专利名称：添有扩增内标的沙门氏菌pcr检测方法
技术领域：
本发明涉及的是一种食品安全技术领域的检测方法，具体地说是一种添有扩增内标的沙门氏菌PCR检测方法。
背景技术：
PCR，英文polymerase chain reaction的缩写，是指聚合酶链式反应。建立准确、快速的食源性致病菌PCR检测方法能促进我国及时、有效地进行食源性疾病的预防、预警和控制，保障人民的身体健康。中国加入WTO后，食品安全问题成为制约我国对外贸易的主要障碍，严重地阻碍着经济的发展和影响人民的健康，因此通过发展快速的检测技术来解决食品安全问题是国家需求。我国目前对食品中重要致病菌——沙门氏菌的国标检验方法是采用传统培养方法，由于此方法费时费力，已不能满足食品加工与生产中对致病菌快速检测的需要。
在1992年，Rahn等人率先以鼠伤寒沙门氏菌的invA基因设计了一对引物，用于沙门氏菌的PCR检测，详见Rahn K，De grandis S A，Clarke R C，et al.Amplification of an invA gene sequence of Salmonella typhimurium bypolymerase chain reaction as a specific method of detection of Salmonella.Molecular and Cellular Probes.1992，6(4)271-279.(Rahn K，De grandisS A，Clarke R C，等.以鼠伤寒沙门氏菌的invA基因序列作为PCR的检测基因应用于沙门氏菌的检测.分子与细胞探针.1992，6(4)271-279.)。此后，针对沙门氏菌的PCR检测技术开始广泛应用，用于检测的基因不断的增多，设计的引物也日益多样，但大多数的研究者仍沿用Rahn的检测引物。利用PCR检测技术对沙门氏菌的检测具有快速、灵敏和特异性强的特点。但是大多数的检测引物的设计是在基因测序工作开展和生物信息学发展之前，时有错检和漏检发生，造成假阳性和假阴性结果出现。而PCR方法在不同的实验室或检测部门所检测的目的基因和操作流程有一定的差异，没有形成标准，得到的检测结果也不尽相同。近年来的实践应用表明，食品和培养基中存在的抑制剂可影响PCR反应，使检测结果呈假阴性。尽管，PCR方法在不断的改进和完善，却不能有效地阻止假阴性结果的发生。
有些学者开始认识到在PCR反应体系放置指示假阴性的扩增内标(internalamplification control，IAC)是必要的。在2003年，Malorny等人利用分子克隆的方法，利用invA基因的部分片段，人工构建的一条157bp的扩增内标片段，并在其的试验结果中能够指示出假阴性的发生。详见Malomy B，Hoorfar J，Bunge C，et al.Multicenter Validation of the analytical accuracy ofSalmonella PCRtoward an international standard.Applied and environmentmicrobiology.2003，69(1)290-296.(Malomy B，Hoorfar J，Bunge C，等.多渠道确证沙门氏菌PCR检测的正确性期望形成一项国际标准.应用与环境微生物.2003，69(1)290-296.)。然而，其所构建的扩增内标与所检测的invA基因有很高的同源性，在检测时，会不同程度地干扰检测引物与检测基因的杂交；所用检测引物仍然是Rahn在1992年所报道的引物，在检测某些大肠杆菌(E.coli)时，会出现非特异性条带，降低了反映体系的特异性。
针对上述问题，本研究利用生物信息学的方法，重新根据invA基因设计了检测引物，而构建扩增内标主要来源于沙门氏菌另一特异基因(stn基因)，即与沙门氏菌的检测基因invA基因非同源，又与非沙门氏菌的基因组非同源。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种添有扩增内标的沙门氏菌PCR检测方法。使其将所构建的扩增内标片段添加到PCR反应体系中，有助于检测时显示假阴性的发生，提高准确率，为满足检疫执法过程中所急需的对食源性致病菌调查和检测提供有效的技术手段。
本发明通过以下技术方案实现，本发明具体步骤如下(1)利用沙门氏菌自身的特异基因序列构建扩增内标，设计特异引物。
(2)通过对MgCl2浓度和退火温度Tm值进行优化选择，使PCR反应体系处于最优的反应条件。首先，根据引物设计时推荐的Tm值，在Tm±5℃范围内以1℃间隔设置温度梯度，根据扩增产物在电泳图中的亮度来选择退火温度，在确定退火温度后，在反应体系中设置一系列的Mg2+浓度的梯度，从1.0mmol/L到3.0mmol/L(间隔0.5mmol/L)，同样根据扩增产物在电泳图中的亮度来选择PCR反应体系的Mg2+浓度。
(3)经过测定的沙门氏菌总DNA溶液用无菌水作10倍梯度稀释至10-10，以稀释的DNA溶液为模板，分别取5μL加入PCR反应体系，进行PCR检测，同时以无菌水代替DNA模板作阴性对照，选择PCR的检测灵敏度，然后，取带有扩增内标的载体，添加到PCR反应体系中。反应体系中添加不同稀释浓度的扩增内标，再次，检测DNA或菌株的灵敏度，选择对检测灵敏度影响最小且能够明确指示假阴性的扩增内标的浓度作为添加浓度。
(4)提取不同血清型的沙门氏菌标准菌株和不同种属的非沙门氏菌标准菌株的DNA，进行PCR检测，确定引物的特异性及扩增内标在非沙门氏菌样品检测中是否能够正常扩增。结果中，所有沙门氏菌均应呈阳性，非沙门氏菌都应为阴性。
(5)建立的PCR反应体系，通过对人工污染样品和自然污染的样品进行检测。通过检测人工污染样品判断扩增内标是否指示假阴性；检测自然污染样品，同时采用国标方法和API试剂条的检测结果进行参比，来评价建立的PCR检测体系的检测结果是否准确。
人工污染样品的检测采集80份人为污染严重的牛乳样品，每份取25mL，移入225mL的BPW液体培养基中，在37℃的摇床(150r/min)中增菌，并且在增菌8h后取样。每份样品取样1mL，放入1.5mL离心管中，3 000r/min离心10min，沉淀培养物中的食品残渣。取上清液，12 000r/min离心5min，收集沙门氏菌菌体。倒去上清液后，用无菌双蒸水重新悬浮菌体，离心洗涤三次。然后加入100μL无菌超纯水，在沸水浴中煮10min。从沸水浴中取出后，立即在-20℃放置30min。在37℃解冻后，12 000r/min离心5min，上清液为PCR模板DNA溶液，分别取5μL加入PCR反应体系，进行PCR检测，同时以无菌水代替DNA模板作阴性对照。
自然污染食品样品的检测采集了50个鸡蛋，每个鸡蛋取25mL，移入25mL灭菌生理盐水中，匀浆，取25mL样品均液接入100mL氯化镁孔雀绿增菌液(MM)和100mL亚硝酸盐胱氨酸增菌液(SC)进行选择性增菌培养。接入亚硝酸盐胱氨酸增菌液的样品在36℃培养8h后，从每份样品中取样1mL，进行PCR检测。在选择性增菌培养24h后，再经亚硫酸铋(BS)琼脂平板和DHL琼脂平板分离，从两种选择性平板上调取可疑菌落，用生化试验和API试剂条进一步检测和鉴定。
所述的扩增内标DNA序列主要来自沙门氏菌的stn基因，在此DNA序列的两端分别含有检测引物的序列。其用途是显示假阴性的发生，提高PCR检测的准确率。
所述的构建扩增内标，是指利用沙门氏菌自身的特异基因序列构建扩增内标，减少了沙门氏菌之外的其他生物的DNA对PCR检测的干扰，同时也避免了扩增内标对目的基因的同源交联干扰。使扩增内标降低对目的基因在检测过程中的干扰，增加检测的准确率。
扩增内标的方法，具体如下采用序列分析、基因比对的手段选择用于构建沙门氏菌PCR检测的扩增内标的特异基因序列，并与检测的目的基因的同源性极低；采用基因克隆的手段将选定的基因序列的两端分别连接检测引物，构建成扩增内标，并克隆到载体中；采用转基因方法转移上述带有扩增内标的载体到大肠杆菌(E.coli 5α)中，然后涂布于选择性平板(90mm培养皿，100mg/ml氨苄青霉素10μl，20％的IPTG溶液7μl，2％的X-gal溶液40μl)上，37℃培养12h。用灭菌的牙签从选择性平板上挑取白色菌落，接菌到容有5ml LB培养液的试管中，再在37℃下以150r/min培养6h，提取质粒pMD-stn的DNA，经PCR扩增后，确定获得转化子。
所述的载体，其转化的宿主细胞，在实例中它是大肠杆菌，其中包含有扩增内标的DNA片段。
所述的特异引物，是指一对用于沙门氏菌的PCR检测的检测引物(psL/R)，进行PCR检测时，其能扩增到沙门氏菌属菌株特有的检测基因，或者是PCR体系中添加的扩增内标；还有两对用于构建扩增内标的扩增引物(sinL/R)和长引物(sivL/R)，扩增引物(sinL/R)只能扩增到用于构建扩增内标的DNA片段，而长引物(sivL/R)可以通过PCR扩增和基因克隆等手段获得扩增内标。
本发明的一段用于构建扩增内标的DNA序列，此序列来自沙门氏菌的特异性基因stn基因。
所述的目的基因，是指沙门氏菌的invA基因。
所述的假阴性，是指PCR反应受到了食品或培养基等物质中存在的抑制剂的影响而没有发生反应，或者是由于操作人员的操作失误导致结果呈现阴性。
在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒，粘粒等。将用于作为扩增内标的基因序列可操作地连于表达调控序列，从而带有扩增内标的载体。
本发明的PCR检测方法是在普通PCR方法的基础上添加了一条扩增内标的片段。在同一PCR扩增过程中，可以用同一检测引物与目的基因同时进行扩增。当样品中含有沙门氏菌的DNA含量高于检测灵敏度时，电泳结果中含有目的基因的扩增片段，检测结果呈阳性；当样品中不含或者低于检测灵敏度时，电泳结果中只含有扩增内标的扩增片段，检测结果为阴性；当电泳结果中不含有任何扩增片段时，检测结果即为假阴性。该方法有助于PCR检测体系能够显示假阴性的发生，避免了因样品中存在的抑制剂或操作失误所导致检测结果呈现假阴性而作出的结果误判，从而提高PCR检测的准确率。
图1未添加IAC时猪霍乱沙门氏菌检测的灵敏度示意中电泳泳道1～8每个PCR反应中所含有的模板DNA浓度分别为12.8ng/μL，1.28ng/μL，128pg/μL，12.8pg/μL，1.28pg/μL，128fg/μL，12.8fg/μL，1.28fg/μL。M100bp DNA分子量标准。
图2添加IAC为3.65×104拷贝时猪霍乱沙门氏菌检测的灵敏度示意中电泳泳道1～8每个PCR反应中所含有的模板DNA浓度分别为12.8ng/μL，1.28ng/μL，128pg/μL，12.8pg/μL，1.28pg/μL，128fg/μL，12.8fg/μL，1.28fg/μL；电泳泳道9阴性对照(dH2O)。M100bp DNA分子量标准。
图3菌落灵敏度的检测示意中电泳泳道1～10每个PCR反应中加入猪霍乱沙门氏菌的起始菌落数依次为3.7×107，3.7×106，3.7×105，3.7×104，3.7×103，3.7×102，37，3～4，0～1，0cfu/mL。M100bp DNA分子量标准。
图4抗干扰试验示意图具体实施方式
下面结合具体实施例，，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆实验室手册(New York:Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例一、检测体系初步建立1.选取检测的目的基因利用生物信息学对沙门氏菌的已知特异基因进行分析，从中选出用于检测的目的基因invA。通过BLAST等软件，将invA基因的序列与其他微生物进行比对，选出特异性较高的序列区段。然后用软件Primer 5.0在这段特异序列中设计一对内标引物。引物序列如下psL5’-TGTCACCGTGGTCCAGTTTA-3’psR5’-CGACAAGACCATCACCAATG-3’(a)检测目的基因的序列特征*长度364碱基对*类型核酸*链型双链*拓扑结构线形(b)分子类型DNA(c)最初来源沙门氏菌菌株(d)序列描述SEQ ID NO.1TGTCACCGTGGTCCAGTTTATCGTTATTACCAAAGGTTCAGAACGTGTCGCGGAAGTCGCGGCCCGATTTTCTCTGGATGGTATGCCCGGTAAACAGATGAGTATTGATGCCGATTTGAAGGCCGGTATTATTGATGCGGATGCCGCGCGCGAACGGCGAAGCGTACTGGAAAGGGAAAGCCAGCTTTACGGTTCCTTTGACGGTGCGATGAAGTTTATCAAAGGTGACGCTATTGCCGGCATCATTATTATC
TTTGTGAACTTTATTGGCGGTATTTCGGTGGGGATGACTCGCCATGGTATGGATTTGTCCTCCGCCCTGTCTACTTATACCATGCTGACCATTGGTGATGGTCTTGTCG序列中下划线部分的字母代表引物psL和psR的位置。
2.PCR反应体系的优化通过对退火温度和Mg2+浓度的优化，确定的反应体系如下10×buffer 2.5μlMgCl2溶液(25mM) 1.5μldNTP(2.5mM)1.0μl上下游引物(各10μM)1.0μl+1.0μlTaq DNA聚合酶(2.5U/μl)0.3μl模板 5.0μl补无菌水至 25μlPCR循环参数为在94℃预变性3min，接着作35个循环，每个循环的程序包括94℃变性30s，退火温度按照下述步骤选择，退火时间为30s，然后在72℃延伸30s，循环结束后在72℃延伸10min，最后降温至12℃，结束所有操作程序。
二、用于制备扩增内标的基因序列的扩增1.选取用于制备扩增内标的基因选取沙门氏菌的stn基因的一段特异DNA序列来构建了扩增内标。stn基因是沙门氏菌的特异基因之一，选取stn基因制备扩增内标，不但可以保证构建的扩增内标的序列与检测的目标基因的同源性低，而且与其它微生物的总DNA序列的同源性也低。
2.选取stn基因特异性区段，并设计引物在GenBank中搜索到沙门氏菌stn基因和invA基因的序列。利用BLAST等软件，将stn基因的序列与其他微生物进行比对，选出特异性较高的序列区段I。然后，将序列区段I与沙门氏菌的invA基因的序列比对，找出同源性最低的一段DNA序列区段II。然后用软件Primer 5.0在这段序列区段II中设计一对内标引物。引物序列如下sinL5’-TGGGCATCCTGACTGACCAG-3’sinR5’-CGACGAACCAGCGAAACAAA-3’(a)构建扩增内标的基因序列特征*长度476碱基对*类型核酸*链型双链*拓扑结构线形(b)分子类型DNA(c)最初来源沙门氏菌菌株(d)序列描述SEQ ID NO.2 TTCAGGGAGTGAGTAATAATATCATTGAGGTTAACCGTCTGGAGCGTCAGATGCGCGGGCTTTACCAGTTCGAGCAATTCGCTTACCACCCGGTTCAAACGGTCGGCCTCTTTGGCCATCACCTGCGCCAGTTCATGCGACTCGCCGCCGGCAGGCGTGCGCTCGGCAAAGTATTTCGCCAGCCCTTTGATGGACGAGAGCGGGTTACGAATTTCGTGCGCGACGCCCGCCGCCAGATGCCCCATCGCCACCAGCTTTTCTTTACGCTTCATTGCATCAAGCAGTTCTCTGTGCGAGCGCTGATAACGCTGATGCCAAAAAAACGCCAGTAACGTTGCCAACAGCACCGCCGCTAACGCAGACAAAACAATCAGCGTATTATTTACTCCCTTGCCTGTGTCGCGGCCACGTCGCTGTCAAAGGCAATAAAAATAG 序列中阴影部分的字母代表引物sinL和sinR的位置。
3.连接按PCR回收Kit说明书回收扩增产物片段。回收的扩增产物片段与pMD18-T载体在Ligation Solution I作用下16℃过夜。
4.转化大肠杆菌用氯化钙法转化大肠杆菌，用蓝白斑筛选检测转化的大肠杆菌阳性克隆。
5.检测利用特异引物(sinL和sinR)对筛选的大肠杆菌阳性克隆进行PCR检测，并对PCR检测所确定的大肠杆菌阳性克隆抽取质粒pMD-stn的DNA进一步进行测序验证。
三、扩增内标的制备1.设计长引物在所设计的stn内标引物的5’端分别连接目标引物psL和psR形成一对约40bp的长引物。引物序列如下sivL5’-TGTCACCGTGGTCCAGTTTA -3’sivR 5’-CGACAAGACCATCACCAATG -3’2.PCR扩增获得扩增内标用长引物sivL和sivR扩增质粒pMD-stn的DNA，扩增产物即为扩增内标。
(a)扩增内标的序列特征*长度516碱基对*类型核酸*链型双链*拓扑结构线形(b)分子类型DNA(c)最初来源沙门氏菌菌株(d)序列描述SEQ ID NO.3TGTCACCGTGGTCCAGTTTA ATTCAGGGAGTGAGTAATAATATCATTGAGGTTAACCGTCTGGAGCGTCAGATGCGCGGGCTTTACCAGTTCGAGCAATTCGCTTACCACCCGGTTCAAACGGTCGGCCTCTTTGGCCATCACCTGCGCCAGTTCATGCGACTCGCCGCCGGCAGGCGTGCGCTCGGCAAAGTATTTCGCCAGCCCTTTGATGGACGAGAGCGGGTTACGAATTTCGTGCGCGACGCCCGCCGCCAGATGCCCCATCGCCACCAGCTTTTCTTTACGCTT
CATTGCATCAAGCAGTTCTCTGTGCGAGCGCTGATAACGCTGATGCCAAAAAAACGCCAGTAACGTTGCCAACAGCACCGCCGCTAACGCAGACAAAACAATCAGCGTATTATTTACTCCCTTGCCTGTGTCGCGGCCACGTCGCTGTCAAAGGCAATAAAATAG CGACAAGACCATCACCAATG序列中下划线和阴影部分的字母分别代表引物sivL和sivR的位置。
3.连接按PCR回收Kit说明书回收扩增产物片段。回收的扩增产物片段与pMD18-T载体在Ligation Solution I作用下16℃过夜。
4.转化大肠杆菌用氯化钙法转化大肠杆菌，用蓝白斑筛选检测转化的大肠杆菌阳性克隆。
5.检测利用特异引物(svaL和svaR)对筛选的大肠杆菌阳性克隆进行PCR检测，并对PCR检测所确定的大肠杆菌阳性克隆抽取质粒pMD-iac的DNA。
四、模板DNA的灵敏度测定1.扩增内标及沙门氏菌纯培养总DNA的定量测定纯化的扩增内标和沙门氏菌纯培养的总DNA，经DU-800紫外分光光度计(Beckman Coulter)测量，其含量分别为11.9ng/μL和12.8ng/μL。根据计算公式Ncopies/μL＝PCR片段的质量(g/μL)/(660g/mol×碱基数)×(6.023×1023)可以得到1μL扩增内标的拷贝数为3.65×109。
2.未添加扩增内标时的检测灵敏度将上述经过测定的猪霍乱沙门氏菌总DNA溶液用无菌水作10倍梯度稀释，从11.9ng/μL-1.19fg/μLDNA溶液中分别取5μL加入PCR反应体系，使每个PCR反应体系(25μL)分别含DNA为2.38ng/μL、238pg/μL、23.8pgμL、2.38pg/μL、238fg/μL、23.8fg/μL、2.38fg/μL、0.238fg/μL。扩增结果如图1所示，只是含0.238fg/μLDNA的PCR反应体系没有目标序列扩增带，而其他PCR反应体系均有目标序列扩增带。因此，其检测灵敏度为2.38fg/μL(起始浓度为11.9fg/μL)3.添加扩增内标后的检测灵敏度纯化的扩增内标先用无菌水作10倍梯度稀释，从3.65×109拷贝/μL-3.65拷贝/μL。然后在上述的PCR检测体系中分别加入扩增内标，研究扩增内标对灵敏度的影响。当PCR反应体系添加扩增内标的量为3.65×104拷贝时，其检测灵敏度仍然为12.8fg/μL(如图2所示)。当PCR反应体系添加扩增内标的量小于3.65×104拷贝时，由于扩增内标的扩增产物的荧光强度较弱，达不到指示假阴性结果的目的而没有采用。因此，添加3.65×104拷贝的扩增内标对上述PCR检测体系的灵敏度几乎没有影响，在本研究建立的PCR检测体系中则采用3.65×104拷贝的扩增内标。
4.菌落灵敏度的检测从试管斜面或平板上，挑取猪霍乱沙门氏菌接入BPW(buffered peptonewater)液体培养基中，经8小时增菌之后，用生理盐水作10倍梯度稀释，共稀释了10个梯度，同时用平板计数法计算沙门氏菌的菌落浓度。经计算，BPW液体培养基中沙门氏菌的菌落浓度为3.7×108cfu/mL。经PCR扩增之后，可检测到的菌落灵敏度为3.7×103cfu/mL(如图3所示)。
五、特异性检测采用本研究建立的PCR检测体系对伤寒沙门氏菌，甲型副伤寒沙门氏菌，猪霍乱沙门氏菌等44株常见沙门氏菌和22株非沙门氏细菌分别进行扩增检测，发现以沙门氏菌基因组DNA为模板皆能扩增出364bp的目标序列特异产物，而以非沙门氏菌基因组DNA为模板时只能扩增出516bp的扩增内标。
六、抗干扰检测将奇异变形杆菌(P.mirabilis)、大肠杆菌(E.coli)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)作为干扰菌株，以检测对猪霍乱沙门氏菌(S.choleraesuis AS1.1190)的菌落灵敏度的影响。平板上挑取奇异变形杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和猪霍乱沙门氏菌的单菌落，分别接入50mL BPW液体培养基中，在37℃培养6h。然后用灭菌的生理盐水分别作10倍系列稀释并稀释至10-10，并取1mL稀释度为10-6和10-7的菌液作平板计数，计算奇异变形杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和猪霍乱沙门氏菌各自纯培养的起始浓度。经计算奇异变形杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和猪霍乱沙门氏菌各自的起始浓度为2.1×108，1.2×108，3.1×108和3.7×108。
同时，分别取1mL猪霍乱沙门氏菌10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，10-8，10-9，10-10倍的稀释菌液加入到容有6mL的BPW液体培养基的试管中，并再作2组重复。然后，取1mL的N×104，N×106和N×108cfu/mL奇异变形杆菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的菌悬液分别加入到3组试管中(如图4所示)。试管中的菌液与培养基混合均匀后，每个试管取样1mL，存于1.5mL的离心管中，提取DNA并放置4℃备用。然后将3组试管放于37℃的摇床中，以150rpm培养8h，再次从每个试管中取样1mL，存于1.5mL的离心管中，提取并放于4℃备用。
PCR检测试验结果显示，干扰菌株对沙门氏菌的菌落灵敏度检测确实有影响，但是在增菌12h后，干扰降低，并能够检测到沙门氏菌起始菌量为3～4cfu/mL。
七、准确率评价1.人为污染样品的检测采集80份人为污染严重的牛乳样品，每份取25mL，移入225mL的BPW液体培养基中，37℃增菌8h。提取沙门氏菌DNA进行PCR检测，检测结果中有77份为阳性，3份假阴性(没有目标序列和扩增内标的扩增产物)。而同样的模板DNA用未加有扩增内标的PCR体系检测时，检测结果同上述一致。出现假阴性的样品经过重新纯化DNA后，再次进行检测，假阴性样品均显示为阳性结果。这说明从这3份假阴性样品中提取得到的模板DNA溶液中存在干扰因子，本研究建立的检测体系在进行大量样品检测时确实能够指示假阴性，有助于提高检测的准确率。
2.自然污染样品的检测采集了50个鸡蛋，采用3种方法同时进行检测样品，即PCR检测，国标检测和API试剂条检测。
首先，每个鸡蛋取25mL，移入25mL灭菌生理盐水中，匀浆，取25mL样品均液接入100mL氯化镁孔雀绿增菌液(MM)和100mL亚硝酸盐胱氨酸增菌液(SC)进行选择性增菌培养。接入亚硝酸盐胱氨酸增菌液的样品在36℃培养8h后，从每份样品中取样1mL，进行PCR检测。PCR检测结果显示，只有5份阳性对照样品的检测结果是阳性，其余样品的结果全部为阴性。
然后，在选择性增菌培养24h后，再经亚硫酸铋(BS)琼脂平板和DHL琼脂平板分离，从两种选择性平板上调取可疑菌落，用生化试验和API试剂条进一步检测和鉴定。国标检测的生化鉴定结果和API试剂条的检测结果显示出与PCR检测的结果相同，即只有5份阳性样品检测出了沙门氏菌，其余挑选的可疑菌落多数为大肠杆菌和产柠檬酸菌。
3种检测结果完全一致，说明本研究建立的PCR检测体系的检测准确率与国标检测方法和API试剂条检测方法一致。
权利要求
1.一种添有扩增内标的沙门氏菌PCR检测方法，其特征在于，具体步骤如下(1)利用沙门氏菌自身的特异基因序列构建扩增内标，设计特异引物；(2)首先，根据引物设计时推荐的Tm值，在Tm±5℃范围内以1℃间隔设置温度梯度，根据扩增产物在电泳图中的亮度来选择退火温度，在确定退火温度后，在反应体系中选择PCR反应体系的Mg2+浓度；(3)进行PCR检测，选择PCR的检测灵敏度，然后，取带有扩增内标的载体，添加到PCR反应体系中，反应体系中添加不同稀释浓度的扩增内标，再次，检测DNA或菌株的灵敏度，选择对检测灵敏度影响最小且能够明确指示假阴性的扩增内标的浓度作为添加浓度；(4)提取不同血清型的沙门氏菌标准菌株和不同种属的非沙门氏菌标准菌株的DNA，进行PCR检测，确定引物的特异性及扩增内标在非沙门氏菌样品检测中是否能够正常扩增；(5)通过检测人工污染样品判断扩增内标是否指示假阴性；检测自然污染样品，同时采用国标方法和API试剂条的检测结果进行参比，来评价建立的PCR检测体系的检测结果是否准确。
2.根据权利要求1所述的添有扩增内标的沙门氏菌PCR检测方法，其特征是，所述的选择PCR反应体系的Mg2+浓度，是指在反应体系中设置间隔0.5mmol/L的Mg2+浓度梯度，从1.0mmol/L到3.0mmol/L，同样根据扩增产物在电泳图中的亮度来选择Mg2+浓度。
3.根据权利要求1所述的添有扩增内标的沙门氏菌PCR检测方法，其特征是，所述的选择PCR的检测灵敏度，是指经过测定的沙门氏菌总DNA溶液用无菌水作10倍梯度稀释至10-10，以稀释的DNA溶液为模板，分别取5μL加入PCR反应体系进行PCR检测，同时以无菌水代替DNA模板作阴性对照，再选择PCR的检测灵敏度。
4.根据权利要求1所述的添有扩增内标的沙门氏菌PCR检测方法，其特征是，所述的人工污染样品的检测，是指采集80份人为污染严重的牛乳样品，每份取25mL，移入225mL的BPW液体培养基中，在37℃的摇床中增菌，并且在增菌8h后取样，每份样品取样1mL，放入1.5mL离心管中，3000r/min离心10min，沉淀培养物中的食品残渣。取上清液，12000r/min离心5min，收集沙门氏菌菌体，倒去上清液后，用无菌双蒸水重新悬浮菌体，离心洗涤三次。然后加入100μL无菌超纯水，在沸水浴中煮10min，从沸水浴中取出后，立即在-20℃放置30min，在37℃解冻后，12000r/min离心5min，上清液为PCR模板DNA溶液，分别取5μL加入PCR反应体系，进行PCR检测，同时以无菌水代替DNA模板作阴性对照。
5.根据权利要求1所述的添有扩增内标的沙门氏菌PCR检测方法，其特征是，所述的自然污染食品样品的检测，是指采集了50个鸡蛋，每个鸡蛋取25mL，移入25mL灭菌生理盐水中，匀浆，取25mL样品均液接入100mL氯化镁孔雀绿增菌液和100mL亚硝酸盐胱氨酸增菌液进行选择性增菌培养，接入亚硝酸盐胱氨酸增菌液的样品在36℃培养8h后，从每份样品中取样1mL，进行PCR检测，在选择性增菌培养24h后，再经亚硫酸铋琼脂平板和DHL琼脂平板分离，从两种选择性平板上调取可疑菌落，用生化试验和API试剂条进一步检测和鉴定。
6.根据权利要求1所述的添有扩增内标的沙门氏菌PCR检测方法，其特征是，所述的构建扩增内标，是指利用沙门氏菌自身的特异基因序列构建扩增内标，减少了沙门氏菌之外的其他生物的DNA对PCR检测的干扰，同时也避免了扩增内标对目的基因的同源交联干扰。使扩增内标降低对目的基因在检测过程中的干扰，增加检测的准确率。
7.根据权利要求1或者6所述的添有扩增内标的沙门氏菌PCR检测方法，其特征是，所述的扩增内标，扩增的方法，具体如下采用序列分析、基因比对的手段选择用于构建沙门氏菌PCR检测的扩增内标的特异基因序列，并与检测的目的基因的同源性极低；采用基因克隆的手段将选定的基因序列的两端分别连接检测引物，构建成扩增内标，并克隆到载体中；采用转基因方法转移上述带有扩增内标的载体到大肠杆菌中，然后涂布于选择性平板上，37℃培养12h。用灭菌的牙签从选择性平板上挑取白色菌落，接菌到容有5ml LB培养液的试管中，再在37℃下以150r/min培养6h，提取质粒pMD-stn的DNA，经PCR扩增后，确定获得转化子。
8.根据权利要求1所述的添有扩增内标的沙门氏菌PCR检测方法，其特征是，所述的特异引物，是指一对用于沙门氏菌的PCR检测的检测引物，进行PCR检测时，其能扩增到沙门氏菌属菌株特有的检测基因，或者是PCR体系中添加的扩增内标；还有两对用于构建扩增内标的扩增引物和长引物，扩增引物只能扩增到用于构建扩增内标的DNA片段，而长引物通过PCR扩增和基因克隆等手段获得扩增内标。
9.根据权利要求1或者7所述的添有扩增内标的沙门氏菌PCR检测方法，其特征是，所述的载体，其转化的宿主细胞，其中包含有扩增内标的DNA片段。
10.根据权利要求1所述的添有扩增内标的沙门氏菌PCR检测方法，其特征是，所述的假阴性，是指PCR反应受到了食品或培养基等物质中存在的抑制剂的影响而没有发生反应，或者是由于操作人员的操作失误导致结果呈现阴性。
全文摘要
本发明涉及的是食品安全技术领域的一种添有扩增内标的沙门氏菌PCR检测方法。本发明具体步骤如下(1)设计特异引物。(2)通过对MgCl
文档编号C12Q1/04GK101045943SQ20071004000
公开日2007年10月3日 申请日期2007年4月26日 优先权日2007年4月26日
发明者史贤明, 刘斌, 施春雷, 向雪菲 申请人:上海交通大学