK)的快速提纯方法，其特征在于:步骤(2)所述的凝胶分子筛层析所用分子筛凝胶柱:S印hodexG75，用洗脱液为0.001M0.01M的Tris-HCl缓冲溶液(含5mM锍基乙醇，p服.0~7.5)，平衡2个柱床，洗脱12个柱床，流速0.250.75ml/min。11.如权利要求10所述的一种小牛胸腺脱氧胞苷激酶(dCK)的快速提纯方法，其特征在于所述的凝胶分子筛层析用洗脱液为0.01M的Tris-HCl缓冲溶液(含5mM锍基乙醇，pH7.0)，平衡2个柱床，洗脱l个柱床；流速0.5ml/tnin。12.如权利要求1所述的一种小牛胸腺脱氧胞苷激酶(dCK)的快速提纯方法，其特征在于步骤(2)所述的阴离子交换层析所用的离子交换层析柱为HiTr邻QFF柱，用洗脱液A为0.001M0.01M的Tris-HC1缓冲溶液(含5mM锍基乙醇，pH6.07.5);洗脱液B为0.001M0.01M的Tris-HCl缓冲溶液(含5mM锍基乙醇，pH9.010.0)+lM2M的NaCl;平衡为1025个柱床；冲洗为25个柱床；洗脱梯度洗脱液B在510个柱床内保持3%7%，然后在5个柱床内保持10%15%，然后在510个柱床内保持20%25%，然后在510个柱床内保持40%~50%;流速为0.75lml/min。13.如权利要求12所述的一种小牛胸腺脱氧胞苷激酶(dCK)的快速提纯方法，其特征在于所用洗脱液A为0.01M的Tris-HC1缓冲溶液(含5raM巯基乙醇，pH7.0);洗脱液B为0.01M的Tris-HC1缓冲溶液(含5mM锍基乙醇，pH9.0)+2M的NaCl;平衡为20个柱床；冲洗为5个柱床；洗脱梯度洗脱液B在5个柱床内保持3y。，然后在5个柱床内保持10%，然后在5个柱床内保持20%，然后在5个柱床内保持40%;流速lml/min。14.如权利要求1所述的一种小牛胸腺脱氧胞苷激酶(dCK)的快速提纯方法，其特征在于将将阴离子层析和分子筛凝胶层析得到的收集峰进行SDS-PAGE凝胶表征和HPLC酶活表征。全文摘要本发明公开了一种小牛胸腺脱氧胞苷激酶(dCK)的快速提纯方法，包括(1)小牛胸腺dCK粗酶的提取对小牛胸腺进行粉碎匀浆、盐析、沉淀溶解和透析提取小牛胸腺dCK粗酶；(2)利用FPLC的凝胶分子筛和阴离子交换层析中之一或两者结合提纯小牛胸腺dCK。该方法快速、简便、使纯化dCK活性较好。文档编号C12N9/12GK101130767SQ200710040318公开日2008年2月27日申请日期2007年4月29日优先权日2007年4月29日发明者朱利民,柴艳倩申请人:东华大学