专利名称：一种香菇45菌种的分子特异标记及其获得方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种香菇45菌种的分子特异标记及其获得方法与应用。
背景技术：
我国香菇产量已从1983年的1.95万吨迅速发展到2005年的242万吨，占全球香菇总产量的70％以上，改写了世界食用菌产量的排行榜，并不断缩小与排行第一的双孢蘑菇产量差距，有专家预测，由于中国香菇产业的迅猛发展，在近10年内其将成为世界产量最高的食用菌。中国香菇以其惊人的发展速度，优质的品质及低廉的成本为世界菇业人士瞩目，中国香菇已风靡世界。
优质菌种在香菇单产和质量中的贡献率举足轻重，这决定了香菇菌种在香菇产业中的重要地位。1999年我国签署了《国际植物新品种保护法》，这不仅要求我们尊重其它国家的品种知识产权，同时也要加强保护我们国家自己的品种知识产权，为了建立食用菌新品种登记制度来真正保护我国的品种产权，必须首先建立成熟的品种鉴定技术，为新品种登记奠定基础。尤其日本2004年4月1日开始实行《种苗法修正案》，对我国食用菌尤其是香菇的出口构成了极大的威胁。就国内而言，香菇栽培菌种“同种异名，异种同名”的现象，不仅给菇农带来了极大的损失，影响了他们的栽培积极性，也极大地影响了中国香菇的快速发展；而且，随着大规模的工厂化栽培方式的出现，对香菇栽培菌株质量的要求越来越高，需要发展更为简便、快速、准确的菌株鉴定技术，以保证每批次的用种都准确无误。
随着分子生物学技术的快速发展，特别是分子标记和基因标记技术的建立与成熟，为发展简便、快速、准确的菌株鉴定技术提供了有效手段。SCAR(Sequence CharacterizedAmplified Region)标记是一种十分稳定的分子标记，在应用上具有迅速、简便、低成本的特点，本发明建立了香菇45菌种的SCAR分子标记，能对香菇45菌种进行快速鉴定。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为了能对香菇45菌种进行简便、快速、准确的鉴定和检测，提供了一种香菇45菌种的分子特异标记，同时提供了这种香菇45菌种的分子特异标记的获得方法。
本发明提供的一种香菇45菌种的分子特异标记为604bp大小的特异片段，其特异性PCR扩增引物对序列为5’GCCCTTCAGCTAACCCAAA 3’和5’CTTCCCGTCGTACACTCG 3’。
本发明的一种香菇45菌种的分子特异标记的获得方法，包括下列步骤(1)菌丝培养和基因组DNA的提取将低温保藏的香菇菌种转接到PDA斜面上，25℃培养活化。两周后接到100mL PD液体培养基中，25℃100r/min振荡培养两周，收集菌丝，用改进的CTAB法提取基因组DNA香菇。
(2)菌株45的特异DNA片断的获得采用PCR技术，经过大量的筛选试验，在采用随机引物(引物序列TGCGCCCTTC获得了香菇菌株45的特异DNA片断，分子量为613bp，将该片段克隆测序。
(3)特异PCR扩增引物的获得以得到的DNA序列为基础，设计特异PCR扩增引物，引物对的序列5’GCCCTTCAGCTAACCCAAA 3’和5’CTTCCCGTCGTACACTCG 3’。
(4)用特异PCR扩增引物对对45菌株进行SCAR-PCR扩增。
扩增体系总体积为25μL，10×PCR buffer 2.5μL，25mmol/L MgCL22μL，10mmol/LdNTP 0.25L，2.5U/μL Taq DNA酶0.5μL，10μmol/L 45菌株检测专用引物对各1μL，模板DNA 1μL(浓度1ng～10ng/μL)，ddH2O 18.6μL。PCR反应条件94℃ 1min；94℃15second，61℃15second，72℃1min，30个循环；72℃5min。
(5)电泳检测可见604bp大小的特异片段(图1)。而其它香菇菌种均未见特异性片断。
对114(为生产用种)个收集自全国各地的香菇生产用菌种及少数野生种共164个菌株进行SCAR扩增。164个菌种中只有45菌株扩增出分子量为604bp的专一扩增条带。
根据采用这一对特殊引物进行PCR扩增，以能否产生604bpDNA片段作为对香菇45菌株进行鉴定和检测的依据。
该检测方法与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比，具有检测时间短，准确性高的优点。该检测所需时间只需要2-3天，而常规的拮抗试验所需时间至少需要两周时间，出菇试验则需要至少3个月的时间。
图1 SCAR-PCR扩增电泳图17为45菌株(日本)，箭头所示为香菇45菌株扩增出分子量约为604bp的特殊DNA条带，其余编号为其它香菇菌株。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1菌丝培养和基因组DNA的提取将低温保藏的香菇45菌种转接到PDA斜面上，25℃培养活化。两周后接到100mL PD液体培养基中，25℃100r/min振荡培养两周，收集菌丝，放入-20℃冰箱冻存。用改进的CTAB法提取基因组DNA，DNA稀释至20ng/μ L，-20℃冰箱贮藏备用。
SCAR-PCR扩增扩增体系总体积为25μL，10×PCR buffer 2.5μL，25mmol/L MgCL22μL，10mmol/LdNTP 0.25L，2.5U/μL Taq DNA酶0.5μL，10μmol/L 45菌株检测专用引物对(5’GCCCTTCAGCTAACCCAAA 3’和5’CTTCCCGTCGTACACTCG 3’)各1μL，模板DNA1μL(浓度1ng～10ng/μL)，ddH2O 18.6μL。
PCR反应条件94℃ 1min；94℃15second，61℃15second，72℃1min，30个循环；72℃5min。
为了排除其它菌种的假阴性情况，在SCAR-PCR反应体系中加入ITS(InternalTranscribed Spacer)通用引物对(ITS1、ITS4)，验证所有模板DNA的完整性。
电泳检测取上述PCR扩增产物8μL，与1μL加样缓冲液混匀，点样于1.5％的琼醋糖凝胶上，于0.5 X TBE缓冲液中，5V/cm电压下电泳，电泳结束后，用EB染色，然后在凝胶成像仪上照相。
权利要求
1.一种香菇45菌种的分子特异标记，其特征在于特异性PCR扩增引物对序列为5’GCCCTTCAGCTAACCCAAA 3’和5’CTTCCCGTCGTACACTCG 3’；DNA片断大小为604bp。
2.一种香菇45菌种的分子特异标记的获得方法，其特征在于包括如下步骤(1)菌丝培养和基因组DNA的提取；(2)香菇菌株45的特异DNA片断的获得；(3)特异PCR扩增引物的获得；(4)用特异PCR扩增引物对对45菌株进行SCAR-PCR扩增；(5)电泳检测。
3.如权利要求2所述的一种香菇45菌种的分子特异标记的获得方法，其特征在于所述步骤(2)中香菇菌株45的特异DNA片断是通过采用PCR技术，经过大量的筛选试验，在采用随机引物获得，分子量为613bp，将该片段克隆测序。
4.如权利要求3所述的一种香菇45菌种的分子标记的获得方法，其特征在于所用随机引物序列为TGCGCCCTTC。
5.如权利要求2所述的一种香菇45菌种的分子特异标记的获得方法，其特征在于所述步骤(3)中特异PCR扩增引物通过下列方法获得以得到的DNA序列为基础，设计特异PCR扩增引物，引物对的序列如下5’GCCCTTCAGCTAACCCAAA 3’和5’CTTCCCGTCGTACACTCG 3’。
6.如权利要求2所述的一种香菇45菌种的分子特异标记的获得方法，其特征在于所述步骤(1)中菌丝培养和基因组DNA的提取包括下列步骤将低温保藏的香菇菌种转接到PDA斜面上，25℃培养活化，两周后接到100mL PD液体培养基中，25℃100r/min振荡培养两周，收集菌丝，放入-20℃冰箱冻存；用改进的CTAB法提取基因组DNA，DNA稀释至20ng/μL，-20℃冰箱贮藏备用。
7.如权利要求2所述的一种香菇45菌种的分子特异标记的获得方法，其特征在于所述步骤(4)中的SCAR-PCR扩增扩增体系总体积为25μL，扩增体系10×PCR buffer2.5μL，25mmol/L MgCL22μL，10mmol/L dNTP 0.25L，2.5U/μL Taq DNA酶0.5μL，10μmol/L 45菌株检测专用引物对各1μL，模板DNA 1μL(浓度1ng～10ng/μL)，ddH2O18.6μL，PCR反应条件94℃ 1min；94℃ 15second，61℃ 15second，72℃ 1min，30个循环；72℃ 5min。
8.如权利要求2所述的一种香菇45菌种的分子特异标记的获得方法，其特征在于所述步骤(4)中SCAR分子标记的PCR扩增反应体系中加入ITS(Internal Transcribed Spacer)，通用引物对(ITS1、ITS4)。
9.如权利要求2所述的一种香菇45菌种的分子特异标记的获得方法，其特征在于所述步骤(5)电泳检测为取步骤(4)PCR扩增产物8μL，与1μL加样缓冲液混匀，点样于1.5％的琼醋糖凝胶上，于0.5XTBE缓冲液中，5V/cm电压下电泳，电泳结束后，用EB染色，然后在凝胶成像仪上照相。
10.一种香菇45菌种的分子特异标记在香菇45菌种的快速鉴定和检测中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种香菇45菌种的分子特异标记及其获得方法和应用。本发明的香菇45菌种的分子标记DNA片断大小为604bp，特异性PCR扩增引物对序列为5′GCCCTTCAGCTAACCCAAA 3′和5′CTTCCCGTCGTACACTCG 3′。方法包括菌丝培养和基因组DNA的提取；香菇菌株45的特异DNA片断的获得；特异PCR扩增引物的获得；SCAR－PCR扩增；电泳检测。本发明的分子特异标记应用于香菇45菌种的快速鉴定和检测。
文档编号C12N15/11GK101086015SQ200710040319
公开日2007年12月12日 申请日期2007年4月29日 优先权日2007年4月29日
发明者宋春艳, 谭琦, 陈明杰, 尚晓冬, 潘迎捷 申请人:上海市农业科学院食用菌研究所