专利名称：双酶法制备低分子量胡芦巴半乳甘露聚糖的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种利用双酶法制备低分子量胡芦巴半乳甘露聚糖的方法。
背景技术：
胡,巴种子内胚乳(又称胡芦巴胶)的主要化学成分为半乳甘露聚糖， 已经有文献报道，胡芦巴半乳甘露聚糖可降低胆固醇和非胰岛素依赖型糖尿
病患者的血糖水平，还可抑制人体对脂肪的吸收，起到减肥作用。如Madar 等人的报道(Polysaccharides composition of gelfraction derived from fenugreek and its effect on starch digestion and bile acid absorption in r.ats. J Agric food Chem， 1990， 38: 1535 — 159 )由种子提取的胶凝 部分含有大量的半乳甘露聚糖，正常鼠服后，体内的血糖水平会有显著降低， 胶凝成分的强吸水力，缩短过渡时的能力以及抑制空腹效果是其降血糖功效 的主要原因。
胡,巴豆胶具有中性的非离子性质，在冷水和热水中均能形成胶体溶 液，任何分子量的胡声巴胶在低浓度时都可以在水中溶胀，但由于胡,巴胶 分子量较大，黏均分子量约为54万，溶解性差，较稀的水溶液仍有较高的粘 度，在食品和药品领域的应用具有很大的局限性。而低分子量的胡芦巴胶可 以在较高浓度时也溶于水，且具有比大分子量胡,巴胶更好的生物相容性， 所以制备低分子量的胡,巴胶以达到降低水溶液黏度、提高溶解性的目的， 对于其应用于食品、医药等方面具有重要意义。
现有的降解大分子多糖的方法主要包括化学降解法、酶降解法和物理降 解法。化学降解法条件要求苛刻，设备腐蚀严重，环境污染突出，且降解产 物的分子量分布较难控制；物理降解法的局限性较高，只适于在浓度极低的 状态下进行；而酶解法则能很好地克服这些缺点，是较为理想的途径。此种 方法可分为专一性酶降解法和非专一性酶降解法两种，根据缪月秋等人的报 道(胡芦巴中性杂多糖酶解工艺优化及其产物对青春双歧杆菌增殖作用的研 究，安徽农业大学学报，2006， " (2): 238 ~ 242 )利用专一性酶p-甘露聚
糖酶对胡f巴胶进行降解，此法由于酶的提取、分离和纯化困难，成本高， 目前工业化生产有很大困难。非专一性酶是指对胡芦巴胶有降解作用的纤维 素酶及普鲁兰酶等，其具有酶来源丰富，成本低，降解条件温和、环境污染 小、反应过程和降解产物分子量分布易于控制、选择性好、产物质地疏松易 于研磨等优点。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种新的高效降 解胡,巴胶的简单的方法，即用纤维素酶和普鲁兰酶联合降解胡,巴胶制备 低分子量胡芦巴半乳甘露聚糖的方法。
本发明通过下述技术方案实现
一种双酶法制备低分子量胡,巴半乳甘露聚糖的方法，其特征在于，包 括下述步骤
步骤一用緩冲溶液配制胡,巴半乳甘露聚糖溶液，加入纤维素酶，控制降 解温度及时间进行降解。
步骤二终止降解后经乙醇沉淀，静置，过滤，得纤维素酶降解产物。
步骤三用緩冲溶液将步骤一降解产物配制成溶液，加入普鲁兰酶，控制降
解温度及时间进行降解。
步骤四终止降解后，进行脱蛋白处理。
步骤五经乙醇沉淀，静置，过滤，洗涤，真空干燥，得双酶降解后的产物 胡声巴半乳甘露聚糖，测定该产物黏均分子量。
所述步骤一中緩冲溶液为0.2mol/mL乙酸-乙酸钠緩冲溶液，pH值为 4.0-5.5，胡,巴胶溶液浓度为0.5~1.5%，溶胀时间为10~ 120min，水浴 加热后，加入纤维素酶的量为500 - 5000U,降解温度为40~50°C,降解时 间为1 ~4h。
步骤二中醇沉所用浓度为95%的食用酒精，它与浓缩液的体积比为5~ 10:1，静置24小时，过滤后，收集沉淀。
步骤三中所述緩冲溶液为0.1-0. 2mol/mL磷酸氢二钠-柠檬酸緩冲溶 液，pH值为4.0~6.0，溶液浓度为0.5-1.5%,溶月长时间为10~ 120min,水 浴加热后，加入普鲁兰酶的量为1000 ~ 5000ASPU,降解温度为50~ 65。C，
降解时间为1 ~ 8h。
步骤四中脱蛋白处理是指向步骤三的水解液中加入等体积的1 ~ 8%三氯 乙酸溶液，室温静置4-12h后过滤，弃去沉淀，之后所得上清液再按照上 述方法再处理一次。
步骤五中的要求与步骤四相同，收集过滤后的沉淀用无水乙醇、丙酮洗 涤，沉淀真空千燥，得经双酶法降解后的低分子量胡芦巴半乳甘露聚糖，利 用乌式黏度计测定产物黏均分子量。
本发明具有下述技术效果
1. 本发明改传统的化学降解法、物理降解法及专一性酶解法为非专一性酶解 法，即利用纤维素酶及普鲁兰酶进行降解，即克服了化学及物理降解法的缺 点，又降低了成本。
2. 本发明利用纤维素酶特异性切割P-1,4糖苷键从而可以切断胡芦巴胶分 子主链而达到降解的目的。
3. 本发明利用普鲁兰酶特异性切割a-l，6糖苷键从而可以切断胡芦巴胶分 子侧链而达到降解的目的。
4. 本发明改传统的利用一种酶进行降解的方法为利用双酶法进行降解，即从 胡芦巴胶的分子结构入手，同时作用于主链与侧链，达到降解的目的。
胡芦巴半乳甘露聚糖，克服了产物分子量分布广，干燥时间长的缺点。
具体实施例方式
以下结合具体实施例对本发明详细说明。 双酶法制备低分子量胡,巴半乳甘露聚糖的方法如下 将胡芦巴胶精粉0. 5 ~ 1. 5g溶于lOOmLO. 2mol/mL乙酸-乙酸钠緩冲溶 液，用pH计调pH值为4.0-5.5，溶胀10 120niin，将溶液置于三颈瓶中， 边搅拌边水浴加热至降解温度为40~ 5G。C，加入纤维素酶5GG 5QGGU,降 解时间为l~4h。反应终止后，将上述水解液逐渐滴入到大量的95%食用酒 精(水解液与95%食用酒精的体积比为1:5-10)中沉淀，静置24小时， 过滤，弃去上清液，将沉淀0. 5 ~ 1. 5g溶于lOOmLO. 1 ~ 0. 2mol/mL磷酸氲二
钠-柠檬酸緩冲溶液，用pH计调pH值为4. 0 ~ 6. 0，溶胀10 ~ 120min,将溶液
置于三颈瓶中，边搅拌边水浴加热至降解温度为50~65°C，加入普鲁兰酶
的量为1000 ~ 5000ASPU,降解时间为l~8h。反应终止后，将上述水解液于
等体积1~8%三氯乙酸混合静止4~12小时，离心除去沉淀，并重复一次。
将上清液逐渐滴入到大量的95%食用酒精(水解液与95%食用酒精的体积
比为1:5-10)中沉淀，静置24小时，过滤，弃去上清液，滤饼用无水乙醇
及丙酮各洗涤一次，过滤后沉淀真空干燥，得低分子量胡芦巴半乳甘露聚糖，
黏均分子量为40000 - 55000。 实施例1
将胡芦巴胶精粉0. 5g溶于lOOmLO. 2mol/mL乙酸-乙酸钠緩沖溶液，用 pH计调pH值为4.4,溶胀10min,将溶液置于三颈瓶中，边搅拌边水浴加 热至降解温度为4(TC，加入纤维素酶500U，降解时间为1.5h。反应终止后， 将上述水解液逐渐滴入到大量的95%食用酒精(水解液与95%食用酒精的 体积比为1:5)中沉淀，静置24小时，过滤，弃去上清液，将沉淀1.5g溶 于lOOmLO. 1 ~ 0. 2mol/mL磷酸氢二钠-柠檬酸緩冲溶液，用pH计调pH值为
4. 6,溶胀10min,将溶液置于三颈瓶中，边搅拌边水浴加热至降解温度为55
。C，加入普鲁兰酶的量为1500ASPU，降解时间为2h。反应终止后，将上述
水解液于等体积1%三氯乙酸混合静止12小时，离心除去沉淀，并重复一次。
将上清液逐渐滴入到大量的95%食用酒精(水解液与95%食用酒精的体积
比为1:5)中沉淀，静置24小时，过滤，弃去上清液，滤饼用无水乙醇及丙
酮各洗涤一次，过滤后沉淀真空干燥，得低分子量胡芦巴半乳甘露聚糖，黏
均分子量为55000。 实施例2
将胡，巴胶精粉0. 8g溶于lOOmLO. 2mol/mL乙酸-乙酸钠緩沖溶液，用 pH计调pH值为5. 0,溶胀20min，将溶液置于三颈^f瓦中，边搅拌边水浴加 热至降解温度为5(TC,加入纤维素酶1000U，降解时间为2h。反应终止后， 将上述水解液逐渐滴入到大量的95%食用酒精(水解液与95%食用酒精的 体积比为1:6)中沉淀，静置24小时，过滤，弃去上清液，将沉淀1.2g溶 于lOOmLO. 1 ~ 0. 2mol/mL磷酸氢二钠-柠檬酸緩冲溶液，用pH计调pH值为
5. 2，溶胀20min,将溶液置于三颈瓶中，边搅拌边水浴加热至降解温度为60
。C，加入普鲁兰酶的量为1500ASPU,降解时间为3h。反应终止后，将上述
水解液于等体积2%三氯乙酸混合静止10小时，离心除去沉淀，并重复一次。
将上清液逐渐滴入到大量的95%食用酒精(水解液与95%食用酒精的体积
比为1:6)中沉淀，静置24小时，过滤，弃去上清液，滤饼用无水乙醇及
丙酮各洗涤一次，过滤后沉淀真空干燥，得低分子量胡,巴半乳甘露聚糖，
黏均分子量为52000。 实施例3
将胡,巴胶精粉1. 0g溶于lOOmLO. 2mol/mL乙酸-乙酸钠緩冲溶液，用
pH计调pH值为5.4，溶胀40min,将溶液置于三颈瓶中，边搅拌边水浴加
热至降解温度为45。C，加入纤维素酶2000U,降解时间为3h。反应终止后，
将上述水解液逐渐滴入到大量的95 %食用酒精(水解液与95 %食用酒精的
体积比为1:7)中沉淀，静置24小时，过滤，弃去上清液，将沉淀l. Og溶
于lOOmLO. 1 ~ 0. 2mol/mL磷酸氢二钠-柠檬酸緩沖溶液，用pH计调pH值为
5.8，溶胀40min，将溶液置于三颈瓶中，边搅拌边水浴加热至降解温度为65
。C,加入普鲁兰酶的量为2500ASPU,降解时间为4h。反应终止后，将上述
水解液于等体积3%三氯乙酸混合静止8小时，离心除去沉淀，并重复一次。
将上清液逐渐滴入到大量的95%食用酒精(水解液与95%食用酒精的体积
比为1:7)中沉淀，静置24小时，过滤，弃去上清液，滤饼用无水乙醇及
丙酮各洗涤一次，过滤后沉淀真空干燥，得低分子量胡,巴半乳甘露聚糖，
翻均分子量为50000。 实施例4
将胡,巴胶精粉1. 2g溶于lOOmLO. 2mol/mL乙酸-乙酸钠緩冲溶液，用 pH计调pH值为5.0，溶胀60min,将溶液置于三颈瓶中，边搅拌边水浴加 热至降解温度为45°C，加入纤维素酶3000U，降解时间为1.5h。反应终止 后，将上述水解液逐渐滴入到大量的95%食用酒精(水解液与95%食用酒 精的体积比为1: 5 )中沉淀，静置24小时，过滤，弃去上清液，将沉淀0. 8g 溶于lOOmLO. 1 ~ 0. 2mol/mL磷酸氢二钠-柠檬酸緩沖溶液，用pH计调pH值为 5. 2，溶胀60min,将溶液置于三颈瓶中，边搅拌边水浴加热至降解温度为65 。C,加入普鲁兰酶的量为2000ASPU,降解时间为2h。反应终止后，将上述 水解液于等体积4%三氯乙酸混合静止6小时，离心除去沉淀，并重复一次。
将上清液逐渐滴入到大量的95%食用酒精(水解液与95%食用酒精的体积
比为1:5)中沉淀，静置24小时，过滤，弃去上清液，滤饼用无水乙醇及
丙酮各洗涤一次，过滤后沉淀真空干燥，得低分子量胡芦巴半乳甘露聚糖，
黏均分子量为48000。 实施例5
将胡,巴胶精粉1. 5g溶于lOOmLO. 2mol/mL乙酸-乙酸钠緩冲溶液，用
pH计调pH值为5. 4，溶胀80min,将溶液置于三颈瓶中，边搅拌边水浴加
热至降解温度为40。C,加入纤维素酶5000U，降解时间为2h。反应终止后，
将上述水解液逐渐滴入到大量的95%食用酒精(水解液与95%食用酒精的
体积比为1:6)中沉淀，静置24小时，过滤，弃去上清液，将沉淀0.5g溶
于lO(hnLO. 1 ~ 0. 2mol/mL磷酸氢二钠-柠檬酸缓沖溶液，用pH计调pH值为
5. 8,溶胀80min，将溶液置于三颈瓶中，边搅拌边水浴加热至降解温度为55
。C，加入普鲁兰酶的量为2000ASPU,降解时间为4h。反应终止后，将上述
水解液于等体积5°/ 三氯乙酸混合静止4小时，离心除去沉淀，并重复一次。
将上清液逐渐滴入到大量的95%食用酒精(水解液与95%食用酒精的体积
比为1:6)中沉淀，静置24小时，过滤，弃去上清液，滤饼用无水乙醇及
丙酮各洗涤一次，过滤后沉淀真空干燥，得低分子量胡芦巴半乳甘露聚糖，
黏均分子量为49000。 实施例6
将胡,巴胶精粉1. 0g溶于lOOmLO, 2mol/mL乙酸-乙酸钠緩冲溶液，用 pH计调pH值为4. 4，溶胀100min,将溶液置于三颈瓶中，边搅拌边水浴加 热至降解温度为5(TC，加入纤维素酶1500U,降解时间为3h。反应终止后， 将上述水解液逐渐滴入到大量的95%食用酒精(水解液与95%食用酒精的 体积比为1:7)中沉淀，静置24小时，过滤，弃去上清液，将沉淀O. 8g溶 于100mL0. 1 ~ 0. 2mol/mL磷酸氢二钠-柠檬酸緩冲溶液，用pH计调pH值为 4. 6，溶胀100min，将溶液置于三颈瓶中，边搅拌边水浴加热至降解温度为 60°C,加入普鲁兰酶的量为5000ASPU,降解时间为5h。反应终止后，将上 述水解液于等体积6%三氯乙酸混合静止8小时，离心除去沉淀，并重复一 次。将上清液逐渐滴入到大量的95%食用酒精(水解液与95%食用酒精的 体积比为1:7)中沉淀，静置24小时，过滤，弃去上清液，滤饼用无水乙
醇及丙酮各洗涤一次，过滤后沉淀真空干燥，得低分子量胡芦巴半乳甘露聚
糖，黏均分子量为45000。 实施例7
将胡,巴胶精粉0. 5g溶于lOOmLO. 2mol/mL乙酸-乙酸钠緩沖溶液，用
pH计调pH值为5.4，溶胀120min,将溶液置于三颈瓶中，边搅拌边水浴加
热至降解温度为50°C，加入纤维素酶2000U，降解时间为1.5h。反应终止
后，将上述水解液逐渐滴入到大量的95 %食用酒精(水解液与95 %食用酒
精的体积比为1: 8 )中沉淀，静置24小时，过滤，弃去上清液，将沉淀1. 0g
溶于lOOmLO. 1 ~ 0. 2mol/mL磷酸氢二钠-柠檬酸緩沖溶液，用pH计调pH值为
5. 8，溶胀120min，将溶液置于三颈瓶中，边搅拌边水浴加热至降解温度为
60°C,加入普鲁兰酶的量为2500ASPU,降解时间为2h。反应终止后，将上
述水解液于等体积7%三氯乙酸混合静止10小时，离心除去沉淀，并重复一
次。将上清液逐渐滴入到大量的95%食用酒精(水解液与95%食用酒精的
体积比为1:8)中沉淀，静置24小时，过滤，弃去上清液，滤饼用无水乙
醇及丙酮各洗涤一次，过滤后沉淀真空干燥，得低分子量胡,巴半乳甘露聚
糖，黏均分子量为43000。 实施例8
将胡,巴胶精粉0. 8g溶于lOOmLO. 2mol/mL乙酸-乙酸钠緩冲溶液，用 pH计调pH值为4.4，溶胀50min,将溶液置于三颈瓶中，边搅拌边水浴加 热至降解温度为45。C，加入纤维素酶2000U，降解时间为2h。反应终止后， 将上述水解液逐渐滴入到大量的95%食用酒精(水解液与95%食用酒精的 体积比为1:9)中沉淀，静置24小时，过滤，弃去上清液，将沉淀1.2g溶 于lOOmLO. 1 ~ 0. 2mol/mL磷酸氢二钠-柠檬酸緩冲溶液，用pH计调pH值为 4.6，溶胀50min，将溶液置于三颈瓶中，边搅拌边水浴加热至降解温度为65 。C，加入普鲁兰酶的量为2500ASPU,降解时间为4h。反应终止后，将上述 水解液于等体积8°/ 三氯乙酸混合静止12小时，离心除去沉淀，并重复一次。 将上清液逐渐滴入到大量的95%食用酒精(水解液与95%食用酒精的体积 比为1:9)中沉淀，静置24小时，过滤，弃去上清液，滤饼用无水乙醇及 丙酮各洗涤一次，过滤后沉淀真空干燥，得低分子量胡，巴半乳甘露聚糖， 黏均分子量为45000。
实施例9
将胡,巴胶精粉1. 5g溶于lOOmLO. 2mol/mL乙酸-乙酸钠緩冲溶液，用 pH计调pH值为5.Q,溶胀90min，将溶液置于三颈瓶中，边搅拌边水浴加 热至降解温度为4(TC，加入纤维素酶5000U,降解时间为4h。反应终止后， 将上述水解液逐渐滴入到大量的95%食用酒精(水解液与95%食用酒精的 体积比为1:10)中沉淀，静置24小时，过滤，弃去上清液，将沉淀1.5g 溶于lOOmLO. 1 ~ 0. 2mol/mL磷酸氢二钠-柠檬酸緩沖溶液，用pH计调pH值为 5. 2，溶胀90min,将溶液置于三颈瓶中，边搅拌边水浴加热至降解温度为55 。C,加入普鲁兰酶的量为5000ASPU,降解时间为5h。反应终止后，将上述 水解液于等体积5°/ 三氯乙酸混合静止6小时，离心除去沉淀，并重复一次。 将上清液逐渐滴入到大量的95%食用酒精(水解液与95%食用酒精的体积 比为1:10)中沉淀，静置24小时，过滤，弃去上清液，滤饼用无水乙醇及 丙酮各洗涤一次，过滤后沉淀真空干燥，得低分子量胡,巴半乳甘露聚糖， 黏均分子量为47000。
尽管参照实施例对所公开的涉及双酶法制备低分子量胡，巴半乳甘露聚 糖的方法进行了特别描述，以上描述的实施例是说明性的而不是限制性的， 在不脱离本发明的精神和范围的情况下，所有的变化和修改都在本发明的范 围之内。
权利要求
1、一种双酶法制备低分子量胡芦巴半乳甘露聚糖的方法，其特征在于，包括下述步骤:步骤一:用缓冲溶液配制胡芦巴胶溶液，溶胀后加入纤维素酶，控制降解温度及时间进行降解。步骤二:终止降解后经乙醇沉淀，静置，过滤，得纤维素酶降解产物。步骤三:用缓冲溶液将步骤一降解产物配制成溶液，溶胀后加入普鲁兰酶，控制降解温度及时间进行降解。步骤四:终止降解后，进行脱蛋白处理。步骤五:经乙醇沉淀，静置，过滤，洗涤，真空干燥，得双酶降解产物胡芦巴半乳甘露聚糖，测定其黏均分子量。
2、 根据权利要求1所述的低分子量胡芦巴半乳甘露聚糖的制备方法，其特 征在于，所述緩冲溶液为乙酸-乙酸钠緩冲溶液，pH值为4.0-5.5，胡芦巴 胶溶液浓度为0. 5~1.5%，溶胀时间为10-120min。
3、 根据权利要求1所述的低分子量胡芦巴半乳甘露聚糖的制备方法，其特 征在于，所述加入纤维素酶的量为500 - 5000U (U为酶活力单位)，降解温 度为40 5(TC，降解时间为l 4h。
4、 根据权利要求1所述的低分子量胡，巴半乳甘露聚糖的制备方法，其特 征在于，所述醇沉所用浓度为95%的食用酒精，它与水解液的体积比为5 10:1，静置24h，过滤后，收集沉淀。
5、 根据权利要求1所述的低分子量胡芦巴半乳甘露聚糖的制备方法，其特 征在于，所述緩冲溶液为磷酸氢二钠-柠檬酸緩沖溶液，pH值为4. 0 ~ 6. 0, ;容液浓度为0. 5 ~ 1. 5%，溶月长时间为10~ 120min。
6、 根据权利要求1所述的低分子量胡芦巴半乳甘露聚糖的制备方法，其特 征在于，所述加入普鲁兰酶的量为1000 ~ 5000ASPU (ASPU为酶活力单位)， 降解温度为50~65°C，降解时间为l-8h。
7、 根据权利要求1所述的低分子量胡,巴半乳甘露聚糖的制备方法，其特 征在于，所述脱蛋白处理是指向水解液中加入等体积的1 ~ 8%三氯乙酸溶液, 室温静置4 ~ 12小时后过滤，之后所得上清液再按照上述方法处理一次。
8、根据权利要求1所述的低分子量胡，巴半乳甘露聚糖的制备方法， 其特征在于，所述要求与步骤四相同，收集过滤后的沉淀用无水乙醇、丙酮 洗涤过滤后，沉淀真空干燥，得到双酶法水解后的低分子量的胡芦巴半乳甘 露聚糖，产物翻均分子量根据特性黏度法推算，使用乌式黏度计(上海玻璃 仪器一厂)测定特性黏度，从而推算出翻均分子量。
全文摘要
本发明公开一种利用纤维素酶和普鲁兰酶制备低分子量胡芦巴半乳甘露聚糖的方法，其工艺流程为纤维素酶降解、醇沉、普鲁兰酶降解、脱蛋白、醇沉、过滤、洗涤、干燥。首先按纯化后的胡芦巴胶精粉∶纤维素酶为(0.5～1.5g)∶(500～5000U酶活单位)比例加入纤维素酶，酶解终止后用乙醇沉淀得降解产物；再按纤维素降解产物∶普鲁兰酶为(0.5～1.5g)∶(1000～5000ASPU酶活单位)比例加入普鲁兰酶，降解完毕后脱蛋白，用乙醇沉淀，过滤，洗涤、沉淀真空干燥，得粘均分子量为50000左右的低分子量胡芦巴半乳甘露聚糖。本发明与现有技术相比具有操作方便、成本低、反应过程容易控制的特点，而且所得低分子量的胡芦巴半乳甘露聚糖水溶性增强，在食品和医药工业具有广泛的应用前景。
文档编号C12P19/04GK101381749SQ20071005946
公开日2009年3月11日 申请日期2007年9月3日 优先权日2007年9月3日
发明者茜 孙, 张黎明, 王兆博, 王玲玲, 谢伟光 申请人:天津科技大学