专利名称：链球菌DNA疫苗pcDNA3.1－GapC及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种链球菌DNA疫苗pcDNA3.1-GapC及其制备方法。
背景技术：
近年来，随着基因治疗技术的发展DNA疫苗得到了广泛的关注。DNA疫苗(DNAVaccine)又称基因疫苗(Genetic Vaccine)或“裸”DNA疫苗，它是由插入有一种或多种外源抗原基因的质粒DNA和真核启动调控等基因元件构成。与传统的疫苗相比，DNA疫苗有很多独到的优势外源抗原的表达与病毒自然感染相似，均为胞内表达，表达的产物能够进行翻译后修饰；具有与天然抗原相同的构象和免疫原性，可以同时激发机体产生细胞免疫、体液免疫和粘膜免疫应答，而且不受母源抗体的干扰；结构简单，制备方便，易于标准化；安全性好，无副作用，也没有减毒活疫苗毒力返强的危险性；稳定性好，易于保存和运输；能够克服新生动物由于免疫系统发育不完全而导致的免疫力低下的缺陷；可将编码不同抗原的基因构建在同一个质粒中，或将携带不同抗原基因的多种重组质粒联合应用，制备多价疫苗或联苗。
发明目的本发明的目的之一在于提供一种链球菌DNA疫苗pcDNA3.1-GapC。
本发明的目的之二在于提供该链球菌DNA疫苗的制备方法。
为达到上述目的，本发明选取广泛存在于链球菌表面的脱氢酶GapC作为外源抗原基因和真核表达质粒pcDNA3.1作为载体，构建DNA疫苗pcDNA3.1-GapC。GapC具有3-磷酸甘油醛脱氢酶活性，可以与血纤维蛋白溶酶结合，在疾病发展过程和信号传导过程中起重要作用，被认为是非常好的阻止寄生虫，真菌和细菌感染的疫苗靶点。真核表达载体pcDNA3.1含有HCMV-IE1启动子/增强子复合体、多克隆位点、BGHpolyA及氨苄青霉素抗性基因。氨苄青霉素抗性基因，含有2个可显著增强免疫效果的六寡核苷酸序列5′-AACGTT-3′，此序列含CpG结构，称为免疫激活DNA序列(ISS)，通过非特异性多克隆激活作用可激活抗原呈递细胞，可以提高核酸疫苗免疫的效果。
根据上述机理，本发明采用如下技术方案一种链球菌DNA疫苗pcDNA3.1-GapC，其特征在于该疫苗具有SEQ NO 3所示的碱基序列。
上述的链球菌DNA疫苗pcDNA3.1-GapC的编码蛋白，其特征在于具有SEQ NO4所示的氨基酸序列。
上述的链球菌DNA疫苗pcDNA3.1-GapC的制备方法，其特征在于该方法为根据停乳链球菌GapC上下游序列设计引物上游引物5’-GGGGCTAGCACCATGGTAGTTAAAGTTGGTAT-3’下游引物5’-GGGGGTACCTCATTATTTAGCGATTTTTGCAA-3’为了在上游引物中加入真核增强翻译序列Kozak序列(A/GCCATGG)，在ATG前加入ACC三个碱基.下游引物中加入2个连续的终止密码子；以停乳链球菌基因组DNA为模板，加入上游引物和下游引物进行PCR扩增94℃变性5min，然后94℃30s，57℃1min，72℃1min，循环30次，72℃复性10min，得到GapC基因；然后用NheI，KpnI双酶切后，与同样用NheI，KpnI双酶切的pcDNA3.1载体连接，构建重组载体pcDNA3.1-GapC。
DNA疫苗作为新型的第三代疫苗，与传统的灭活疫苗、亚单位疫苗和基因工程疫苗相比，DNA疫苗具有如下优点①免疫保护力增强；②制备简单，省时省力；③同种异株交叉保护；④应用较安全；⑤产生持久免疫应答；⑥贮存、运输方便；⑦可用于防治肿瘤。具有广阔的发展前景。
本发明所构建的DNA疫苗免疫小鼠后，能诱导机体产生体液免疫反应和细胞免疫反应。
图1为链球菌DNA疫苗pcDNA3.1-GapC的构建流程图。
图2为PCR获取的GapC基因和DNA疫苗pcDNA3.1-GapC的双酶切鉴定图。其中1表示pcDNA3.1-GapC用NheI和KpnI双酶切，2表示PCR扩增得到的GapC基因，3表示marker(bp)。
图3为高密度培养pcDNA3.1-GapC/DH5α的生长曲线图。
图4为链球菌DNA疫苗pcDNA3.1-GapC的小鼠体液免疫效果图。
具体实施方案
实施例一DNA疫苗pcDNA3.1-GapC构建以及基因工程重组菌pcDNA3.1-GapC/DH5α的制备根据停乳链球菌GapC上下游序列设计引物上游引物5’-GGGGCTAGCACCATGGTAGTTAAAGTTGGTAT-3’下游引物5’-GGGGGTACCTCATTATTTAGCGATTTTTGCAA-3’为了在上游引物中加入真核增强翻译序列Kozak序列(A/GCCATGG)，在ATG前加入ACC三个碱基.下游引物中加入2个连续的终止密码子。
以停乳链球菌基因组DNA为模板，加入上游引物和下游引物进行PCR扩增，94℃变性5min，然后94℃30s，57℃1min，72℃1min，循环30次，72℃复性10min，得到GapC基因.然后用NheI，KpnI双酶切后，与同样用NheI，KpnI双酶切的pcDNA3.1载体连接，构建重组载体pcDNA3.1-GapC，转化大肠杆菌DH5α后涂布于含有氨卞青霉素的平板上，菌落PCR法筛选阳性克隆，制备基因工程重组菌pcDNA3.1-GapC/DH5α。筛选出的阳性克隆培养后提取质粒，PCR获取的GapC基因和重组质粒的双酶切鉴定图，参见图2。
以停乳链球菌基因组DNA为模板PCR得到1Kbp左右大小的片段，NheI，KpnI双酶切重组质粒，得到1017bp和5.4kb大小的片段，与预期结果相符。DNA序列测定表明，插入的GapC基因的序列正确。结果证明重组质粒pcDNA3.1-GapC构建完全正确。
实施例二基因工程重组菌的高密度培养以及大规模纯化质粒取上述基因工程菌接入3ml LB培养基活化后以2％接种量接种于含200mlLB培养基的500ml三角烧瓶中，37℃200r/min培养8h，按培养罐工作体积的4％接种(起始体积6L)，37℃培养，用氨水控制pH在7左右，起始搅拌速度为300rpm，空气流量为4L/min及罐压为0.4atm，用转速控制DO在40％。当DO上升时，开始流加补料50ml，培养至12h时，4800rpm/min离心回收菌体。每250ml培养物用150ml用冰预冷的STE重悬后，4℃，8000rpm离心6min，弃上清，菌体存-20于℃；取一定量的菌体用300ml溶液I重悬，OD为10左右；加入600ml新配置的溶液II，温和颠倒4-6次混匀，室温放置5-10min；加入300ml用冰预冷的的溶液III，温和颠倒4-6次混匀，冰上放置10min；10000rpm离心30min，弃沉淀，上清用纱布过滤；加入0.6倍体积异丙醇，室温放置10min；室温(25℃)12000g离心15min；小心弃上清，倒置于纸巾上，去除残余上清；室温70％乙醇刷洗管底及管壁，弃乙醇，用1ml枪小心吸去残余乙醇；将离心管倒置在纸巾上，室温干燥10-15min(不要过长)；30mlTE溶解，冰浴至0℃；加入30ml5mol/LLiCl，混匀，4℃12000g离心10min；弃沉淀，上清加等体积异丙醇，混匀，室温(25℃)12000g离心10min；室温70％乙醇刷洗管底及管壁，弃乙醇重；将离心管倒置在纸巾上，室温干燥数分钟，不要过长，保持核酸沉淀湿润；2ml含20μg/mlRNase的TE(PH8.0)溶解沉淀，移至1.5ml离心管中；室温放置30min；用等量酚氯仿抽提一次，如发现蛋白过多，可以多抽提几次然后再用氯仿抽提一次；加0.1倍体积3mol/L乙酸钠(PH5.2)及两倍体积乙醇(注意次序)沉淀DNA；质粒DNA沉淀用1ml灭菌水溶解，再加入0.5mlPEG-MgCl2溶液；室温沉淀15min，再室温最大转速离心20min；沉淀用0.5ml用70％乙醇重悬，除去痕量PEG，室温最大转速离心10min；室温晾干20min；2mlTE(PH8.0)溶解，-20℃保存。
参见图3，基因工程重组菌pcDNA3.1-GapC/DH5α在培养12小时后，OD600为5.6，在接种4小时后，即进入流加阶段，OD600有着明显上升，进入对数生长期。结果显示只需要12小时的高密度培养就可以收获大量的菌体以用来制备DNA疫苗。用紫外分光光度法测定大规模提取的重组质粒浓度和纯度，其测定结果见下表1表1紫外分光光度法测定的大规模提取的重组质粒浓度和纯度
结果显示质粒A260/A280值在1.80～1.90之间，表明质粒纯度好，可以用于基因免疫用。
实施例三DNA疫苗pcDNA3.1-GapC的小鼠免疫结果检测1.DNA疫苗pcDNA3.1-GapC的小鼠体液免疫结果检测将BALB/c小鼠分为pcDNA3.1-GapC和pcDNA3.1两组，每组5只。将质粒浓度调整为1mg/ml，每只肌肉注射100ul质粒溶液，在第一次免疫后第2，4周各加强免疫一次，然后在第10周再加强免疫一次。每隔2周取血清稀释100倍，ELISA检测GapC抗体以鉴定DNA疫苗的体液免疫效果，结果见图4。
免疫6周后，pcDNA3.1-GapC组小鼠血清开始出现GapC抗体，并呈现逐渐上升的趋势，在第8周后上升缓慢，在第10周后，也就是第四次免疫后，小鼠血清中的GapC抗体陡然上升。在第12周时，ELISA测定稀释100倍血清中的GapC抗体的0D490值可以达到0.4左右，明显高于pcDNA3.1组(P＜0.01)。结果显示，DNA疫苗pcDNA3.1-GapC能够诱导小鼠产生体液免疫效果。
2.DNA疫苗pcDNA3.1-GapC的小鼠细胞免疫结果检测在12周时，杀死小鼠取脾细胞，用含100mL/L FCS的RPMI1640调整细胞密度为5×106/ml，活细胞数在90％以上，200uL/孔加入96孔细胞培养板中。实验组每孔加入10ugGapC，对照孔不加，阳性对照孔加入10ug刀豆素，调零孔不加淋巴细胞，于50mL/L CO2孵箱中37℃培养68h。MTT法测定活细胞数，结果用刺激指数SI表示(SI＝A实验组/对照组)以测定DNA疫苗的细胞免疫结果。
脾细胞增殖试验如下表2所示表2
pcDNA3.1-GapC免疫小鼠可以诱导明显的特异性淋巴细胞增殖，SI为1.406±0.360，与空载质粒免疫小鼠相比有明显差异(P＜0.01)。结果显示，DNA疫苗pcDNA3.1-GapC能诱导小鼠产生细胞免疫应答。
序列表<110>上海大学<120>链球菌DNA疫苗pcDNA3.1-GapC、其制备方法以及基因工程重组菌pcDNA3.1-GapC/DH5α的表达<140>
<141>
<160>4<210>1<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<222>
<223>
<400>1GGG GCT AGC ACC ATG GTA GTT AAA GTT GGT AT<210>2<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<222>
<223>
<400>2GGG GGT ACC TCA TTA TTT AGC GAT TTT TGC AA
<210>3<211>1014<212>DNA<213>人工序列<220>
<222>
<223>
<400>3ATGGTAGTTAAAGTTGGTATTAACGGTTTCGGTCGTATCGGACGTCTTGCATTCCGTCGTATTCAAAATGTTGAAGGTGTTGAAGTAACTCGTATCAACGACCTTACAGATCCAAACATGCTTGCACACTTGTTGAAATACGATACAACTCAAGGACGTTTTGACGGAACTGTTGAAGTTAAAGAAGGTGGATTTGAAGTAAACGGAAACTTCATCAAAGTTTCTGCTGAACGTGATCCAGAAAACATCGACTGGGCAACTGACGGTGTTGAAATCGTTCTGGAAGCAACTGGTTTCTTTGCTAAAAAAGAAGCTGCTGAAAAACACTTACATGCTAACGGTGCTAAAAAAGTTGTTATCACAGCTCCTGGTGGAAACGACGTTAAAACAGTTGTTTTCAACACTAACCACGACATTCTTGACGGTACTGAAACAGTTATCTCAGGTGCTTCATGTACTACAAACTGTTTAGCTCCTATGGCTAAAGCTCTTCACGATGCATTTGGTATCCAAAAAGGTCTTATGACTACAATCCACGCTTATACTGGTGACCAAATGATCCTTGACGGACCACACCGTGGTGGTGACCTTCGTCGTGCTCGTGCTGGTGCTGCAAACATTGTTCCTAACTCAACTGGTGCTGCTAAAGCTATCGGTCTTGTTATCCCAGAATTGAATGGTAAACTTGATGGTGCTGCACAACGTGTTCCTGTTCCAACTGGATCAGTAACTGAGTTGGTTGTAACTCTTGATAAAAACGTTTCTGTTGACGAAATCAACGCTGCTATGAAAGCTGCTTCAAACGACAGTTTCGGTTACACTGAAGATCCAATTGTTTCTTCAGATATCGTAGGCGTGTCATACGGTTCATTGTTTGACGCAACTCAAACTAAAGTTATGGAAGTTGACGGATCACAATTGGTTAAAGTTGTATCATGGTATGACAATGAAATGTCTTACACTGCTCAACTTGTTCGTACACTTGAGTATTTTGCAAAAATCGCTAAATAATGA 1014<210>4<211>336<212>PRT<213>停乳链球菌(Streptococcus dysgalactiae)<220>
<222>
<223>
<400>4MVVKVGINGFGRIGRLAFRRIQNVEGVEVTRINDLTDPNMLAHLLKYDTTQGRFDGTVEVKEGGFEVNGNFIKVSAERDPENIDWATDGVEIVLEATGFFAKKEAAEKHLHANGAKKVVITAPGGNDVKTVVFNTNHDILDGTETVISGASCTTNCLAPMAKALHDAFGIQKGLMTTIHAYTGDQMILDGPHRGGDLRRARAGAANIVPNSTGAAKAIGLVIPELNGKLDGAAQRVPVPTGSVTELVVTLDKNVSVDEINAAMKAASNDSFGYTEDPIVSSDIVGVSYGSLFDATQTKVMEVDGSQLVKVVSWYDNEMSYTAQLVRTLEYFAKIAK33权利要求
1.一种链球菌DNA疫苗pcDNA3.1-GapC，其特征在于该疫苗具有SEQ NO 3所示的碱基序列。
2.根据权利要求1所述的链球菌DNA疫苗pcDNA3.1-GapC的编码蛋白，其特征在于具有SEQ NO 4所示的氨基酸序列。
3.一种根据权利要求1所述的链球菌DNA疫苗pcDNA3.1-GapC的制备方法，其特征在于该方法为根据停乳链球菌GapC上下游序列设计引物上游引物5’-GGGGCTAGCACCATGGTAGTTAAAGTTGGTAT-3’下游引物5’-GGGGGTACCTCATTATTTAGCGATTTTTGCAA-3’为了在上游引物中加入真核增强翻译序列Kozak序列(A/GCCATGG)，在ATG前加入ACC三个碱基.下游引物中加入2个连续的终止密码子；以停乳链球菌基因组DNA为模板，加入上游引物和下游引物进行PCR扩增94℃变性5min，然后94℃30s，57℃1min，72℃1min，循环30次，72℃复性10min，得到GapC基因；然后用NheI，KpnI双酶切后，与同样用NheI，KpnI双酶切的pcDNA3.1载体连接，构建重组载体pcDNA3.1-GapC。
全文摘要
本发明涉及生物新技术领域，特别是一种链球菌DNA疫苗构建，制备以及其免疫效果检测。将停乳链球菌的GapC基因插入到载体pcDNA3.1中构建DNA疫苗pcDNA3.1－GapC，并制备基因工程重组菌pcDNA3.1－GapC/DH5α。高密度培养上述基因工程重组菌，并大规模制备上述DNA疫苗。所构建的DNA疫苗免疫小鼠后，能诱导机体产生针对GapC的抗体和细胞免疫反应。
文档编号C12N15/31GK101066464SQ200710041199
公开日2007年11月7日 申请日期2007年5月24日 优先权日2007年5月24日
发明者陈宇光, 陈涛, 沈彦萍 申请人:上海大学